專利名稱：包含蛋白毒素b亞基的治療制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療制劑。具體而言，本發明涉及一種包含蛋白毒素B亞基的制劑，其被用于治療病毒感染，本發明涉及一種含有該B亞基的融合蛋白，本發明還涉及含有該B亞基的組合物在藥物生產中的用途，本發明還涉及一種治療動物體的方法。全球90％的人口在成年初期攜帶有EB病毒(EBV)，因此使其成為最常見的病毒感染之一。
大多數初期EBV感染無癥狀或者只表現出亞臨床癥狀。少數病例在臨床上表現為傳染性單核細胞增多癥(腺熱)，這是一種自限性、發熱的疾病，其特征為全身性出疹、關節痛、淋巴結癥以及肝脾腫大。
更有意義的是EBV可能與多種上皮腫瘤和淋巴瘤相關。這些疾病包括鼻咽癌、Burkitt氏淋巴瘤、Hodgkin氏淋巴瘤以及移植后淋巴增生。
EBV能夠在體外轉化B細胞，形成淋巴海蕾(lymphoblastoid)細胞系(LCLs)。LCL細胞與活化的B細胞很相象，不過，它還表達所有的EBV潛伏基因，表現為III型潛伏模式(latency III pattern)，這些基因編碼的是核抗原EBNA1、2、3A、3B、3C和LP、潛在膜蛋白LMP1和2以及2個名為EBER1和2的小核糖核酸。
不過在一些體內被感染的B細胞和大多數EBV相關腫瘤中，表達的病毒潛伏基因的范圍在一些情況下僅限于LMP2(潛伏期0)、EBNA1(潛伏期I)，其它一些情況下還表達LMPs和EBERs(潛伏期II)。
在初次感染中，宿主能夠產生很強的體液和細胞免疫反應。不過，感染細胞以潛伏期0和I和II的形式存在時能夠逃避免疫監視，病毒無法被清除。這樣一來，病毒能夠終生存儲在宿主B細胞中。盡管尚未揭開真正的作用機制，不過，人們認為宿主B細胞的轉化和獲得永生是EBV致癌的一個關鍵步驟。
細胞毒T細胞(CTL)對EBV產生的響應對于調控已建立的潛伏感染具有重要意義(1)。實際上，目前的研究集中在產生和增強針對不同潛伏基因產物的CTL細胞方面，這可以提供指向EBV相關腫瘤的免疫治療的基礎。
CTL對EBV的響應的主要特征是EBNA3A，3B和3C具有免疫優勢，而對LMP2，EBNA2只有弱響應，對LMP1則幾乎沒有響應(2)。由于EBNA1內部存在甘氨酸-丙氨酸重復結構域(GAr)(3)，因此沒有免疫原性。因為多數EBV相關腫瘤表現潛伏I或者II期模式，所以研究重點集中在了增強抗LMP1或LMP2的CTL反應方面。
大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)的B亞基以及與其密切相關的類似物一霍亂弧菌毒素的B亞基CtxB都能夠通過它的受體GM1(GM1是一種廣泛存在于細胞表面的鞘糖脂)附著到靶細胞的表面，造成被結合的EtxB/CtxB迅速聚集或加帽，進而引發毒素的內吞。
已經顯示，EtxB能夠增加外源性抗原穿透粘膜表面的攝取，增強這些抗原的免疫原性。因此可以在經粘膜傳送的疫苗(4)的設計中將其用作佐劑。
在LCLs以及一些EBV相關惡性腫瘤中發現了EBV潛在膜蛋白LMP1和2，這些腫瘤包括鼻咽癌(5)和Hodgkin病。已經顯示，LMP1在質膜鞘糖脂豐富(GSL)的區域濃度很高(6)。在另一個研究中發現，用熒光顯微鏡可以觀察到LMP2和LMP1的共區域化現象(7)。在這些區域GM1也很豐富。
雖然不希望被理論束縛，但是本發明的發明者認為在將非毒性重組形式EtxB添加到LCL細胞后，由于LMP1、2和EtxB受體GM1都存在于相同的GSL區域，所以LMP1和2能夠和EtxB發生聚集和內化。這些病毒蛋白可能隨后經歷另外一種抗原加工過程，這最終可能會導致以前被保護的蛋白上的表位能夠被更有效地加工和遞呈到細胞毒T淋巴細胞。據信從理論可以推測CtxB也能夠產生相似的效果，而且該理論能夠擴展到通常在細胞表面表達的病毒抗原而不僅限于EBV潛在膜蛋白。
相應地，本發明的第一方面提供了選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)的B亞基和霍亂弧菌毒素(CtxB)的B亞基的蛋白毒素B亞基在改變病毒抗原和腫瘤抗原的抗原加工和遞呈方面的應用。所述的病毒抗原是在細胞表面表達的病毒抗原，尤其指EBV潛在膜蛋白。因此在第二方面，本發明提供了選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)的B亞基和霍亂弧菌毒素(CtxB)的B亞基的蛋白毒素B亞基在藥物生產中的應用，所述的藥物用于治療患有的EB(Epstein Barr)病毒感染相關疾病的動物(包括人在內)。在第三方面，本發明提供了選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)的B亞基和霍亂弧菌毒素(CtxB)的B亞基的蛋白毒素B亞基在藥物生產中的應用，所述的藥物用于治療患有腫瘤疾病的動物(包括人在內)。
