檢測cadasil致病基因突變的方法，及其引物、試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬分子生物學技術領域，設及檢測CADASIL致病基因突變的方法，及其引 物、試劑盒。
【背景技術】
[0002] CADASIL(cerebralautosomaldominantarteriopathywithsubcortical infarctsandle址oencephalopathy)的致病基因被確定為19號染色體上的NOTC冊基因。 基因檢測進一步完善了疾病的診斷，但由于N0TC冊基因存在33個外顯子，全序列基因突變 檢測價格昂貴，耗費時間長，不能作為診斷疾病的常規方法。迄今為止，國內報道的外顯子 突變無明顯聚集性，己發現的突變位于第3、4、6、10、11、18外顯子，也尚無較大樣本基因檢 查進行診斷的報道。
[0003] 現有的檢測CADASIL的致病基因技術主要是基于單個突變位點的PCR和測序方法 及單基因忍片方法，顯著缺點主要在于僅僅能檢測單個突變位點，不能對多個突變位點進 行同時檢測，也不能對分布于多個外顯子的位點進行同時檢測。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于克服上述不足，提供一種檢測CADASIL致病基因突變的方法， 其解決了現有技術中進行CADASIL致病基因突變檢測程序繁瑣、費用昂貴、費時、易污染和 靈敏度低等問題。
[0005] 為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為：一種檢測CADASIL致病基因突變 的方法，不用于疾病的診斷和治療，其特征在于，其包括如下實現步驟：
[0006] 樣本處理：取外周血2ml于邸TA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存；
[0007]DNA提取，取220μ1抗凝血用試劑盒提取DNA，包括：
[000引 1)加220μ1BufferBL，震蕩混合，于70°C解育10分鐘；
[000引。加 220μ1無水乙醇震蕩混合約20秒；
[0010] 扣12000巧m離屯、1分鐘；
[0011] 4)取上清轉入收集柱中，1200化pm離屯、2分鐘；
[0012] 5)將收集柱置一個新的收集管上，加入500μ1皿solution,室溫放置5分鐘；
[0013] 6) 12000巧m離屯、2分鐘；
[0014] 7)加入 700μ1washBuffer, 12000巧m離屯、2 分鐘；
[0015] 8)將收集柱置一個新的收集管上，加入700μ1washBuffer, 12000巧m離屯、2分 鐘；
[0016] 9)棄收集管內液體，12000巧m離屯、2min;
[0017] 10)將收集柱放入一個新的1. 5ml離屯、管內，加入50μ1 70°C預熱的洗脫液，室 溫放置l-2min，12000巧m離屯、2分鐘，濾液即為模板DNA;
[001引PCR擴增
[001引PCR反應體系：
[0020] Premix Taq PC民Μ泣就粧MIX 12.5 μ1 DNA模妓 MOng/μΙ Primer U 終濃度為400 n_M Primer L 終濃度為400 nM 災菌蒸傭水 Up to 25 μ1
[0021]PCR產物電泳：1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果；
[0022] PCR產物純化
[002引 每管內加入100μ1PCR-A液，混勻，轉入純化柱內，12000巧m離屯、2min;
[0024]棄收集管內液體，加入700 μ1washing buffer, 12000巧m離屯、2min;
[00巧]棄收集管內液體，加入400 μ1washing buffer, 12000巧m離屯、2min;
[0026] 棄收集管內液體，12000巧m離屯、2min;
[0027] 柱內加入30μ1 70 °C預熱洗脫液，12000巧m離屯、3min;
[002引測序反應
[0029]反應體系：0. 8μ1Bi曲ye+1. 5μ1Bi曲yeSeqBuffer+3μ1 引物+1μ1PCR純 化產物+3. 5μ1 (1地2〇;
[0030] 測序PCR熱循環條件：
[0031] 1)變性的條件，96°ClOsec;
[0032] 5)退火的條件，（首先96°ClOsec，其次50°C5sec，然后60°C4min)X25個循環；
[0033] 6)延伸的條件，60°C 4min;
[0034] 7)4°C保溫；
[0035] 每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度后開始計算；
[0036] 測序產物純化
[0037] 10μ1反應體系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
[0038] 1)每管加入100μ1 100%酒精，或每管加入1μ1 125mM邸TA到管底，或每管加 入1μ1 3MNaAc到管底，然后震蕩混勻，室溫放置15min;
[0039] 2) 10°C，4000巧m離屯、30min，馬上倒置，1200巧m離屯、Imin;
[0040] 3)每管加入100μΙ70%酒精，離屯、15min;5°C，3600巧m離屯、30min，馬上倒置， 1200巧m離屯、Imin;
[0041] 4)室溫揮發凈酒精，加入10μ1Hi-Di化rmamide溶解DM;
[004引W95°C變性5min，4°C保溫4min，加樣上機；
[004引PCR檢測，包括：
[0044] 1)對照孔的設立和檢測重復孔：樣本檢測同時設有對照實驗，包括陰性對照；對 照和樣本均采用復孔.
