蛋白制劑的制造方法
【專利摘要】本發明提供一種病毒去除蛋白質制劑的制造方法，其包括(a)使用小孔病毒去除膜過濾含病毒的蛋白質溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的過濾工序，過濾工序(a)包括(q)使用小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的過濾壓力過濾溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的低壓過濾工序，低壓過濾工序(q)中的過濾前溶液的pH(X)及鹽的離子強度(Y(mM))滿足以下的式1及式5：0≤Y≤150X-590(式1)和3.5≤X≤8.0(式5)或者滿足以下的式4及式5：Y=0(式4)和3.5≤X≤8.0(式5)。
【專利說明】蛋白制劑的制造方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及病毒去除蛋白質制劑的制造方法以及通過該制造方法制造的病毒去除蛋白質制劑。
【背景技術】
[0002]以生物技術藥物、血漿分級分離制劑等為代表的蛋白質制劑，擔心混入源自原料或源自工序的病毒。因此，制造這種蛋白質制劑時，制劑中的病毒的滅活、去除從制劑的安全性和穩定性的觀點考慮是非常重要的。作為病毒的滅活方法，進行加熱處理、利用化學藥品進行處理等，但是僅利用這些單獨的處理時，病毒的滅活不充分，另外，利用這些方法時，制劑中的蛋白質其本身也有可能變性。由于這種背景，作為不伴隨有化學變性的物理性病毒去除手段，通過使用病毒去除膜的過濾來實施病毒的分離去除(例如專利文獻I~3
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寸/ ο
[0003]作為病毒去除膜，已知由纖維素等天然原材料形成的膜，或者由聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)等合成高分子原材料形成的膜(非專利文獻I~4)。特別是蛋白質溶液中的蛋白質的分子小時，使用具有病毒不能透過而蛋白質分子能夠透過的尺寸的孔徑的過濾膜、即小孔病毒去除膜。
[0004]對于利用裝填有病毒去除膜的病毒去除裝置進行的含病毒的溶液的過濾而言，理想的是，可以在短時間內過濾更多量的蛋白質溶液、并且可以發揮充分高的病毒去除性能。為了短時間內處理更多量的蛋白質溶液，通常含病毒的溶液的過濾盡可能在高壓下進行。但是，若連續進行這種高`壓下的過濾，則有可能在膜的內部殘留應該含有在濾液中的蛋白質。另外，近年存在蛋白質的制劑濃度升高的傾向，隨之在用于去除病毒的過濾工序中，提高蛋白質濃度的要求也日益升高。用小孔病毒去除膜過濾高濃度的蛋白質溶液時，特別是由于蛋白質殘留于膜的內部所導致的堵塞的產生顯著。
[0005]為了回收殘留于小孔病毒去除膜的內部的蛋白質，將不含有蛋白質的緩沖液(通常與溶解蛋白質的緩沖液相同)作為洗滌液進行過濾。該工序由于為在過濾蛋白質之后追加進行的過濾，因此被稱為后洗漆(Post-wash)、后過濾(Post filtration)。后洗漆時,通常為了將過濾液的入口由蛋白質溶液的管路轉換為洗滌液的管路，暫時釋放過濾壓力。若不降低過濾壓力，則液體倒流到洗滌液側。
[0006]作為與后洗滌工序同樣地、利用病毒去除膜過濾時的過濾壓力降低的情況，還可列舉出由于停電等緣故而在過濾中途暫時中斷加壓的例子(被稱為起止(Stop & Start))。
[0007]另外，根據蛋白質制劑的種類，在制劑的制造中，有時希望用病毒去除膜過濾時的過濾壓力低。以低的過濾壓力進行過濾，大多在欲增加容易堵塞的溶液的最終處理量的情況，欲增加形狀細長的高分子蛋白質溶液的透過率、回收率的情況下實施。關于采用低的過濾壓力時的具體的過濾壓力，大多兼顧透過性和生產率來確定，也取決于所欲得到的蛋白質制劑的濃度等。例如專利文獻4采用0.15kgf/cm2程度的過濾壓力。
[0008]現有技術文獻[0009]專利文獻
[0010]專利文獻1:日本特開號公報
[0011]專利文獻2:日本特開號公報
[0012]專利文獻3:國際公開2010/109920號公報
[0013]專利文獻4:美國專利7932355號公報
[0014]非專利文獻
[0015]非專利文獻I =Manabe S, Dev.Biol.Stand.，(1996)88:81-90
[0016]非專利文獻2 =Brandwein H 等、Dev Biol (Basel).，(2000) 102:157-63
[0017]非專利文獻3:Aranha_Creado 等、Biologicals.，(1998) Jun; 26 (2): 167-72
[0018]非專利文獻4:L.Moce-Llivina 等、Journal of Virological Methods, (2003) April, Vol.109, Issuel, Pages99_101

【發明內容】

[0019]發明要解決的問題
[0020]迄今，對于使用了病毒去除膜的蛋白質溶液的過濾而言，為了增加處理量、提高效率，盡可能在高壓下進行的方 法令人注目，對于低的過濾壓力下的過濾，未得到充分的見解。
[0021]基于這種背景，本發明人等對于低過濾壓力下的使用了小孔病毒去除膜的蛋白質溶液的過濾獨自地進行了研究，結果令人驚訝地發現，在與高過濾壓力下同樣的溶液條件下實施低過濾壓力下的過濾時，根據溶液條件，病毒漏到濾液側，有可能得到病毒去除率低的蛋白質制劑。上述后洗滌工序、起止工序中，由于在低過濾壓力下進行過濾，根據溶液條件，也有可能產生病毒去除率的降低。
[0022]基于上述新的發現，本發明的目的在于，提供包括在低過濾壓力下使用小孔病毒去除膜過濾含病毒的蛋白質溶液的工序的、病毒去除率高的病毒去除蛋白質制劑的制造方法。
[0023]用于解決問題的方案
[0024]本發明人等為了解決上述問題而進行了深入地研究，結果發現，通過使供于過濾的溶液中的PH和鹽的離子強度的條件為特定的值，即使低過濾壓力下也能得到病毒去除率聞的蛋白質制劑，從而完成了本發明。
[0025]即，本發明涉及以下方案。
[0026][I] 一種病毒去除蛋白質制劑的制造方法，其包括以下的工序(a):
[0027](a)使用小孔病毒去除膜過濾含病毒的蛋白質溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的過濾工序，
[0028]過濾工序(a)包括以下的工序(q):
[0029](q)使用小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的過濾壓力過濾溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的低壓過濾工序，
[0030]低壓過濾工序(q)中的過濾前溶液的PH(X)及鹽的離子強度Y(mM)滿足以下的式I及式5:
[0031]O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 I)[0032]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)
[0033]或者滿足以下的式4及式5:
[0034]Y=O (式 4)
[0035]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
[0036][2]根據[I]所述的方法，其中，前述工序(q)中的過濾前溶液為含病毒的蛋白質溶液，