將會清楚選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)的B亞基和霍亂弧菌毒素(CtxB)的B亞基的蛋白毒素B亞基對患病動物(包括人在內)有治療效果，其中的病毒細胞或者腫瘤細胞所具有的表面表達的抗原在病理上相關。因此，當包括人在內的動物體被感染或者攜帶EB病毒時，可以通過給予一定量的含有EtxB或者CtxB的組合物進行治療。另外，當包括人在內的動物患有腫瘤疾病時也可以通過給予一定量的含有EtxB或者CtxB的組合物進行治療。
所述的含有EtxB或者CtxB的組合物還可以含有細胞表面表達的抗原。
因此，本發明的另一方面提供了一種治療制劑，該制劑含有選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)的B亞基和霍亂弧菌毒素(CtxB)的B亞基的蛋白毒素B亞基以及一種細胞表面表達的抗原。優選的細胞表面表達的抗原是細胞表面表達的病毒抗原，優選EB病毒潛在膜蛋白。該潛在膜蛋白可以是EBV的LMP1或者EBV的LMP2。
通常，蛋白毒素的B亞基和細胞表面表達的病毒抗原是連接或者偶聯在一起的。或者，蛋白毒素B亞基和細胞表面表達的病毒抗原也可以是融合的。
本發明還提供一種含有蛋白毒素B亞基和一種細胞表面表達的抗原的融合蛋白，融合蛋白中的蛋白毒素優選EtxB，病毒抗原則優選EBV潛在膜蛋白。
融合蛋白的制備在該領域內已經很成熟，因此據信可以采用該領域內眾所周知的技術和方法。在這一方面，可以參考US-A-5589384，EP-A-0418626和WO 00/14114。
本發明還提供了一種融合蛋白，該蛋白包含與大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)或霍亂弧菌毒素(CtxB)的B亞基同源的第一蛋白，并含有與細胞表面表達的病毒抗原同源的第二蛋白。所述的第一同源蛋白能夠結合GM1受體，所述的第二同源蛋白能夠內化進入細胞并改變抗原加工過程。本發明的制劑可用于治療病毒性疾病。當細胞表面表達的病毒抗原是EBV潛在膜蛋白時，該制劑可以用來治療與EBV相關的疾病或者治療腫瘤，例如白血病。因此，本發明還提供了一種對患有EB病毒相關疾病的動物的進行治療方法(所說的動物包括人)，該方法包括將有效量的所述制劑給予包括人在內的動物體。本發明還提供了一種對患有腫瘤疾病的動物的治療方法(所說的動物包括人)，包括了將有效量的所述制劑給予包括人在內的動物體。
本發明的治療制劑含有蛋白毒素的B亞基或者還含有細胞表面表達的抗原，可以將其以藥物組合物的形式給予包括人在內的動物體，所述的藥物組合物除了含有所述的治療制劑外，還可以含有一種或者多種藥學上可以接受的載體、稀釋劑或者賦形劑。所述治療制劑本身或以藥物組合物形式存在的所述治療制劑，可以根據預防或者治療的目的進行給藥，可以以傳統制劑的任何一種給藥途徑進行給藥，包括口服給藥和腸胃外給藥等。
參考下述附圖，通過實施例對本發明進行描述。


圖1展示的是同一條件下對6種不同LCL細胞系的LMP1進行標記的一系列圖；圖2是一張顯示不同濃度下EtxB與LCL結合的圖；圖3是一張顯示EtxB結合到胞漿膜上的免疫熒光顯微照片圖4是一張顯示EtxB在細胞一極產生帽化作用的免疫熒光顯微照片；圖5是經EtxB處理后LCL細胞上LMP1的蛋白印跡的檢測圖；圖6是經過SDS-PAGE后LMP1的蛋白印跡的檢測圖；圖7是描述針對不同的靶細胞比較WT poly T的細胞毒性的直方8是描述針對不同靶點DA c64的CTL活性示意圖。
實施例(A)細胞培養在實驗中使用來源于各種供體的淋巴海蕾細胞系。EB4是一種EBV陰性B淋巴細胞系，將此細胞作為陰性對照。在含有10％胎牛血清、2mM谷酰胺、100μg/ml青霉素、100pg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基(RPMI完全培養基)中培養該細胞，培養溫度37℃，5％CO2孵箱培養。用臺盼藍染色的方法鑒定活細胞。
甲泛葡胺處理在某些實驗中，用1ml甲泛葡胺(18％w/v甲泛葡胺和2％FCS的PBS)溶液和2ml含有LCLs的RPMI完全培養基混合，500g離心15分鐘后，可以從健康細胞中分離出碎片。小心的從溶液的分界面收集活細胞并洗滌。