[004引在N0TC冊基因外顯子3, 4, 11突變位點兩端分別設計一對引物；
[0046]所述引物是N0TC冊-3F和N0TC冊-3R,N0TC冊-4F和N0TC冊-4R,N0TC冊-11F和N0TCH3-11R；
[0047] 所述引物NOTC冊-3F的核巧酸序列為：
[0048]5' -GTTTCCCTGCGTGTTTCTTG-3，，
[0049] 所述引物N0TC冊-3R，的核巧酸序列為：
[0050]5'-GCGGGGTTCTCACATAGTGG-3'，
[0051] 所述N0TC冊-4F引物的核巧酸序列為：
[OOW] 5' -GAGTCTGGAGGGGAGGTAGT-3 '，
[0053] 所述N0TC冊-4R引物的核巧酸序列：
[0054] 5'-AAGGGGGCAAGGATGGTCAC-3,；
[005引所述N0TC冊-11F引物的核巧酸序列為：
[0056]5' -GCGGAGCCTGACCCTCTTGG-3 >，
[0057] 所述N0TC冊-11R引物的核巧酸序列：
[0058] 5'-CTCCAGGTGTGCTGTTTCTGC-3>;
[0059] 所述引物PCR擴增出目的片段模板；
[0060] 所述目的片段的獲取包括：W上述引物分別對人基因組DNA進行PCR擴增得到條 帶單一的目的基因片段；將目的片段稀釋至1萬-10萬倍，終濃度為10-2化g/μ1，作為檢 測陰性對照用；
[0061] 2) 25μ1反應體系檢測：
[0062] PremixTaqPC民Mas化γΜΙΧΙ2.5μ1 DNA模板 l-lOng/μΙ PrimerU 終濃度為400 nM PrimerL 終滾度為400 nM 滅菌蒸饋張 UpU>25.Ld
[0063] 混合均勻；所有樣本混合完后，將ABI Veriti Dx PCR系統儀器中進行程序性檢 測；
[0064] 結果分析及判定：對PCR產物進行測序分析。
[0065] 本發明的另一目的在于提供一種檢測CADASIL致病基因突變的引物，其特征在 于，所述引物序列包括：
[0066]沈QIDN0:15'-GTTTCCCTGCGTGTTTCTTG-3'
[0067]沈QIDN0:25'-GCGGGGTTCTCACATAGTGG-3'
[0068]沈QIDN0:35'-GAGTCTGGAGGGGAGGTAGT-3，
[0069]沈QIDN0:45'-AAGGGGGCAAGGATGGTCAC-3，
[0070]沈QIDN0:55'-GCGGAGCCTGACCCTCTTGG-3'
[0071]沈QIDN0:65'-CTCCAGGTGTGCTGTTTCTGC-3>。
[0072] 本發明的另一目的在于提供一種包括所述引物的檢測CADASIL致病基因突變的 試劑盒。
[0073] 本發明的有益效果為：
[0074] 能對多個突變位點進行同時檢測，也能對分布于多個外顯子的位點進行同時檢 ，簡單、快速、準確、有效的對CADASIL患者的突變類型進行檢測和臨床診斷，利用多種特 異性引物同時對患者可能存在的多個突變位點進行檢測，使用該方法能保證95%W上的疾 病檢出率。其解決了現有技術中進行CADASIL致病基因突變檢測程序繁瑣、費用昂貴、費 時、易污染和靈敏度低等問題，尤其是提供了病理組織之外的非創傷性如血清或血漿等檢 測。
【附圖說明】
[0075] 此處所說明的附圖用來提供對本申請的進一步理解，構成本申請的一部分，本申 請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構成對本申請的不當限定。在附圖中：
[0076] 圖1A是本發明CADASIL致病基因外顯子3的檢測分析結果示意圖；
[0077] 圖1B是本發明CADASIL致病基因外顯子4的檢測分析結果示意圖；
[0078] 圖1C是本發明CADASIL致病基因外顯子11的檢測分析結果示意圖。
【具體實施方式】
[0079] W下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，運些實施例是用于說明 本發明而不限于限制本發明的范圍。實施例中采用的實施條件可W根據具體廠家的條件做 進一步調整，未注明的實施條件通常為常規實驗中的條件。
[0080] 實施例1
[0081]CADASIL的病變基因定位于第19號染色體上的N0TC冊基因，幾乎均發生在 N0TC冊基因編碼EGF樣重復序列的前23個外顯子，突變形式有錯義點突變，缺失突變和剪 切突變。中國大陸CADASIL患者N0TC冊外顯子3,4,11的突變率分別為30%、55%、6%， N0TC冊基因外顯子3