[0037]通過過濾工序(a)過濾的全部含病毒的蛋白質溶液的50%以上被低壓過濾工序(q)過濾。
[0038][3]根據[I]所述的方法，其中，過濾工序(a)為使用小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的過濾壓力過濾含病毒的蛋白質溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的工序，過濾工序(a)中的過濾前溶液的pH(X)及鹽的離子強度Y(mM)滿足以下的式I及式5:
[0039]O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 I)
[0040]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)
[0041]或者滿足以下的式4及式5:
[0042]Y=O (式 4)
[0043]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
[0044][4]根據[I]所述的方法，其中，過濾工序(a)包括在低壓過濾工序(q)之前進行的以下的工序(P):
[0045](P)使用小孔病毒去除膜，以超過0.30kgf/cm2的過濾壓力過濾含病毒的蛋白質溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的高壓過濾工序。
[0046][5]根據[4]所述的方法，其中，低壓過濾工序(q)中的過濾前溶液為洗滌用緩沖液。
[0047][6]根據[4]或[5]所述的方法，其中，低壓過濾工序(q)為后洗滌工序或起止工序。
[0048][7]根據[I]~[6]中任一項所述的方法，其中，低壓過濾工序(q)中的過濾溶液的PH⑴及鹽的離子強度Y(mM)滿足以下的式2及式5:
[0049]O ≤ Y ≤ 50X-200 (式 2)
[0050]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)
[0051]或者滿足以下的式4及式5:
[0052]Y=O (式 4)
[0053]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
[0054][8]根據[I]~[6]中任一項所述的方法，其中，低壓過濾工序(q)中的過濾前溶液的PH⑴及鹽的離子強度Y(mM)滿足以下的式3及式5:
[0055]O ≤ Y ≤ 50X-250 (式 3)
[0056]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)
[0057]或者滿足以下的式4及式5:
[0058]Y=O (式 4)
[0059]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。[0060][9]根據[I]~[8]中任一項所述的方法，其中，低壓過濾工序(q)為使用小孔病毒去除膜，以0.20kgf/cm2以下的過濾壓力過濾溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的工序。
[0061][10]根據[I]~[4]中任一項所述的方法，其中，根據過濾工序(a)前的含病毒的蛋白質溶液中的病毒濃度(Ctl)與過濾后的病毒去除蛋白質溶液中的病毒濃度(Cf)使用以下的式6算出的對數下降值LRV (Log Reduction Value)為4以上，
[0062]LRV=1g10 (C0/CF)(式 6)。
[0063][11]根據[5]或[6]所述的方法，其中，根據過濾工序(a)前的含病毒的蛋白質溶液中的病毒濃度(Ctl)與過濾后的病毒去除蛋白質溶液中的病毒濃度(Cf)使用以下的式6算出的對數下降值LRV(Log Reduction Value)為4以上，
[0064]LRV=1g10 (C0/CF)(式 6)
[0065]根據過濾工序(a)前的含病毒的蛋白質溶液中的病毒濃度(Ctl)與過濾工序(a)后的洗滌用緩沖液濾液中的病毒濃度(Cw)使用以下的式7算出的對數下降值LRV’為4以上，
[0066]LRVj =1g10 (C0/Cff)(式 7)。
[0067][12]根據[I]~[11]中任一項所述的方法，其中，小孔病毒去除膜的材質為纖維素或親水化的合成高分子。
[0068][13]根 據[I]~[12]中任一項所述的方法，其中，小孔病毒去除膜的材質為親水化的合成高分子，前述合成高分子選自由聚偏二氟乙烯、聚醚砜、聚砜和聚乙烯組成的組中。
[0069][14]根據[I]~[13]中任一項所述的方法，其中，小孔病毒去除膜的形狀為平膜或中空纖維膜。
[0070][15]根據[I]~[14]中任一項所述的方法，其中，含病毒的蛋白質溶液中的蛋白質濃度為lmg/mL~100mg/mL。
[0071][16]根據[I]~[15]中任一項所述的方法，其中，含病毒的蛋白質溶液包含選自由各種單克隆抗體、基因重組血液凝固因子、干擾素、各種激素、各種酶、免疫球蛋白、白蛋白、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、纖維蛋白原和抗凝血酶III組成的組中的一種以上的蛋白質。
[0072][17]根據[I]~[15]中任一項所述的方法，其中，含病毒的蛋白質溶液包含抗體作為蛋白質。
[0073][18]根據[I]~[15]中任一項所述的方法，其中，含病毒的蛋白質溶液包含血液凝固第VIII因子或纖維蛋白原作為蛋白質。
[0074][19]根據[I]~[18]中任一項所述的方法，其中，含病毒的蛋白質溶液含有選自由人細小病毒B19(B19)、小鼠微小病毒(MVM)、豬細小病毒(PPV)、牛細小病毒(BPV)、犬細小病毒(CPV)、脊髓灰質炎病毒(Polio)、圓環病毒、甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)組成的組中的一種以上的病毒。
[0075][20]根據[I]~[19]中任一項所述的方法，其中，含病毒的蛋白質溶液含有不具有包膜的直徑32nm以下的病毒。
[0076][21]根據[I]~[20]中任一項所述的方法，其中，含病毒的蛋白質溶液含有選自由無機鹽、緩沖液成分、表面活性劑和糖類組成的組中的一種以上的成分。[0077][22] 一種病毒去除蛋白質制劑的制造方法，其包括以下的工序(a):
[0078](a)使用小孔病毒去除膜過濾含病毒的蛋白質溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的過濾工序，
[0079]過濾工序(a)包括以下的工序(q):
[0080](q)使用小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的過濾壓力過濾溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的低壓過濾工序，
[0081]在低壓過濾工序(q)之前包括調整過濾前溶液的工序以使工序(q)中的過濾前溶液的PH⑴及鹽的離子強度Y(mM)滿足以下的式I及式5:
[0082]O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 I)
[0083]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)