EtxB和抗體Bristol大學的T.R.Hirst教授惠贈非毒性重組EtxB、118.8單克隆鼠抗EtxB抗體和兔抗EtxB血清。CS1-4鼠抗LMP1抗體(Dako公司)、FITC偶聯山羊抗鼠IgG抗體(Sigma公司)、Texas紅色偶聯的驢抗兔IgG抗體和FITC-偶聯驢抗鼠IgG抗體(均來自Jackson ImmunoResearch公司)。
用EtxB處理細胞將含有1×106個/ml的LCL細胞培養液和10μg/ml的EtxB在2ml孔內共同孵育，每個實驗根據指定的時間在37℃，5％CO2孵箱中培養。這些條件利于誘導帽化和內化。用冰預冷的含0.1％的疊氮化物的PBS洗滌中止上述過程。陰性對照細胞在上述相同的條件下進行孵育，不過不加入EtxB。第二組陰性對照加入EtxB進行處理，不過在4℃條件下孵育，這樣處理后，允許表面結合但是抑制帽化和內化。
流式細胞儀為了檢測LMP1和LCL細胞，用含1％多聚甲醛的磷酸賴氨酸緩沖液于4℃固定細胞1小時。用CS1-4(1∶100)間接標記LMP1后，用FITC偶聯抗鼠IgG(1∶100)檢測。為了檢測EtxB對LCL細胞的親和力，用不同濃度的EtxB在4℃條件下處理細胞1小時。洗滌后用118.8(1∶20)做為一抗標記EtxB，用FITC偶聯抗鼠IgG抗體(1∶100)做為二抗進行處理。2個實驗均在適當的染色后洗滌一次，并用Becton Dickinson FACS掃描系統進行分析。
共聚焦顯微鏡按上述方法，在用含1％多聚甲醛的磷酸賴氨酸緩沖液固定細胞之前，在4℃或37℃條件下，用EtxB處理細胞4小時。先用CS1-4(1∶50)和兔抗EtxB血清(1∶500)處理，然后用FITC偶聯驢抗鼠IgG抗體(1∶100)和得克薩斯紅偶聯抗兔IgG抗體(1∶500)做為二抗進行處理。用10-20μl Vectashield封固介質(Vector)重懸細胞沉淀并且將細胞固定在載玻片上。用Zeiss立式掃描共聚焦顯微鏡同時對LMP1和EtxB進行40x和60x的放大顯像。
凝膠電泳和蛋白免疫印跡用預先鋪好的Bis-Tris微型凝膠(Novex)以及標準SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳和蛋白印跡，在加入和不加入EtxB的情況下，分別孵育10小時，檢測在LCL細胞上的LMP1。在不同的時間點收集等量的細胞。
用添加了蛋白酶抑制劑(1∶7終體積)(Boehringer Mannheim)的預先混合的樣本緩沖液(Novex)裂解全細胞以制備用于微型凝膠上樣的細胞裂解物，加入蛋白酶抑制劑的目的是為了防止非特異的蛋白降解。然后煮沸5分鐘并且超聲處理30秒。裂解物中含有等同的細胞數量(1.3×105細胞/泳道)，用4-12％Bis-Tris梯度凝膠分離該裂解物。轉移到硝化纖維膜上后用含有5％脫脂牛奶和0.05％吐溫的TBS封閉非特異位點。首先在CS1-4(1∶50)中孵育印跡，然后在HRP偶聯山羊抗鼠IgG抗體中孵育。最后放在HRP底物中(Pierce)，之后進行X射線顯影(Kodak)。
對于標準的SDS聚丙烯酰胺凝膠，除了改變樣品緩沖液(0.05MTris-HCl pH 6.8，2％2ME，10％甘油，0.01％溴酚藍)之外按照上述的同樣方法制備樣品。再次將相等數量的細胞(1×106細胞/泳道))上樣到每個泳道中并且在12-20％SDS聚丙烯酰胺凝膠進行分離。轉移到硝化纖維膜上，和微型凝膠系統一樣封閉非特異性位點并且讓CS1-4結合到LMP1上。使用堿性磷酸酶偶聯二抗(Sigma)，通過ALP底物(Vector)處理來檢測LMP1特異性條帶。
CD8+細胞系和靶細胞WT poly T是一株針對LMP2的多克隆CTL細胞系。DA c64是一株針對HLA-A2.01限制性表位CLG的LMP2特異性T細胞克隆，抗原決定簇CLG是LMP2的第426-434位的CLGGLLTMV 9肽序列。在細胞毒分析中以自體同源LCL為靶細胞。這些細胞均由伯明翰大學癌癥研究院CRC的A.B.Rickinson教授惠贈。
細胞毒分析該實驗是在伯明翰大學CRC癌癥研究院的協助下完成的。將WT polyT和DA c64做為標準5小時鉻釋放分析的效應器。每次經過如下處理后都要對不同組的靶細胞進行廣泛的清洗(1)與EtxB單獨作用2小時，(2)與CLG(0.1，μg/ml)作用2小時，洗滌并且和EtxB孵育2小時或者(3)用編碼LMP2的重組牛痘病毒感染過夜后洗滌并且和EtxB孵育2小時。對照組重復上述操作但是不加入EtxB。如上所述準備完畢后，在37℃用51Cr標記靶細胞1小時，洗滌3次并且在U型底96孔板上按照已知的效應物靶細胞比例混合效應物，每個樣品2個孔。當用1％Triton-X溶液代替效應物細胞孵育靶細胞可以得到最大釋放，而單獨用RPMI培養基處理靶細胞可以得到自然釋放。經過5小時的孵育后，用γ計數器定量上清中的放射活性。
