α干擾素融合蛋白制劑及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及一種a干擾素融合蛋白制劑和應用。 技術背景：
[0002] 眾所周知，盡管很多功能性蛋白具有很好的生物學功能，但在成藥性方面往往存 在著缺陷，如穩定性差、體內容易降解等。因此，增強蛋白藥物的穩定性和延長其體內半衰 期是改善功能性蛋白成藥性的重要手段。這方面的技術主要有聚乙二醇化（PEGylation) 和融合蛋白技術。蛋白藥物經過聚乙二醇化后，分子量大大增加，可溶性和穩定性顯著增 強，從而使體內的半衰期顯著延長；然而聚乙二醇往往改變蛋白的空間結構，降低其生物學 活性，或引起不可預測的特異性或功能改變。
[0003] 融合蛋白技術可以避免聚乙二醇化的上述缺點。融合蛋白（Fusion Protein)是 指兩個或兩個以上、相同或不同的蛋白或肽通過肽鍵連接而形成的一個完整新分子，各個 蛋白或肽之間可以添加柔性接頭以保證蛋白的正確空間結構。通常，融合蛋白的制備是通 過基因工程技術，即將編碼各個蛋白或肽的核苷酸序列經基因重組而形成編碼融合蛋白的 序列，再通過表達載體，將此序列導入宿主細胞內，使之在細胞內合成融合蛋白，最后經各 種分離、純化技術獲得目的融合蛋白。目前融合蛋白技術已經成為生物醫藥的一個重要技 術平臺，多種融合蛋白藥物已經應用于治療自身免疫性疾病、腫瘤等，取得了重大的社會和 經濟效益。
[0004] 融合蛋白藥物中最成功的典范是用人IgG抗體Fc片段作為載體。Fc融合蛋白不 僅可以改善功能性蛋白的穩定性，而且可以有效地延長其體內半衰期，達到臨床上長效藥 物的目的。Fc融合蛋白技術已經成功地應用于IFN-2b，TNF-Rc和LFA-3等功能性蛋白的藥 物化。
[0005] 雖然Fc融合蛋白技術得到了成功的應用，但制備和生產方面也存在著一些問題， 如這樣的融合蛋白必需在哺乳動物細胞內重組表達、生產工藝復雜、生產周期過長、生產成 本過高等。為彌補Fc融合蛋白的不足，發明人篩選到能和人抗體IgG Fc片段結合的十肽， 然后將功能性蛋白與此十肽融合，形成新的a干擾素融合蛋白。所述融合蛋白包括a干 擾素和ABP，所述ABP為上述能與人IgG抗體Fc片段結合的十肽，所述a干擾素由序列表 SEQ ID NO. 5所示；所述ABP由序列表SEQ ID NO. 1所示，所述a干擾素的C末端與ABP的 N末端直接連接，或a干擾素的C末端與ABP的N末端之間通過（Gly-Gly-Gly-Ser) n連接， 所述n為1-100。這種融合蛋白進入人體后，通過上述十肽片段作為"肽橋"，將功能性蛋白 與內源性IgG抗體結合，這樣通過增大分子量，可以避免功能性蛋白在體內的腎臟過濾，延 長其體內循環時間而達到長效的目的。
[0006] 然而，作為蛋白藥物，這種a干擾素融合蛋白的穩定性無法與常規化學藥物相 比，其活性在長期貯存時還是會受到多種環境因素的影響。例如，對溫度、氧氣和紫外線高 度敏感。由于這些因素的作用，可能發生多種物理或化學變化，例如結合、聚集、氧化和構象 改變，從而使a干擾素融合蛋白大大喪失活性。因此，如果貯存期間a干擾素融合蛋白的 穩定性不能保證，會導致給藥劑量的變化從而影響療效。
[0007] 因此，本領域迫切需要開發一種穩定化的a干擾素融合蛋白制劑，這將十分有利 于該種新型藥物制劑在臨床上的應用推廣。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的是提供一種a干擾素融合蛋白的水溶液制劑，該水溶液可穩定保 存a干擾素融合蛋白制劑，能夠充分防止a干擾素融合蛋白的結合、聚集、氧化和構象改 變等理化性質的變化，從而保持其有效組分的生物學活性。