[0084]或者滿足以下的式4及式5:
[0085]Y=O (式 4)
[0086]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
[0087][23] 一種病毒去除蛋白質制劑，其通過[I]~[22]中任一項所述的方法得到。
[0088]發明的效果
[0089]根據本發明，在包括在低過濾壓力下使用小孔病毒去除膜過濾含病毒的蛋白質溶液的工序的病毒去除蛋白質制劑的制造方法中，可以提供病毒去除率高的蛋白質制劑。因此，即使在例如以低過濾壓力連續地過濾含病毒的蛋白質溶液的情況、包括后洗滌工序的情況、或者包括起止工序的情況下，也可以提供病毒去除率高的蛋白質制劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0090]圖1為表示實施例2中未產生病毒的漏出的情況的過濾前溶液中的pH⑴與鹽的離子強度(Y(HiM))的關系的圖。由左側開始表示實施例2中確定的對應于式1、式2和式3的線。
【具體實施方式】
[0091]以下對用于實施本發明的方式(以下稱為“本實施方式”)進行詳細說明。需要說明的是，本發明不被以下的本實施方式限定，在其要旨的范圍內可以進行各種變形來實施。
[0092]本實施方式中的病毒去除蛋白質制劑的制造方法包括使用小孔病毒去除膜過濾含病毒的蛋白質溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的過濾工序(a)。
[0093]工序(a)中被過濾的“含病毒的蛋白質溶液”只要為含有用后述的小孔病毒過濾膜過濾時通過過濾膜的蛋白質、有可能含有病毒的溶液則沒有特別限制。特別是將源自包括人的動物的成分、基因等作為原料的溶液，由于含有病毒的可能性高，因此通過作為本實施方式的制造方法中的含病毒的蛋白質溶液使用，可以有效地提供病毒去除蛋白質制劑。
[0094]作為含病毒的蛋白質溶液，可列舉出例如作為生物技術藥物的原料的，利用遺傳工程學、細胞培養等生物技術生產的，含有肽、蛋白質作為有效成分的溶液。具體而言，可例示出含有各種單克隆抗體(IgG、IgM等)、基因重組血液凝固因子、干擾素、各種激素(生長激素、促紅細胞生成素等)、各種酶，以糖修飾蛋白質、PEG化蛋白質為代表的修飾蛋白質，人工蛋白質等的溶液等，但是不限于此。[0095]另外，作為含病毒的蛋白質溶液，還可列舉出例如由血漿精制得到的血漿分級分離制劑的原料。作為血漿分級分離制劑，可例示出免疫球蛋白制劑、白蛋白制劑、血液凝固因子制劑等，特別是作為血液凝固因子制劑，可例示出血液凝固第VIII因子制劑、血液凝固第IX因子制劑、纖維蛋白原制劑、抗凝血酶III制劑等。因此，作為含病毒的蛋白質溶液，具體而言，可例不出含有免疫球蛋白、白蛋白、血液凝固因子(血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、纖維蛋白原、抗凝血酶III等)等的溶液，但是不限于此。一方案中，本實施方式中的含病毒的蛋白質溶液有時優選含有抗體作為蛋白質。一方案中，本實施方式中的含病毒的蛋白質溶液有時優選含有血液凝固第VIII因子或纖維蛋白原作為蛋白質。
[0096]含病毒的蛋白質溶液中的蛋白質的濃度只要能夠通過小孔病毒去除膜過濾則沒有特別限定，例如為lmg/mL~100mg/mL,優選為lmg/mL~80mg/mL,更優選為lmg/mL~70mg/mL,進一步優選為lmg/mL~50mg/mL。存在蛋白質的濃度升高時利用病毒去除膜實現的過濾速度降低的傾向。
[0097]對含病毒的蛋白質溶液所含的病毒沒有特別限定，可列舉出人細小病毒B19(B19)、小鼠微小病毒(MVM)、豬細小病毒(PPV)、牛細小病毒(BPV)、犬細小病毒(CPV)、脊髓灰質炎病毒(Polio)、圓環病毒、甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)等，優選選自由人細小病毒B19(B19)、小鼠微小病毒(MVM)、豬細小病毒(PPV)、牛細小病毒(BPV)、犬細小病毒(CPV)、脊髓灰質炎病毒(Polio)和甲型肝炎病毒(HAV)組成的組中。
[0098]上述病毒中、特別是細小病毒，在血漿分級分離制劑領域中，被報告有由于人細小病毒B19(B19)所導致的感染的事例，EMEA(歐洲藥品評價局)作出了關于源自血漿的制劑的病毒安全性的報告。進而，在生物技術藥物領域中，存在由于小鼠細小病毒對CHO細胞(源自小鼠)的混入所導致的對制造工藝中的單克隆抗體的污染的實例，FDA(美國食品藥品監督管理局)作出了關于使用動物細胞制作的生物技術藥物的病毒安全性評價的指南(ICH Q5A)。
[0099]細小病毒屬于細小病毒科，是現在公知的最小病毒(直徑18~24nm)。可列舉出人細小病毒B19(B19)、小鼠細小病毒(MVM)、豬細小病毒(PPV)、犬細小病毒(CPV)、牛細小病毒(BPV)等。
[0100]細小病毒由于不具有包膜，因此物理化學上穩定，對于生物學制劑的制造工藝中的滅活工序中通常進行的加熱、低pH、化學藥品處理具有耐性，作為作用機理與滅活法不同的病毒去除方法，利用病毒去除膜進行細小病毒去除的需求升高。一方案中，本實施方式提供細小病毒去除蛋白質制劑的制造方法。
[0101]另外，作為細小病毒以外的不具有包膜的小病毒，可列舉出圓環病毒(17~22nm)、小核糖核酸病毒科(family Picornaviridae)的甲型肝炎病毒(27~30nm)、脊髓灰質炎病毒(30nm)、戍型肝炎病毒(32nm)等,一方案中,本實施方式提供以不具有包膜的病毒(優選直徑32nm以下、更優選直徑30nm以下、進一步優選直徑24nm以下的病毒)作為對象的病毒去除蛋白質制劑的制造方法。
[0102]含病毒的蛋白質溶液，除了上述蛋白質和病毒之外，還可以含有選自由堿性氨基酸、無機鹽、緩沖液成分、表面活性劑和糖類組成的組中的一種以上成分。
[0103]作為堿性氨基酸，可列舉出精氨酸、組氨酸、胍、賴氨酸或它們的衍生物、或者它們的鹽，優選為精氨酸、組氨酸、賴氨酸或它們的衍生物、或者它們的鹽，更優選為精氨酸或其衍生物、或它們的鹽。
[0104]作為無機鹽，可以含有NaCl、緩沖鹽。作為緩沖液成分，可以使用醋酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液等。無機鹽和緩沖液成分的濃度可以參照以下具體說明的鹽的離子強度來確定。
[0105]作為表面活性劑,可例示出作為非離子性表面活性劑的Tween20、Tween80等，可以以0.01~0.05wt%的濃度含有。
[0106]作為糖類，為單糖、二糖、三糖、低聚糖、糖醇等，沒有特別限定，具體而言，可以以I~10wt%、優選I~5wt%含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、山梨糖、麥芽糖、蔗糖(sucrose)、山梨糖醇、甘露糖醇、葡聚糖等中的一種或多種的組合。
[0107]過濾前的含病毒的蛋白質溶液的溫度只要處于不會影響到所得到的蛋白質制劑的狀態的溫度范圍內即可，但是從防止蛋白質的變性的觀點考慮，優選處于4°C~40°C的范圍內，更優選處于4°C~35 °C的范圍內。溫度影響到蛋白質溶液的粘度、影響到病毒去除膜過濾時的通量(Flux)，因此雖然取決于蛋白質自身對于溫度的穩定性，但是進一步優選處于20°C~35°C的范圍內。