用流式細胞儀測定LCL細胞上LMP1的相對數量。
流式細胞儀可以測定不同淋巴海蕾細胞系的LMP1數量上的差異。這可能影響到在后續實驗中對LCL細胞的選擇。
在實驗中使用了名為BER、HOMII、110W10、IR、JG和WT18的6種LCL細胞，并將EB4做為陰性對照。當抗體結合位點是蛋白位于胞漿的C末端時，必須在CS1-4結合LMP1之前固定和增滲處理細胞。
圖1顯示6種LCL細胞中的LMP1相對數量沒有顯著區別。這表明(1)LMP1的數量依賴于穩定的EBV轉化的B細胞數量而不依賴于宿主細胞的數量。(2)對所用LCL細胞的選擇將回使對后續研究EtxB對LMP1或2抗原加工通路影響的影響最小。
流式細胞儀測定EtxB的滴度雖然我們實驗室在先前的實驗中已經證明LCL和EtxB孵育72小時不會影響LCL的成活性(沒有給出數據)，但是我們需要測定EtxB和細胞表面GM1達到最大結合時的EtxB最佳濃度。
取1×106細胞/ml的LCL和不同濃度的EtxB孵育后，然后用流式細胞儀測定LCL細胞中EtxB的數量(圖2)。
結果表明，盡管各組間的差異很小，不過可以確定EtxB在LCL細胞上達到最大結合量時其濃度在1.0到20.0μg/ml之間(表1)。基于這些結果，在后續實驗中采用10pg/ml作為EtxB的使用濃度。
表1所示的是用不同濃度的EtxB處理LCL細胞，然后對EtxB進行標記并用FACS分析。當用用濃度為1.0到20.0μg/ml的EtxB處理細胞時產生了最強的信號，表明在該濃度下，EtxB具有較高的結合親和性。采用免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察EtxB和LMP1的共帽作用如前所述，GM1和LMP1二者都存在于細胞表面的鞘糖脂(GSL)富集區域。因此認為當EtxB結合GM1后會引起EtxB的帽化和內化，這可能會改變LCL表面LMP1的分布。
用偶聯有熒光染料的抗體標記EtxB，它們會與GM1結合并發生帽化和內化，此過程可用免疫熒光顯微鏡觀察。另外，用不同的熒光染料標記LMP1，就可以看到LMP1和EtxB的共區域化以及帽化后的重分布的情況。共聚集熒光顯微鏡具有所需的光學敏感度，可用來同時觀察標記蛋白在細胞表面和細胞內部的分布狀況。
4℃處理細胞后觀察，發現Texas紅標記的EtxB呈小斑點狀遍布細胞表面(圖3)，這表明EtxB已經和GM1結合但未觀察到帽化現象。還看到大部分FITC標記的LMP1以斑點狀分布在細胞表面。更加重要的是，當同時檢測EtxB和LMP1時，可看到EtxB和LMP1在細胞表面的共區域化現象。
在37℃條件下，可注意到EtxB的帽化趨向細胞的一極，并能誘導LMP1產生相似的現象，即發生共帽化(圖4)。不過，還不能觀察EtxB和LMP1在細胞內的分布情況。這主要是因為(1)只有少量的EtxB和LMP1發生內化；(2)內化進入細胞的EtxB和LMP1被迅速降解；(3)對于相對小的CLC(平均大小10-20μ)，很難得到理想的薄的“光學切片”(最小值是1μm)和(4)沒有一種較好的計數染色方法來區分細胞內的胞漿和細胞核區室。似乎假設(1)是正確的。
在EtxB處理后在蛋白質印跡中沒有發現LMP1降解根據共聚焦顯微鏡的結果，LMP1和EtxB發生共區域化現象，并且經歷共帽化，進一步的研究需要表明LMP1是否確實和EtxB發生了內化。據推測，發生內化后，LMP1進入新型的降解通路并且產生新的降解產物。通常，去除LMP1蛋白或者其它跨膜蛋白需要特殊的蛋白水解酶，這些酶在分開蛋白跨膜結構域的細胞質反向環產生缺口。如果發生上述作用，當用SDS-PAGE凝膠電泳檢測全細胞裂解液時能夠看到全長LMP1的量下降。確實，在這一過程中的早期片斷產物仍然含有完整的羧基末端，其可以被CS1-4抗LMP1抗體識別。為了改進條帶的分辨率可以使用梯度膠進行電泳，尤其是當LMP1片斷降解成更小的片斷的時候。在細胞裂解物制備過程中，需格外小心，可以通過將樣本置于冰上和添加蛋白酶抑制劑的辦法盡量減少內源性蛋白酶的作用。在轉移后，用免疫印跡Ponceau S染色法對相同上樣量的細胞裂解物進行檢測。在一些實驗中，在蛋白質印跡中利用和EBV無關的蛋白EBNA作為內部對照，圖5所示的是用4-12％的微型凝膠得到的標準結果。只在LCL細胞的裂解物中清楚地檢測到LMP1全長蛋白，在EBV陰性對照細胞條帶中未檢出該蛋白。雖然增加了EtxB的處理時間，但是在EB4條帶中LMP1全長蛋白沒有明顯減少。同樣也沒有檢測到LMP1的片斷。
