甘藍型油菜sBnFCA-ε基因序列及制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域的基因序列，具體涉及一種甘藍型油菜控制開花相關的 sBnFCA的可變剪接體sBnFCA- ε基因序列及制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 外界環境因素(光周期和溫度）對植物開花的誘導可以使植物在適宜的環境下開 花，但如果缺少這種誘導，有些植物在其營養生長達到一定階段后也會自然開花，說明植物 能夠感知自身的發育狀態，說明自主途徑獨立于光周期和春化途徑之外。由于自主途徑突 變體數量和類型有限，自主途徑基因的研究相對滯后。
[0003] FCA是擬南芥晚花突變體中首先分離出的自主開花途徑重要基因，該基因具有四 個可變剪接體（σ、β、γ和S )，其中只有γ剪接體能編碼具有正常功能的蛋白。國內外 研究者采用同源克隆的方法已在小麥、玉米、大豆、水稻、冬性甘藍型油菜等眾多植物中克 隆到了與擬南芥FCA同源的四個剪接體。
[0004] 甘藍型油菜)是十分重要的油料作物，是國產食用植物油的 第一大來源，在我國食用油市場中具有舉足輕重的地位。有關甘藍型油菜開花相關基因的 研究主要集中于FLC、FRI、CO、FT等少數幾個基因上，但春性甘藍型油菜FCA基因可變剪接 體序列及克隆方法未見報道。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種甘藍型油菜控制開花相關的sBnFCA- ε基因序列。該 基因全長2001bp，編碼區全長為1992bp，編碼664個氨基酸。本發明以源自甘白種間雜交 后代的新型特早熟春性甘藍型油菜86為材料，根據GenBank中已報道的擬南芥FCA的序列 保守區，采用同源克隆的方法分離甘藍型油菜sBnFCA基因，用cDNA-AFLP技術分離花芽分 化不同階段表達的差異片段，尋找控制開花時間的新基因；用RT-qPCR技術檢測已克隆基 因在花芽分化過程中在不同組織(葉和莖尖)的表達水平。為新型特早熟春性甘藍型油菜的 早熟機理研究奠定基礎，為篩選、培育早熟優質油菜新品種提供理論依據和技術支撐。
[0006] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的： 一種甘藍型油菜控制開花相關的可變剪接體sBnFCA-ε序列，所述基因序列如SEQ ID NO. 1第1~2001位所示，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0007] 優選的該基因序列如SEQ ID NO. 1第1~1948位所示。
[0008] 優選的該基因序列如SEQ ID Ν(λ 1第1807~1980位所示。
[0009] 優選的該基因序列如SEQ ID NO. 1第1928~2001位所示。
[0010] 可變剪接體SBnFCA- ε序列的克隆方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： 1.甘藍型油菜組織總RNA的提取。
[0011] 2.以擬南芥FCA的序列保守區作為種子序列，采用同源克隆的方法分離sBnFCA基 因，用cDNA-AFLP技術分離花芽分化不同階段表達的差異片段，將檢索到的目標EST拼接組 裝成甘藍型油菜的可變剪接體sBnFCA-ε序列；根據該序列，設計能夠擴增出全長的基因 特異引物； 如 SEQ ID NO. 3 所示的 sBncFCA-5 ; 如 SEQ ID NO. 4 所示的 sBncFCA-13 ; 如 SEQ ID NO. 5 所示的 sBncFCA-14F。
[0012] 3.以甘藍型油菜組織RNA反轉錄得到的甘藍型油菜cDNA為模板，利用所述基因特 異引物sBnFCA-5, sBnFCA-13和sBnFCA-14F克隆出sBnFCA基因的全長cDNA序列： 如 SEQ ID N0. 6 所示的 sBncFCA-5 cDNA ; 如 SEQ ID NO. 7 所示的 sBncFCA-13 cDNA ; 如 SEQ ID NO. 8 所示的 sBncFCA-14F cDNA。
[0013] 甘藍型油菜控制開花相關的sBnFCA基因序列在制備甘藍型油菜品種中的用途 為：采用基因工程手段或者基因干擾方法，調控所述基因序列的表達水平，進而引起甘藍型 油菜開花調控機制的變化，獲得開花時間不同的甘藍型油菜品種。
[0014] 本發明運用生物信息學手段，通過同源序列比對設計出基因特異引物，用分子克 隆的方法，克隆出甘藍型油菜控制開花相關的sBnFCA基因；經過序列分析，確定是甘藍型 油菜sBnFCA基因；組織表達分析表明，sBnFCA在不同組織中均有表達，但表達量具有組織 差異性。