[0108]本實施方式中，病毒去除中使用的“小孔病毒去除膜”被非內服藥物協會(PDA、Parenteral Drug Association)定義，指的是基于 PDA 的 Technical report41 (2008 年修訂、Appendixl)中記載的手法測定時具有30~33nm粒徑的卩遼菌體PP7 (Pseudomonasphage7)的去除率大于41og1(l的膜。
[0109]作為PDA作出的小孔 病毒去除膜的另外的定義，可列舉出使用靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)水溶液或含IVIG的緩沖液，使用與上述噬菌體PP7相同的手法進行試驗時，蛋白質的透過率或回收率大于90%的膜。蛋白質的透過率以膜過濾后的溶液的蛋白質濃度與過濾前溶液的蛋白質濃度的比例表示，在將充分體積的溶液進行膜過濾直至膜過濾后的溶液的蛋白質濃度穩定為止后測定。蛋白質濃度的測定可以使用UV光譜測定(A.)。
[0110]對于小孔病毒去除膜而言，優選在各病毒去除膜的推薦壓力下，對于細小病毒的去除性能，使用后述的式6算出的LRV為4以上。
[0111]小孔病毒去除膜的材質優選為纖維素或親水化的合成高分子。作為纖維素，可以使用再生纖維素、天然纖維素、醋酸纖維素等。作為親水化的高分子，可以使用親水化聚偏二氟乙烯(PVDF)、親水化聚醚砜(PES)、親水化聚乙烯(PE)、親水化聚砜(PS)等。作為親水化方法，可列舉出通過涂覆、接枝反應、交聯反應等方法，向膜表面導入親水性官能團的方法，固定親水性聚合物的方法等。
[0112]膜的形狀可以為平膜和中空纖維膜中的任意一種，但是由于即使膜面積大、也可以使得將膜裝填于容器制成的過濾器小型，因此優選為中空纖維膜。可以制成通過膜隔開為過濾液入口側的一次側空間和過濾液出口側的二次側空間的過濾器。將病毒去除膜用于過濾時，可以以過濾器的形態使用。
[0113]作為以細小病毒等小病毒的去除作為對象的市售的小孔病毒去除膜，可列舉出纖維素制的 Planova (注冊商標)15N(Asahi Kasei Medical C0.，Ltd 制)及 Planova (注冊商標)20N(Asahi Kasei Medical C0.，Ltd 制)、親水化 PVDF 制的 Planova (注冊商標)BioEX (Asahi Kasei Medical C0.，Ltd 制)、Ultipore (注冊商標)VF DV20 (Pali 公司制)及 Viresolve NFP (Millipore 公司制)、親水化 PES 制的 Virosart CPV(Sartorius 公司制)、Viresolve Pro (Mi l lipore公司制)等。可以根據欲去除的病毒、欲制造的蛋白質制劑的種類適當選擇病毒去除膜。
[0114]使用小孔病毒去除膜的含病毒的蛋白質溶液的過濾可以使用各小孔病毒去除膜的通常的使用方法進行。從回收率高的觀點考慮，過濾優選為死端式過濾。可以使用過濾壓力恒定的定壓過濾、過濾壓力變動的過濾、過濾速度恒定的定速過濾等任意一種過濾方法。根據過濾前溶液的組成，采用優選的過濾方法。
[0115]工序(a)中的過濾壓力雖然取決于小孔病毒去除膜的材質，但是在膜的耐壓以下的范圍內進行。例如由纖維素形成的小孔病毒去除膜的情況下，0.00kgf/cm2(0.0kPa)~1.00kgf/cm2(9.8X10kPa)的范圍是最合適的。由親水化PVDF、親水化PES或親水化PS形成的小孔病毒去除膜的情況下，0.00kgf/cm2(0.0kPa)~5.00kgf/cm2(4.9X 102kPa)的范圍是最合適的。
[0116]本實施方式的制造方法中，工序(q)是使用上述小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的過濾壓力過濾溶液、得到病毒去除蛋白質溶液的低壓過濾工序，是上述工序(a)所包括的工序。即，工序(q)指的是上述工序(a)中、以0.30kgf/cm2以下的過濾壓力進行過濾的工序。
[0117]通常，使用病毒去除膜的含病毒的溶液的過濾盡可能以高過濾壓力進行以可以短時間內處理更多量的蛋白質溶液。但是，本發明人等發現在使用上述小孔病毒去除膜、以低過濾壓力過濾含病毒的溶液的低壓過濾工序中，病毒有可能漏出到濾液中，未被去除。而本發明人等發現，在該低壓過濾工序中，通過進行調整以使過濾前溶液的PH(X)和鹽的離子強度(Y (mM))滿足以下的式I及式5、或者式4及式5，病毒不會漏出到濾液中，能得到病毒被去除的濾液。
[0118]本實施方式中，過濾壓力可以簡便地使用裝填有上述小孔病毒去除膜的病毒去除裝置所具備的壓力計進行測定。也可以在供給液容器側設置壓力計來進行測定。過濾壓力為0.30kgf/cm2以下(例如如后述的實施例所述那樣，0.20kgf/cm2附近)時，根據過濾前溶液的組成，病毒漏出到濾液中。雖然并非被理論束縛，但是作為其理由，認為在于，隨著過濾壓力降低，將病毒拘束于小孔病毒去除膜的拘束力減弱、病毒的自由度升高而漏出到濾液側，特別是過濾壓力為0.30kgf/cm2以下時，該現象更明顯。
[0119]但是，低壓過濾工序中，過濾前溶液的pH(X)和鹽的離子強度(Y(mM))滿足以下的式I及式5:
[0120]O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 1)
[0121]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)
[0122]或者滿足以下的式4及式5:
[0123]Y=O (式 4)
[0124]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)
[0125]時，可以得到病毒被去除的濾液。
[0126]根據欲得到的蛋白質制劑中的病毒去除率，有時更優選低壓過濾工序中的過濾前溶液的PH(X)和鹽的離子強度(Y(mM))進一步滿足以下的式2及式5:
[0127]O ≤ Y ≤ 50X-200 (式 2)
[0128]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)[0129]或者滿足以下的式4及式5:
[0130]Y=O (式 4)
[0131]3.5 ^ X ^ 8.0 (式5)，進而，有時特別優選滿足以下的式3及式5:
[0132]O ≤ Y ≤ 50X-250 (式 3)
[0133]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)
[0134]或者滿足以下的式4及式5:
[0135]Y=O (式 4)
[0136]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)。
[0137]如后述的實施例所述，本發明人等確認，過濾壓力為0.30kgf/cm2以下、例如0.20kgf/cm2 附近(例如 0.1Okgf/cm2 ~0.30kgf/cm2、進而例不 0.15kgf/cm2 ~0.25kgf/cm2)，過濾前溶液的pH(X)和鹽的離子強度(Y(mM))滿足上述式I時，過濾后的病毒的去除率高。
[0138]過濾后的病毒的去除率可以使用對數下降值(LRV、Log Reduction Value)表示。對數下降值LRV根據過濾前溶液中的病毒濃度(Ctl)與過濾后溶液中的病毒濃度(Cf)使用以下的式6算出，LRV值越小則病毒去除率越低。
[0139]LRV=1g10 (C0/CF)(式 6)
[0140]算出LRV時的病毒濃度可以以傳染性滴度、病毒核酸的拷貝數等表示。作為傳染性滴度的測定方法，可列舉出TCID50法、蝕斑技術等。病毒的核酸的拷貝數可以使用PCR法等測定。