盡管微型凝膠能夠提供高質量的印跡結果，不過每條泳道的蛋白上樣量有限。因此，改用標準凝膠，這種凝膠基本上可以通過增加每條泳道的裂解物上樣量改善了檢測的靈敏度，與此類似，使用梯度凝膠(12-20％)來改善條帶的分辨率。
這一次，很容易又檢測到了LMP1全長蛋白(圖6)，盡管延長了EtxB的孵育時間，仍然沒有檢測到完整LMP1的顯著減少，同時也沒有看到任何降解條帶。不過出現了另外的問題，即這組免疫印跡的背景信號很強，很難分辯可能產生的任何小片斷。
到目前為止，用共聚焦顯微鏡和蛋白質印記還沒有成功的檢測到EtxB作用后LMP1產生的內化和降解。這可能源于以下幾點原因(1)假說是錯誤的，從來就沒有內吞和降解現象發生，(2)目前所用的方法的敏感度不足以檢測到內化和降解的微量LMP1，(3)EtxB處理后蛋白酶馬上降解了C末端，造成抗LMP1抗體(CS1-4)的抗體結合位點缺失或者(4)LMP1的更新率很快，用目前的檢測手段很難檢測到細胞內部的總LMP1量的微小改變。
通過51Cr釋放分析檢測的LMP2特異性CTL對EtxB處理的靶細胞的增強殺傷效果細胞毒T細胞(CTL)能夠識別遞呈在細胞表面的HLA I類相關分子，甚至當這些抗原的遞呈數量是痕量狀態時，也有這種識別功能。如果加入的EtxB確實能夠誘導LMP1和2改變抗原加工過程，導致原先被保護的表位被更有效的遞呈，那么當用CTL細胞系對LMP1或2激活的EtxB處理的靶細胞進行細胞毒分析時，就能夠提供一種檢測EtxB改變這些潛在膜蛋白抗原遞呈效果的極其敏感和特異的手段。
已經鑒定了一些HLA I類限制性LMP2抗原表位，已經產生了針對LMP2及其抗原表位的CD8+細胞系(Rickinson)。相反，目前僅僅鑒定出了一個LMP1的抗原表位(Khanna)。鑒于這個原因，在鉻釋放分析中采用LMP2特異的T細胞系作處理EtxB處理的自體同源性靶細胞。
在這些實驗中使用了2種CTL細胞系WT poly T和DA c64。用自體同源性LCL細胞作為靶細胞，將這些細胞分成3組(1)單獨用EtxB處理，(2)在用EtxB處理前，進行CLG肽處理和(3)在加入EtxB之前，用載有LMP2A基因的牛痘病毒進行轉染處理。
從表2可以看出單獨添加EtxB處理LCL細胞后，DA c64克隆的CTL反應增加了4倍，相同處理后，多克隆WT poly T細胞系的反應始終保持在顯著增加2倍的水平。與上述結果相似的是，與只使用vacLMP2處理的靶細胞相比，針對先前曾經被帶有LMP2(vacLMP2)的痘苗病毒處理過的EtxB處理的靶細胞的活性增高。圖7和圖8很清楚地體現在EtxB作用后，LMP2特異的CTL反應得到增強。
不過，用EtxB處理肽脈沖的(peptide-pulsed)靶細胞沒有提高細胞毒性。一種可能的解釋認為用于脈沖的肽的數量在細胞表面已經飽和了可用的結合位點，從而實現了最佳識別和最大的CTL反應。
用EtxB處理EBV感染細胞的這組結果是第一次給出證據表明EtxB能夠增強LMP2的產生和遞呈，刺激CTL細胞增強對這種蛋白的反應。
表2
表2-靶細胞在WT poly T和DA c64作用下特異性裂解百分數。用EtxB處理后增加了DA c64針對LCL細胞和vacLMP2轉染的LCL細胞的活性。雖然增強效果有些下降，但是WT poly T組也得到了相似的結果。盡管用EtxB進行了處理，事先CLG肽脈沖處理的LCL細胞沒有產生更強的CTL殺傷敏感性。
EtxB被廣泛用于提高外源性抗原的細胞內轉運，其或者被用作疫苗佐劑，或者被用作融合蛋白(最近)，這一系列實驗第一次表明其對于遞呈到細胞表面上的內源性蛋白具有類似的影響。
該假說的基礎是EtxB只能作用于位于它的受體GM1所處區域的膜蛋白。位于EBV轉化的淋巴海蕾細胞系上的EBV潛在膜蛋白滿足這樣的苛刻條件。
實驗表明EtxB能夠改變細胞表面的LMP1分布。更重要的是，在LMP2的情況下，似乎改變了抗原加工路徑進而引發CTL反應的急劇增強。
盡管仍然只是初步的實驗結果，但是該結果表明EtxB可用于提高CTL識別和殺傷表達有LMP2靶細胞和可能地，LMP1靶細胞的能力。因此，該蛋白在表現出潛伏模式II的EBV相關腫瘤的免疫治療方面具有重要作用，尤其是鼻咽癌和Hodgkin疾病。