[0009] 為了實現上述目的，本發明采用下列技術方案：一種a干擾素融合蛋白的水溶液 制劑，包括a干擾素融合蛋白；L-半胱氨酸；甘露糖醇；海藻糖；組氨酸；泊洛沙姆188以 及 NaCl。
[0010] 其中，所述a干擾素融合蛋白包括a干擾素和ABP，所述ABP為能與人IgG抗體 Fc片段結合的十肽，由序列表SEQ ID NO. 1所示；所述a干擾素由序列表SEQ ID NO. 5所 不。在一個實施方式中，所述a干擾素的C末端與ABP的N末端直接連接。在另一個實施 方式中，a干擾素的C末端與ABP的N末端之間通過（Gly-Gly-Gly_Ser) n連接，所述n為 1-100〇
[0011] a干擾素包括a 2a干擾素、a lb干擾素、a 2b干擾素或者a con干擾素。在一 個優選的實施方式中，a干擾素為a 2b干擾素，即IFN2b。
[0012] a干擾素融合蛋白的濃度為〇. l-l〇wt%，進一步優選為0. 5_5wt%，最優選為 2_4wt% 〇
[0013] L-半胱氨酸的濃度為0.5_5wt%，進一步優選為l_4wt%，最優選為2_3wt%。
[0014] 甘露糖醇的濃度為0.5_5wt%，進一步優選為l_4wt%，最優選為2_3wt%。
[0015] 海藻糖的濃度為0?5-5wt%，進一步優選為0?5-3wt%，最優選為0?5-lwt%。
[0016] 組氨酸的濃度為0. 5_5wt%，進一步優選為0. 5_2wt%，最優選為0. 5-lwt%。
[0017]泊洛沙姆188的濃度為0.l-5wt %，進一步優選為0.2-2wt %，最優選為 0? 3_lwt % 〇
[0018] NaCl的濃度為0. 01-0. 5wt %，進一步優選為0. 02-0. 4wt %，進一步優選為 0. 05-0. 2wt %。
[0019] 另一方面，本發明還提供了上述a干擾素融合蛋白的水溶液制劑在制備抗病毒 藥物或抗腫瘤藥物的應用。
[0020] 與現有技術相比，本發明的水溶液制劑不僅在長時間保存后仍然保持足夠的活 性，而且明顯減少了藥品長期放置后產生的顆粒，穩定性很好。
【附圖說明】
[0021] 圖1為轉入pYW-2載體的大腸桿菌工程菌YW-IFNa2-ABP-E001的誘導表達的 SDS-PAGE檢測結果。M為Marker，1泳道為誘導表達前全菌，2泳道為誘導表達后全菌。
[0022] 圖2為由SEQ ID NO. 7所表達的a干擾素融合蛋白--IFNa2_ABP蛋白變性復 性及純化后的SDS-PAGE檢測結果。M為Marker，1泳道為誘導表達前全菌，2泳道為誘導表 達后全菌，3泳道為融合蛋白變性復性后上清，4泳道為純化后的融合蛋白一一IFNa2-ABP。 其中，序列表SEQ ID NO. 7是指IFNa2b與ABP基因之間通過表達（Gly-Gly-Gly-Ser)j9 基因融合。
[0023] 圖3為由SEQ ID NO. 7所表達的a干擾素融合蛋白--IFNa2_ABP蛋白的Western Blot分析結果。M為Marker，1為融合蛋白的Western Blot結果，2為負對照。
[0024] 圖4為由SEQ ID NO. 6所表達的a干擾素融合蛋白的Western Blot分析結果。M 為Marker，1、2為融合蛋白的Western Blot結果。其中，序列表SEQ ID NO. 6是指IFNa2b 及ABP基因直接融合。
【具體實施方式】
[0025] 本