[0141]通常，病毒去除膜的性能評價中，若LRV為4以上，則通過膜過濾病毒被充分去除，若LRV為5以上，則病毒被去除至10的5次方分之I以下，若LRV為6以上，則病毒被去除至10的6次方分之I以下，幾乎沒有病毒的漏出。
[0142]本實施方式中，根據過濾工序(a)前的含病毒的蛋白質溶液中的病毒濃度(Ctl)與過濾后的病毒去除蛋白質溶液中的病毒濃度(Cf)使用上述式6算出的LRV優選為4以上，更優選為5以上，進一步優選為6以上。還優選病毒濃度(Cf)為檢測限以下。
[0143]由后述的實施例的結果可知，在低壓過濾工序中，隨著過濾前溶液的pH降低，病毒向濾液中的漏出增加，LRV降低。該現象在過濾前溶液的鹽的離子強度高時更顯著，過濾前溶液的PH低、鹽的離子強度高時，病毒向濾液中的漏出最多。
[0144]如后述的實施例所示，過濾前溶液的pH(X)和鹽的離子強度(Y(mM))滿足上述式I及式5、或者式4及式5中的任意一種組合時，可以以LRV4以上的病毒去除率進行低壓過濾工序，而另一方面，上述式I及式5、或者式4及式5的組合都不滿足時，病毒去除濾率降低，病毒漏出到濾液中。進而，X和Y滿足上述式2及式5、或者式4及式5中的任意一種組合時，可以以LRV5以上的病毒去除率進行低壓過濾工序，X和Y滿足上述式3及式5、或者式4及式5中的任意一種組合時，可以以濾液中的病毒濃度為檢測限以下的進一步高的病毒去除率進行低壓過濾工序。因此，通過進行調整以使過濾前溶液的PH(X)和鹽的離子強度(Y(mM))滿足上述式的組合，即使是低過濾壓力，病毒也不會漏出到濾液側，可以得到病毒被去除的溶液。
[0145]低壓過濾工序中，過濾前溶液的PH(X)優選為3.5以上且8.0以下，更優選為4.0以上且8.0以下。pH不足3.5以及超過8.0時，有可能產生蛋白質的變性、分解。[0146]過濾前溶液的鹽的離子強度(Y(mM))，是對于源自溶液中離解的鹽的全部離子種類，將各離子的摩爾濃度(Ci)與離子的電荷數(Zi)的二次方之乘積相加、進而乘以1/2得到的值，以下述式8表示。
[0147]Υ=1/2Σ (CiXZi2) (式 8)
[0148]作為源自鹽的離子種類的例子，可列舉出源自無機鹽的離子、源自構成緩沖液成分的鹽的離子。溶液不含有緩沖液成分、僅含有無機鹽時，鹽的離子強度可以僅由無機鹽的離子強度算出。另外，無機鹽為NaCl時，鹽的離子強度與NaCl的鹽濃度相同。
[0149]通常，對于含有緩沖液成分的溶液而言，緩沖液成分具有pH調整的作用，鹽的離子強度的調整大多通過加入無機鹽(例如NaCl)進行。
[0150]低壓過濾工序中，作為不會帶來蛋白質變性、聚集體形成這種影響的范圍，過濾前溶液的鹽的離子強度(Y(禮))期望為500mM以下。優選為300mM以下，更優選為150mM以下。
[0151]本實施方式的一方案中，過濾前溶液的pH(X)和鹽的離子強度(Y(mM))處于以下的范圍內時，也可以以高病毒去除率進行低壓過濾工序。
[0152]為3.5≤X<4并且Y=O的情況；
[0153]4 ≤ X<4.6并且O≤Y≤50、優選O≤Y≤10、更優選Y=O的情況；
[0154]4.6 ≤ X<5并且O≤Y≤100、優選O≤Y≤50、更優選O≤Y≤10、進一步優選Y=O的情況；
[0155]5 ≤ X<6并且O≤Y≤150、優選O≤Y≤100、更優選O≤Y≤50、進一步優選Y=O的情況；以及
[0156]6≤X≤8并且O≤Y≤300、優選O≤Y≤150、更優選O≤Y≤100的情況。
[0157]過濾前溶液的pH調整，可以通過醋酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液等緩沖液成分的選擇及增減、NaOH等堿的添加、HCl等酸的添加進行。過濾前溶液的鹽的離子強度的調整可以通過NaCl、緩沖鹽等鹽的增減進行。另外，過濾前溶液的PH以及鹽的離子強度的測定也可以用本領域技術人員公知的手法進行。
[0158]作為工序(q)中過濾的過濾前溶液，只要過濾前溶液的PH(X)和鹽的離子強度(Y(mM))滿足上述式I及式5、或者式4及式5則沒有特別限定，除了上述含病毒的蛋白質溶液之外，還可列舉出緩沖液(例如后述的洗滌用緩沖液)、水等。對緩沖液的組成也沒有特別限定，除了上述緩沖液成分之外，還可以含有上述堿性氨基酸、無機鹽、表面活性劑、糖類等。優選含有與工序(a)中的含病毒的蛋白質溶液重復的成分。
[0159]本實施方式的一方案中，工序(q)中的過濾前溶液為含病毒的蛋白質溶液，通過過濾工序(a)過濾的全部含病毒的蛋白質溶液的50%以上被低壓過濾工序(q)過濾。
[0160]通常，使用小孔病毒過濾膜的含病毒的蛋白質溶液的過濾盡可能以高過濾壓力進行以提高處理效率，但是也有優選以低過濾壓力進行過濾的蛋白質。作為這種蛋白質的一例，可列舉出抗體。作為抗體，可列舉出單克隆抗體、多克隆抗體。含有這種蛋白質的情況下，優選的是，通過過濾工序(a)過濾的全部含病毒的蛋白質溶液的50%以上、優選75%以上、更優選90%以上、進一步優選95%以上被低壓過濾工序(q)過濾。
[0161]本實施方式的一方案中，通過過濾工序(a)過濾的全部含病毒的蛋白質溶液全部被低壓過濾工序(q)過濾時，過濾工序(a)為使用小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下過濾壓力過濾含病毒的蛋白質溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的工序，過濾工序(a)中的過濾前溶液的PH(X)和鹽的離子強度(Y(mM))滿足以下的式I及式5:
[0162]O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 1)
[0163]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)
[0164]或者滿足以下的式4及式5:
[0165]Y=O (式 4)
[0166]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)
[0167]關于此時的過濾壓力、式1、式4以及式5，如對于工序(q)記載所述。另外，適于這種過濾的含病毒的蛋白質溶液為單克隆抗體溶液。
[0168]本實施方式的一方案中，過濾工序(a)包括在上述低壓過濾工序(q)之前進行的以下的工序(P):
[0169](P)使用小孔病毒去除膜，以超過0.30kgf/cm2的過濾壓力過濾含病毒的蛋白質溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的高壓過濾工序。
[0170]工序(P)與工序(q)同樣地是上述工序(a)所包括的工序，指的是工序(a)中以高于0.30kgf/cm2的過濾壓力進行過濾的工序。
[0171]工序(P)中的小孔病毒去除膜、含病毒的蛋白質溶液以及過濾方法如對于上述工序(a)說明所述。
[0172]工序(P)中的過濾壓力雖然取決于小孔病毒去除膜的材質，但是只要高于0.30kgf/cm2、并且處于膜的耐壓以下的范圍內則沒有特別限定。例如由纖維素形成的小孔病毒去除膜的情況下，0.50kgf/cm2 (4.9 X IOkPa)~1.00kgf/cm2 (9.8 X IOkPa)的范圍是最合適的。由親水化PVDF、親水化PES或親水化PS形成的小孔病毒去除膜的情況下，1.0Okgf/cm2 (9.8 X IOkPa)~5.00kgf/cm2 (4.9 X 102kPa)的范圍是最合適的。