(B)EtxB及其突變體前面已經介紹了無毒性重組EtxB。在本實驗中還使用了分別被命名為G33D和H57A的2種EtxB的突變體蛋白。G33D在33位用Gly替代了Asp以阻止其與GM1的結合，而H57A能夠和GM1結合，但是由于用His取代了57位的Ala，H57A不具有免疫調節活性。EtxB和上述的突變體均由伯明翰大學的T.R.Hirst教授惠贈。
W6/32和DA6.231上清收集W6.32的培養上清，將其用于全部I類HLA的封閉抗體母液，從DA6.231得到的上清類似地被用作抗II類HLA封閉抗體母液。
肽用標準9-芴基甲基氧羰基(FMOC)化學(布里斯托爾大學)制備得到與EBV潛伏抗原的抗原表位一致的肽，并且按已知濃度將其溶解在DMSO中。
多克隆細胞毒CD8+T細胞系外周血單核細胞(PBMCs)來自健康血清陽性捐贈者。用磁式細胞分選儀(MACS，Miltenyi Biotec)選擇得到陽性CD8+細胞，將其留出。在37℃條件下，剩余的PBMC細胞接受50μM已知的肽的脈沖處理1小時。洗滌3次之后和CD8+細胞合并在一起，按照1×106細胞/ml的接種量在完全RPMI培養基中培養合并的細胞，該培養基中含有25ng/ml IL-7，在第3天時加入10U/ml的IL-2。之后，每周更換培養液2次，所用培養液含有25ng/ml IL-7和10U/ml IL-2。在第12天時，磁力分選CD8+并且進行計數。剩余細胞在培養基中進行50-100μM肽的脈沖處理，處理1小時后，用50μg/ml絲裂霉素C于37℃條件下再處理1小時。洗滌上述細胞3次后將其以響應物∶刺激物為2∶1的比例加入到CD8+細胞中。隨后用細胞毒性分析檢測這些培養物，并且每周用絲裂霉素C處理的LCL細胞重新刺激1次。
細胞毒性分析自體同源LCL細胞來自上述PBMC細胞相同的供體，該細胞在實驗中被用作靶細胞。這些細胞(1)單獨使用，或者(2)用10μg/ml EtxB或者其一種突變體處理4小時或者處理過夜。用70-100μCi的放射性鉻標記靶細胞90分鐘。在某些靶細胞中，在最后的60分鐘內加入終濃度為5μM的特異性肽或者DMSO溶劑。每個標準鉻釋放分析要求洗滌細胞并且和效應物共同孵育4小時。當實驗需要抑制I類HLA抗原遞呈時，要在添加效應細胞之前，將標記的靶細胞和W6/32或DA6.231上清按照1∶10的比例在室溫孵育1小時。
實施例B1ExtB處理LCL細胞，能夠增強LMP1和LMP2-特異性CTL細胞的識別和殺傷能力，不能增加EBNA3A-特異性CTL細胞的識別殺傷能力從供體DW(HLA-A0201，A23，B7，B49，C7)得到了2種肽的特異性多克隆CTL細胞系。一種指向HLA-A2限制性LMP1表位YLLEMLWRL(YLL)，另外一種指向HLA-A2.01限制性LMP2表位CLGGLLTMV(CLG)。用一系列的肽對這些細胞系進行了檢測，發現這些細胞系具有良好的特異性(圖9和10)。
圖9和10。圖9和圖10所示的CLG-特異性和YLL-特異性DW CTL細胞系分別被用于指向自體同源LCL靶細胞，這些靶細胞或者單獨使用，或者用各種已知的I類抗原或當量體積的DMAO溶劑進行脈沖處理。LLD代表EBNA3C抗原表位LLDFVRFMGV，其屬于HLA-A0201限制性的，而PYL則是相應于HLA-A2301限制性的LMP2抗原表位PYLFWLAAI。目前已經清楚地證實2種CTL細胞系對制備其所使用的肽都具有良好的特異性。即YLL和HLA-A2 LMP1限制性抗原表位肽YLLEMLWRL一致，CLG具有氨基酸序列CLGGLLTMV，該肽是一種已知的HLA-A0201限制性LMP2表位。
這2種細胞系都能夠識別和裂解被EtxB處理的自體同源LCL細胞(圖11和圖12)。2種細胞的殺傷水平都明顯高于未經處理的背景CLC細胞殺傷水平。在4小時后，EtxB表現出迅速發動、維持以及提高對CTL的識別和殺傷靶細胞效果，甚至在過夜孵育后還能維持在相近水平。
EBNA3A是另外一種EBV潛在抗原，這種抗原只在核內表達，不在細胞膜上表達。一種來自另一種供體OKW(HLA-A11，A24，B40，C4，C7)的CTL細胞系對RYSIFFDY(RYS)有特異性，RYSIFFDY(RYS)是HLA-A24限制性EBNA3A抗原表位。與LMP1和LMP2特異的CTL細胞不同，用EtxB處理LCL細胞系后不能增加EBNA3A特異性CTL細胞對靶細胞的殺傷能力。(圖13)。這種情況支持了下面的假說EtxB僅僅能夠改變位于脂雙層的結合蛋白的抗原加工過程和遞呈通路。
圖11、12和13。在圖11中，CLG-特異的DW CTL對EtxB處理的LCL靶細胞的靶向作用顯著高于未經處理的LCL細胞。這不是EtxB處理增加了細胞的滲透性的結果，因為在所有靶組(沒有列出數據)任意計數和最大計數的絕對數量和比例在很大程度上都基本相當。當用YLL特異的DW CTL細胞時得到了相似的效果(圖12)。在2個實驗中，用EtxB處理靶細胞4小時或者孵育過夜后，細胞毒性殺傷能力都得到了相似的提高。這表明EtxB對LMP1和LMP2的作用迅速而且能夠得到維持。對照組實驗與此相似。在類似的實驗種還使用具有RYSIFFDY(RYS)特異性的對照CTL細胞系，RYSIFFDY(RYS)是HLA-24限制性EBNA3A抗原表位。不過，用EtxB處理LCL細胞后細胞毒性殺傷能力沒有提高(圖13)。這表明EtxB僅僅能夠影響所發現的膜結合型抗原的加工和遞呈過程。
實施例B2CTL對EtxB處理的LCL細胞的殺傷能力的提高是通過I類HLA介導的為了確定在EtxB處理后的CTL殺傷能力的提高，是否是通過I類HLA抗原介導的，將EtxB處理的LCL細胞和含有全部I類HLA抗體的W6/32上清共同孵育。這可以防止在CD8+CTL細胞表面的T細胞受體(TCR)和在LCL靶細胞上的I類HLA抗原的相互作用。
圖14和圖15。W6/32是一種全部I類HLA的封閉抗體，將該抗體在EtxB處理后或者肽脈沖處理后使用。結果表明I類HLA封閉抗體能夠有效阻斷肽脈沖處理的靶細胞的裂解作用，而使用抗II類HLA抗體DA6.231時，細胞裂解不受影響。經過EtxB處理的靶細胞組得到相似結果。這表明EtxB對LMP1和LMP2作用是通過I類HLA抗原遞呈通路介導的。
如圖14和15所示，在與W6/32抗體孵育后，YLL和CLG特異性DW CTL細胞對EtxB處理靶細胞的殺傷水平顯著下降。在用相關肽脈沖處理的靶細胞中看到了類似的而且預料得到的下降。當使用DA6.231抗II類抗體處理時，EtxB的效果沒有顯著改變。
因此，EtxB處理后導致的CTL細胞的殺傷能力增強是因為該處理增加了LMP1和LMP2I類表位的產生，隨后該表位與I類HLA抗原分子形成復合物后被遞呈到LCL靶細胞的表面。
實施例B3EtxB對LMP1和LMP2的影響需要GM1結合，單并不依賴于其免疫調節活性已知EtxB具有多種免疫調節活性，例如上調B細胞的CD25和MHCII類抗原、以及通過NFκB依賴的和鏈激酶3(caspase3)依賴的信號通路誘導鼠科動物CD8+T細胞的凋亡。
圖16和17。G33D是一種不能發生結合的EtxB突變體，用G33D處理靶細胞后不會被CTL細胞識別和殺傷，這表明EtxB對LMP1和LMP2的作用需要和神經節苷脂受體GM1的結合。也可以使用第二種突變體H57A，該突變體與GM1結合但不具有顯著的免疫調節活性，如誘導依賴于NFκB和鏈激酶3的鼠科動物CD8+T細胞的凋亡。在這里，CTL對LMP1和LMP2的殺傷效果的增強效果沒有被抑制，這表明在增強殺傷效果作用中EtxB介導的信號沒有發揮作用。
從圖16和17中可以看到，當用沒有結合活性的突變體G33D處理后，CTL的殺傷能力沒有得到提高，這清楚的表明EtxB結合到GM1對于其對LMP1和LMP2的影響是重要的。但是，用能夠結合GM1但是免疫調節活性缺失的突變體H57A處理時，CTL細胞的殺傷能力提高與用EtxB處理的作用相當。因此，看起來EtxB對LMP1和LMP2加工的影響以及隨后對產生免疫原性肽的影響不依賴于它的免疫活性。
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權利要求
1.一種治療制劑，其包含一種選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)B亞基和弧菌霍亂毒素(CtxB)B亞基的蛋白毒素B亞基，和一種細胞表面表達的病毒抗原。
2.根據權利要求1的治療制劑，其中所述的蛋白毒素B亞基和細胞表面表達的病毒抗原是連接的。
3.根據權利要求1的治療制劑，其中所述的蛋白毒素B亞基和細胞表面表達的病毒抗原是偶聯的。
4.根據權利要求1的治療制劑，其包含一種所述蛋白毒素的B亞基和所述細胞表面表達的病毒抗原的融合蛋白。
5.根據權利要求1-4任何一項中的治療制劑，其中所述的細胞表面表達的抗原是EB病毒潛在膜蛋白。
6.根據權利要求5的治療制劑，其中的細胞表面表達的抗原是EB病毒LMP1。
7.根據權利要求5的治療制劑，其中的細胞表面表達的抗原是EB病毒LMP2。
8.根據權利要求1-7任何一項中的治療制劑，其中的蛋白毒素B亞基是EtxB。
9.一種融合蛋白，其包含一種選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)B亞基和弧菌霍亂毒素(CtxB)B亞基的蛋白毒素B亞基，和一種細胞表面表達的病毒抗原。