[0173]進行使用小孔病毒過濾膜的含病毒的蛋白質溶液的連續過濾(盡可能以高過濾壓力進行以提高處理效率)時，隨著過濾量增加而蛋白質顆粒殘留于膜的內部(與濾液相反一側)，有可能產生堵塞。因此，有時進行通過過濾不含有蛋白質的溶液(洗滌液)來將膜內部的蛋白質洗出到濾液側的被稱為后洗滌工序的作業。本實施方式中，后洗滌工序指的是為了回收殘留于小孔病毒去除膜的內部的蛋白質，而在蛋白質過濾后追加進行的過濾。進行后洗漆工序時，為了過濾洗漆液來替代含蛋白質的溶液，轉換導入過濾前溶液的管路。該轉換時，若過濾壓力仍然高則溶液倒流到洗滌液側，因此暫時釋放過濾壓力、達到0.0kPa0轉換管路后，再次施加過濾壓力過濾洗滌液。對于直至壓力為零后、再次施加過濾壓力開始洗滌液的過濾為止的時間沒有特別限定。充分產生壓力降低的是例如5秒以上，I分鐘以上、5分鐘以上、30分鐘以上時更充分地產生壓力降低。另外，從作業性的觀點考慮，例如大多在7天以內、5天以內、3天以內、或24小時以內開始。轉換管路時，過濾壓力暫時降低，因此根據過濾前溶液的組成，病毒會漏出到濾液側。該病毒的漏出可以如上所述通過工序(q)防止。
[0174]即，本實施方式的一方案中，在進行上述工序(P)的過程中，殘留于膜的內部的蛋白質顆粒通過包括低壓過濾工序(q)的后洗滌工序洗滌。低壓過濾工序(q)為后洗滌工序(的一部分)時，工序(q)中的過濾前溶液優選為不含有蛋白質的洗滌液。對洗滌液的組成沒有特別限定，優選含有與工序(a)或(P)中的含病毒的蛋白質溶液重復的成分，更優選為洗滌用緩沖液。洗滌用緩沖液指的是制造工序(a)中的含病毒的蛋白質溶液時溶解蛋白質的緩沖液。后洗滌工序根據需要可以進行多次。
[0175]需要說明的是，工序(a)包括后洗滌工序時，根據過濾工序(a)前的含病毒的蛋白質溶液中的病毒濃度(Ctl)與過濾后的病毒去除蛋白質溶液中的病毒濃度(Cf)使用上述式6算出的LRV為4以上(優選為5以上)，根據過濾工序(a)前的含病毒的蛋白質溶液中的病毒濃度(Ctl)與過濾工序(a)后的洗滌用緩沖液濾液中的病毒濃度(Cw)使用以下的式7算出的LRV’優選為4以上(優選為5以上)。
[0176]LRVj =1g10 (C0/Cff)(式 7) [0177]病毒濃度可以使用對于式6的上述手法測定。
[0178]需要說明的是，上述式7中，過濾工序(a)后的洗滌用緩沖液濾液中的病毒濃度(Cw)指的是僅后洗滌工序中過濾的洗滌用緩沖液的濾液的病毒濃度。在小孔病毒過濾膜內部殘留源自在后洗滌工序前過濾的含病毒的蛋白質溶液的病毒，在包括低過濾壓力下的過濾的后洗滌工序中，根據過濾前溶液的PH和鹽的離子強度，病毒有可能漏出到洗滌用緩沖液濾液中。通過進行調整以使過濾前溶液的PH(X)和鹽的離子強度(Y(mM))滿足上述式I及式5、或者式4及式5，在后洗滌工序中也可以防止病毒的漏出。
[0179]另外，作為與后洗滌工序同樣地，在用病毒去除膜過濾時的過濾壓力降低的情況，可列舉出包括過濾中途暫時中斷加壓、然后恢復加壓的事例的工序(起止工序)。作為例子，可以考慮以下事態:使用小孔病毒過濾膜的含病毒的蛋白質溶液的過濾時，由于電源脫落等緣故而未施加過濾壓力，然后再次接通電源，由此施加過濾壓力。對于壓力為零后、直至再次施加過濾壓力開始洗滌液的過濾為止的時間沒有特別限定。充分產生壓力降低的是例如5秒以上，I分鐘以上、5分鐘以上、30分鐘以上時更充分地產生壓力降低。另外，從作業性的觀點考慮，例如大多在7天以內、5天以內、3天以內、或24小時以內開始。這種情況下，由于過濾壓力暫時降低，根據過濾前溶液的組成，病毒有可能漏出到濾液側。該病毒的漏出可以如上所述通過工序(q)防止。
[0180]即，本實施方式的一方案中，進行上述工序(P)、過濾壓力降低時，進行過濾前溶液的pH(X)和鹽的離子強度(Y(mM))處于規定范圍內的低壓過濾工序(q)，由此可以切實地得到病毒去除蛋白質溶液。
[0181]本實施方式的一方案中，過濾工序(a)包括在上述低壓過濾工序(q)之前進行的工序(P)時，可以包括工序(q)中的過濾壓力大致為0.0kPa的情況。例如上述后洗滌工序中、轉換導入過濾前溶液的管路的情況，起止工序中電源脫落的情況，過濾壓力有可能大致為0.0kPa。此時，對于再加壓的方法而言，可以封閉小孔病毒去除膜與過濾前溶液供給容器之間后，將供給容器側的壓力設定為對于工序(a)記載的最合適的過濾壓力后，打開小孔病毒去除膜與過濾前溶液供給容器之間，以恒壓過濾，也可以打開小孔病毒去除膜與過濾前溶液供給容器之間，緩慢地升高至規定壓力并進行過濾。例如若將過濾壓力為0.0kPa的放置時間(進行低過濾壓力下的過濾的時間)為3小時、然后再加壓進行過濾時的病毒去除率作為基準，則預想短于3小時的放置時間的病毒去除率高于3小時的情況。
[0182]本實施方式的病毒去除蛋白質制劑的制造方法中，在工序(a)之前，也可以用由孔徑大于小孔病毒去除膜的孔徑尺寸的膜形成的過濾器進行預備過濾。在此，作為大孔徑的過濾器，可以使用Planova (注冊商標)35N、Planova (注冊商標)75N(以上Asahi KaseiMedical C0.，Ltd制)、0.1 ii m過濾器、0.2 ii m過濾器等。也可以不進行預備過濾,直接使
用小孔病毒去除膜進行工序(a)。
[0183]在工序(a)之前，可以進行色譜處理、S/D處理、濃縮處理、和濃縮/緩沖液交換處理中的任意一種以上。
[0184]作為色譜處理，可例示出離子交換樹脂、凝膠過濾樹脂裝入柱子而成的柱色譜、對多孔膜表面賦予了離子交換基團的膜色譜。作為色譜的分離模式，可列舉出凝膠過濾色譜、離子交換色譜(陽離子交換:CEX、陰離子交換:AEX)、疏水色譜(HIC)、親和色譜、金屬螯合親和色譜、羥基磷灰石色譜等。作為色譜的配體，可以使用離子交換和疏水相互作用復合而成的色譜。
[0185]關于S/D處理，可以根據公知的方法，通過使用磷酸三正丁酯(TNBP、tr1-n-butylphosphate)等作為有機溶劑，使用TweenSO等作為表面活性劑，將病毒滅活來進行。
[0186]關于濃縮處理，可以根據公知的方法，通過使用超濾(UF)膜的方法進行。可以通過離心濃縮進行。
[0187]緩沖液交換處理也可以根據公知的方法，使用超濾膜與濃縮同時進行。也可以通過凝膠過濾法進行。還可以通過使用透析膜的透析法進行。
[0188]在工序(a)之后，對于所得到的病毒去除蛋白質溶液，可以利用色譜處理進行精制處理。另外，也可以通過UF處理進一步高濃度化。對于工序(a)中得到的病毒去除蛋白質溶液、其精制物或濃縮物，可以以原來的液體組成最終制劑化。另外，也可以添加糖類、表面活性劑等，最終制劑化。還可以與其它組成的溶劑進行緩沖液交換。另外，還可以進一步進行冷凍干燥處理。
[0189]本實施方式的一方案中，涉及一種病毒去除蛋白質制劑的制造方法，其包括以下的工序(a):
[0190](a)使用小孔病毒去除膜過濾含病毒的蛋白質溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的過濾工序，
[0191]過濾工序(a)包括以下的工序(q):
[0192](q)使用小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的過濾壓力過濾溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的低壓過濾工序，
[0193]在低壓過濾工序(q)之前包括調整過濾前溶液的工序以使工序(q)中的過濾前溶液的PH⑴及鹽的離子強度Y(mM)滿足以下的式I及式5:
[0194]0 ≤ Y ≤ 150X-590 (式 I)
[0195]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)
[0196]或者滿足以下的式4及式5:
[0197]Y=O (式 4)
[0198]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)。
[0199]本實施方式還涉及由上述制造方法得到的病毒去除蛋白質制劑。另外，本實施方式還涉及含病毒的蛋白質溶液中的病毒去除方法，其特征在于，其進行上述工序(a)(包括工序(q))。
[0200]實施例
[0201]以下基于實施例對本發明進行說明，但是本發明的范圍并不限于以下的實施例來解釋。
[0202]以下所示的實施例中，作為小孔病毒去除膜，使用由纖維素中空纖維膜形成的Planova (注冊商標)20N (Asahi Kasei Medical C0.，Ltd 制)。pH 使用 pH 計測定。鹽的離子強度由制造各溶液時使用的鹽的量(鹽濃度)算出。
[0203](i)蛋白質溶液的制造
[0204]使用多克隆抗體(人IgG) (Venoglobulin-1H>benesis corporation 制),用注射用水(大塚制藥)稀釋以使抗體濃度為10mg/mL。另外，使用IM NaCl水溶液制造以達到以下的各實施例所示的鹽的離子強度。進而，PH使用0.1M HCl或0.1M NaOH，調整成以下的各實施例所示的pH。
[0205](ii)病毒去除率(LRV)的測定
[0206]用含有牛血清(Upstate公司制、56°C的水浴中加熱30分鐘滅活后使用)3體積％和青霉素/鏈霉素(+10000單位(Units)/mL青霉素(Penicillin)、+10000 u g/mL鏈霉素(Streptomycin) > Invitrogen Corporation 制)I 體積％ 的 D_MEM(Invitrogen Corporation制、高葡萄糖(high-glucose))(該混合液以后記載為“3%FBS/D-MEM”)，將培養的PK-13細胞(由ATCC獲得、ATCCN0.CRL-6489)稀釋，制造細胞濃度2.0 X IO5 (cells/mL)的稀釋懸浮液。準備10塊96孔(well)圓底細胞培養板(Falcon公司制)，將該細胞懸浮液向全部孔中各分注IOO(UL)0
[0207]接著，對于下述各實施例中進行了過濾的濾液，制造它們的利用3%FBS/D_MEM的10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍及IO5倍稀釋液，進而，對于即將過濾之前采集的各原液(含病毒的蛋白質溶液)，制造它們的利用3%FBS/D-MEM的IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍及IO7倍稀釋液。向分注有上述細胞懸浮液的96孔細胞培養板，將各濾液及濾液的10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍及IO5倍稀釋液`，和原液的IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍及IO7倍稀釋液，分別向8孔中各分注100 (uL), 37°C、5% 二氧化碳氣氛下，培養箱中培養10天。
[0208]接著，對于培養了 10天的上述細胞培養板，利用紅血球吸附法(參照病毒實驗學(々^ 7実験學)總論國立預防衛生研究所學友會編、P.173)進行TCID50(50%傳染性滴度)的測定。將雞保存血(Nippon Biotest Laboratories inc.制)用PBS(-)(日水制藥株式會社制、用制品隨附的說明書中記載的方法制造)稀釋到5倍后，以2500 (rpm)、4°C離心分離5分鐘，使紅血球沉淀后，吸引去除上清液，將所得到的含紅血球的沉淀物再次用上述PBS(-)稀釋到 200倍。
[0209]接著，將所制造的紅血球沉淀物的PBS(-)稀釋液向上述細胞培養板的全部孔中各分注100(i! L)，靜置2小時后，肉眼確認紅血球對于所培養的細胞組織的表面的吸附的有無，將確認到吸附的情況作為產生了病毒感染的孔進行計數，將未確認吸附的情況作為沒有感染的孔進行計數。關于各所得到的培養液的病毒感染的有無，對于濾液或其各稀釋液、或者原液的各稀釋液，確認比例，通過Reed-Muench法(參照病毒實驗學(々4 ^実験學)總論國立預防衛生研究所學友會編、P.479-480)，作為傳染性滴度，算出log(TCID5Q/mL)，使用以下的式算出病毒去除率LRV。
[0210]LRV=1g10 (C0/CF)
[0211]在此，Ctl=用小孔病毒去除膜過濾前的原液(含病毒的蛋白質溶液)中的傳染性滴度、[0212]Cf=用小孔病毒去除膜過濾后的溶液中的傳染性滴度。
[0213](實施例1:不同過濾壓力下使用病毒去除膜的過濾)
[0214]用上述(i)中記載的方法制造pH4、4.6、5、6、7或8、鹽的離子強度全部為IOOmM的各蛋白質溶液(多克隆抗體溶液)(實驗例I~16)。然后分別添加0.5vol%的PPV (豬細小病毒、社團法人動物用生物學的制劑協會、以下對于實施例2~4也同樣)，充分攪拌，得到含病毒的蛋白質溶液。
[0215]對于所得到的各溶液，使用膜面積0.001m2的小孔病毒去除膜(Planova(注冊商標)20N)，以0.10,0.20,0.50或0.80kgf/cm2的過濾壓力進行死端式過濾直至過濾量達到50L/m2。對于過濾壓力，在供給液容器側設置壓力計來測定。用上述(ii)中記載的方法測定50L/m2池(pool)下的PPV的去除率。
[0216]各過濾壓力和pH與病毒去除率(LRV)的關系如以下的表1所示。如表1所示可知，過濾壓力高時，即使PH變化也能維持高的病毒去除率，但是過濾壓力低時，隨著過濾前的含病毒的蛋白質溶液的pH降低，病毒去除率降低，病毒漏出。
[0217][表1]
【權利要求】
1.一種病毒去除蛋白質制劑的制造方法，其包括以下的工序(a): (a)使用小孔病毒去除膜過濾含病毒的蛋白質溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的過濾工序， 過濾工序(a)包括以下的工序(q): (q)使用所述小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的過濾壓力過濾溶液，從而得到所述病毒去除蛋白質溶液的低壓過濾工序， 低壓過濾工序(q)中的所述過濾前溶液的PH(X)及鹽的離子強度Y(mM)滿足以下的式I及式5: . O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 I)