10.根據權利要求9的融和蛋白，其中所述的細胞表面表達的抗原是EB病毒潛在膜蛋白。
11.根據權利要求10的融和蛋白，其中所述的細胞表面表達的病毒抗原是EB病毒LMP1。
12.根據權利要求10的融和蛋白，其中所述的細胞表面表達病毒抗原是EB病毒LMP2。
13.根據權利要求9-12任何一項中的融和蛋白，其中的蛋白毒素B亞基是EtxB。
14.一種融合蛋白，該蛋白包含與大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)或霍亂弧菌毒素(CtxB)的B亞基同源的第一蛋白，并含有與細胞表面表達的病毒抗原同源的第二蛋白，所述的第一同源蛋白能夠結合到GM1受體而且所述的第二同源蛋白能夠內化進入細胞并在那里改變抗原加工路徑。
15.根據權利要求14的融和蛋白，其中所述的第二同源蛋白和EB病毒LMP1同源。
16.根據權利要求14的融和蛋白，其中所述的第二同源蛋白和EB病毒LMP2同源。
17.一種組合物在藥物生產中的應用，所述的組合物包含一種選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)B亞基和弧菌霍亂毒素(CtxB)B亞基的蛋白毒素B亞基和一種EB病毒潛在膜蛋白，所述的藥物用于治療包括人體在內的患有EB病毒相關疾病的動物體。
18.根據權利要求17的應用，其中的EB病毒潛在膜蛋白是LMP1。
19.根據權利要求17的應用，其中的EB病毒潛在膜蛋白是LMP2。
20.一種組合物在藥物生產中的應用，所述的組合物包含一種選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)B亞基和弧菌霍亂毒素(CtxB)B亞基的蛋白毒素B亞基和一種EB病毒潛在膜蛋白，所述的藥物用于治療包括人體在內的動物體中的瘤形成。
21.根據權利要求20的應用，其中的EB病毒潛在膜蛋白是LMP1。
22.根據權利要求20的應用，其中的EB病毒潛在膜蛋白是LMP2。
23.一種治療患有EB相關疾病的、包括人體在內的動物體的方法，該方法包括給予所述的包括人體在內的動物體有效量的、權利要求5-7任何一項中所述的治療制劑。
24.一種治療患瘤的、包括人體在內的動物體的方法，該方法包括給予所述的包括人體在內的動物體有效量的、權利要求5-7任何一項中所述的治療制劑。
25.選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)B亞基和弧菌霍亂毒素(CtxB)B亞基的蛋白毒素B亞基在改變病毒和腫瘤抗原的抗原加工和呈遞中的應用。
26.選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)B亞基和弧菌霍亂毒素(CtxB)B亞基的蛋白毒素B亞基在藥物生產中的應用，所述的藥物用于在包括人體在內的感染了EB病毒的動物體中，治療與EB病毒相關的疾病或病。
27.選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)B亞基和弧菌霍亂毒素(CtxB)B亞基的蛋白毒素B亞基在藥物生產中的應用，所述的藥物用于在包括人體在內的動物體中治療瘤形成。
28.一種治療患有EB相關疾病的、包括人體在內的動物體的方法，該方法包括給予所述的包括人體在內的動物體有效量的、選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)B亞基和弧菌霍亂毒素(CtxB)B亞基的蛋白毒素B亞基。
29.一種治療患瘤的、包括人體在內的動物體的方法，該方法包括給予所述的包括人體在內的動物體有效量的、選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)B亞基和弧菌霍亂毒素(CtxB)B亞基的蛋白毒素B亞基。
全文摘要
本發明涉及蛋白毒素的B亞基，該B亞基選自大腸桿菌熱不穩定腸毒素(EtxB)的B亞基和霍亂弧菌毒素(CtxB)的B亞基，本發明涉及的蛋白毒素B亞基對在細胞表面表達病毒和腫瘤抗原的細胞有治療效果。特別是，該蛋白毒素可用于治療患有EB病毒(Epstein－Barr virus)感染疾病或者腫瘤疾病的動物(包括人)的。另外，該治療制劑可以含有細胞表面表達抗原，如EB病毒潛在膜蛋白。
文檔編號C07K19/00GK1561232SQ01822038
公開日2005年1月5日 申請日期2001年12月11日 優先權日2000年12月11日
發明者安德魯·約翰·摩根, 安德魯·道格拉斯·威爾遜, 王貢偉 申請人:布里斯托爾大學