.3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5) 或者滿足以下的式4及式5: Y=O (式 4) . 3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述工序(q)中的所述過濾前溶液為所述含病毒的蛋白質溶液， 通過過濾工序(a)過濾的全部含病毒的蛋白質溶液的50%以上被低壓過濾工序(q)過濾。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，過濾工序(a)為使用所述小孔病毒去除膜，以.0.30kgf/cm2以下的過濾壓力過濾所述含病毒的蛋白質溶液，從而得到所述病毒去除蛋白質溶液的工序，過濾工序(a)中的所述過濾前溶液的PH(X)及鹽的離子強度Y(mM)滿足以下的式I及式5: . O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 I) . 3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5) 或者滿足以下的式4及式5: Y=O (式 4) . 3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，過濾工序(a)包括在低壓過濾工序(q)之前進行的以下的工序(P): (P)使用所述小孔病毒去除膜，以超過0.30kgf/cm2的過濾壓力過濾所述含病毒的蛋白質溶液，從而得到所述病毒去除蛋白質溶液的高壓過濾工序。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，低壓過濾工序(q)中的所述過濾前溶液為洗滌用緩沖液。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其中，低壓過濾工序(q)為后洗滌工序或起止工序。
7.根據權利要求1~6中任一項所述的方法，其中，低壓過濾工序(q)中的所述過濾溶液的PH⑴及鹽的離子強度Y(mM)滿足以下的式2及式5: . O ≤ Y ≤ 50X-200 (式 2)
.3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5) 或者滿足以下的式4及式5:Y=O (式 4)
.3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
8.根據權利要求1~6中任一項所述的方法，其中，低壓過濾工序(q)中的所述過濾前溶液的PH(X)及鹽的離子強度Y(mM)滿足以下的式3及式5: . O ≤ Y ≤ 50X-250 (式 3) . 3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5) 或者滿足以下的式4及式5: Y=O (式 4)
.3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
9.根據權利要求1~8中任一項所述的方法，其中，低壓過濾工序(q)為使用所述小孔病毒去除膜，以0.20kgf/cm2以下的過濾壓力過濾所述溶液，從而得到所述病毒去除蛋白質溶液的工序。
10.根據權利要求1~4中任一項所述的方法，其中，根據過濾工序(a)前的所述含病毒的蛋白質溶液中的病毒濃度(Ctl)與過濾后的所述病毒去除蛋白質溶液中的病毒濃度(Cf)使用以下的式6算出的對數下降值LRV(Log Reduction Value)為4以上，
LRV=1gltl (CcZCf)(式 6)。
11.根據權利要求5或6所述的方法，其中，根據過濾工序(a)前的所述含病毒的蛋白質溶液中的病毒濃度(Ctl)與過濾后的所述病毒去除蛋白質溶液中的病毒濃度(Cf)使用以下的式6算出的對數下降值LRV (Log Reduction Value)為4以上，
LRV=1gltl (CcZCf)(式 6) 根據過濾工序(a)前的所述含病毒的蛋白質溶液中的病毒濃度(Ctl)與過濾工序(a)后的所述洗滌用緩沖液濾液中的病毒濃度(Cw)使用以下的式7算出的對數下降值LRV’為4以上，
LRVj =1g10 (C0/Cff)(式 7)。
12.根據權利要求1~11中任一項所述的方法，其中，所述小孔病毒去除膜的材質為纖維素或親水化的合成高分子。
13.根據權利要求1~12中任一項所述的方法，其中，所述小孔病毒去除膜的材質為親水化的合成高分子，所述合成高分子選自由聚偏二氟乙烯、聚醚砜、聚砜和聚乙烯組成的組中。
14.根據權利要求1~13中任一項所述的方法，其中，所述小孔病毒去除膜的形狀為平膜或中空纖維膜。
15.根據權利要求1~14中任一項所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白質溶液中的蛋白質濃度為lmg/mL~100mg/mL。
16.根據權利要求1~15中任一項所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白質溶液包含選自由單克隆抗體、基因重組血液凝固因子、干擾素、激素、酶、免疫球蛋白、白蛋白、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、纖維蛋白原和抗凝血酶III組成的組中的一種以上的蛋白質。
17.根據權利要求1~15中任一項所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白質溶液包含抗體作為蛋白質。
18.根據權利要求1~15中任一項所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白質溶液包含血液凝固第VIII因子或纖維蛋白原作為蛋白質。
19.根據權利要求1~18中任一項所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白質溶液含有選自由人細小病毒B19(B19)、小鼠微小病毒(MVM)、豬細小病毒(PPV)、牛細小病毒(BPV)、犬細小病毒(CPV)、脊髓灰質炎病毒(Polio)、圓環病毒、甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)組成的組中的一種以上的病毒。
20.根據權利要求1~19中任一項所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白質溶液含有不具有包膜的直徑32nm以下的病毒。
21.根據權利要求1~20中任一項所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白質溶液含有選自由無機鹽、緩沖液成分、表面活性劑和糖類組成的組中的一種以上的成分。
22.—種病毒去除蛋白質制劑的制造方法，其包括以下的工序(a): (a)使用小孔病毒去除膜過濾含病毒的蛋白質溶液，從而得到病毒去除蛋白質溶液的過濾工序， 過濾工序(a)包括以下的工序(q): (q)使用所述小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的過濾壓力過濾溶液，從而得到所述病毒去除蛋白質溶液的低壓過濾工序， 在低壓過濾工序(q)之前包括調整所述過濾前溶液的工序以使工序(q)中的所述過濾前溶液的PH(X)及鹽的離子強度Y(mM)滿足以下的式I及式5: O≤ Y ≤ 150X-590 (式 I)
3.5 ≤ X ≤ 8.0(式 5) 或者滿足以下的式4及式5: Y=O (式 4)
3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
23.一種病毒去除蛋白質制劑，其通過權利要求1~22中任一項所述的方法得到。
【文檔編號】C07K1/34GK103608352SQ201280030636
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年6月22日 優先權日:2011年6月24日
【發明者】本鄉智子, 林田裕久 申請人:旭化成醫療株式會社