[0015] 本發明具有的有益效果為：在sBnFCA基因的研究上，還可以繼續利用相關序列信 息擴增出sBnFCA基因的全長DNA序列，利用轉基因、基因干擾以及基因敲除等技術分析其 對油菜開花早晚的影響。也可以研究sBnFCA基因在響應生物節律鐘信號上的作用機制，同 時結合育種技術獲得適宜的早晚熟材料，為甘藍型油菜的生產提供理論和實踐的指導。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發明可變剪接體sBnFCA- ε與已知基因的比對； 圖2為本發明sBnFCA- ε推測的蛋白質三級結構示意圖； 圖3為本發明sBnFCA- ε基因在甘藍型油菜植株不同組織中表達量示意圖。
[0017]
【具體實施方式】： 下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細說明： 實施例1 甘藍型油菜sBnFCA- ε的gDNA全長序列克隆 1.甘藍型油菜實驗材料取材 以甘白種間雜交后代的新型特早熟春性甘藍型油菜86為材料。
[0018] 2.提取甘藍型油菜組織總RNA 3.甘藍型油菜sBnFCA-ε基因的克隆 (1)用甘藍型油菜86基因組DNA為模板，以特異性引物sBnFCA-5, sBnFCA-13和 sBnFCA-14F進行克隆，測序，比對，拼接。
[0019] (2)用甘藍型油菜86的RNA反轉錄產物第一鏈為模板，以特異性引物sBnFCA-5， sBnFCA-13和sBnFCA-14F進行克隆，測序，比對，拼接。結果見圖1。
[0020] (3)對克隆到的各基因序列進行分析。
[0021] 通過結合電子克隆技術的同源克隆方法得到甘藍型油菜控制開花相關的 sBnFCA- ε基因序列。該基因 RNA全長1995bp，編碼區全長為1989bp，sBnFCA-5編碼區序 列 SEQ ID. NO. 1。
[0022] 表1本發明基因克隆所用引物
基因的表達模式分析 1.基因的時空表達 利用 real-time relative quantification PCR(RT-qPCR)技術檢測目的基因在不同 發育階段不同組織中的表達水平。以sBnFCA - γ為內參，用特異性引物sBnFCA-ε-qRT檢 測sBnFCA- ε在不同發育階段的根、莖、葉、花、蕾等組織中的表達水平。
[0023] sBnFCA基因在甘藍型油菜植株不同組織中表達量見圖3。結果顯示：sBnFCA- ε 在甘藍型油菜根、莖、頂端分生組織（莖尖）和葉中均有表達，但在不同組織中表達量不同； sBnFCA-ε在甘藍型油菜苗期、蕾期和花期均有表達，但在不同生長期表達量不同；該基因 在蕾期表達水平最高，顯著高于其它各生長期；莖尖中表達量顯著低于其他各組織。
[0024] 2.對克隆到的sBnFCA-ε基因表達產物的氨基酸序列和蛋白質結構進行分析，推 測其功能部位。
[0025] sBnFCA-ε基因編碼662個氨基酸，推導蛋白序列見SEQ ID. Ν0. 2,推導蛋白質三 級結構見圖2。
【主權項】
1. 一種甘藍型油菜控制開花相關的可變剪接體sBnFCA-ε序列，其特征在于，該基因 編碼的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。2. -種甘藍型油菜控制開花相關的可變剪接體sBnFCA-ε序列，其特征在于，所述基 因序列如SEQIDNO. 1第1~2001位所示。3. -種甘藍型油菜控制開花相關的可變剪接體sBnFCA-ε序列，其特征在于，所述基 因序列如SEQIDNO. 1第1~1948位所示。4. 一種甘藍型油菜控制開花相關的可變剪接體sBnFCA-ε序列，其特征在于，所述基 因序列如SEQIDNO. 1第1807~1980位所示。5. -種甘藍型油菜控制開花相關的可變剪接體sBnFCA-ε序列，其特征在于，所述基 因序列如SEQIDNO. 1第1928~2001位所示。6. -種如權利要求1所述的可變剪接體sBnFCA-ε序列的克隆方法，其特征在于，所述 方法包括如下步驟： 1) 甘藍型油菜組織總RNA的提取； 2) 以擬南芥FCA的序列保守區作為種子序列，采用同源克隆的方法分離sBnFCA基因， 用cDNA-AFLP技術分離花芽分化不同階段表達的差異片段，將檢索到的目標EST拼接組裝 成甘藍型油菜的可變剪接體sBnFCA-ε序列；根據該序列，設計能夠擴增出全長的基因特 異引物； 如SEQIDNO. 3 所示的sBncFCA-5 ; 如SEQIDNO. 4 所示的sBncFCA-13 ; 如SEQIDNO. 5 所示的sBncFCA-14F; 3) 以甘藍型油菜組織RNA反轉錄得到的甘藍型油菜cDNA為模板，利用所述基因特異引 物sBnFCA-5,sBnFCA-13 和sBnFCA-14F克隆出sBnFCA基因的全長cDNA序列： 如SEQIDNO. 6 所示的sBncFCA-5cDNA; 如SEQIDNO. 7 所示的sBncFCA-13cDNA; 如SEQIDNO. 8 所示的sBncFCA-14FcDNA。7. -種如權利要求1所述的甘藍型油菜控制開花相關的sBnFCA基因序列在制備甘藍 型油菜品種中的用途，其特征在于，所述用途為采用基因工程手段或者基因干擾方法，調控 所述基因序列的表達水平，進而引起甘藍型油菜開花調控機制的變化，獲得開花時間不同 的甘藍型油菜品種。
【專利摘要】本發明涉及生物技術領域的基因序列，具體涉及一種甘藍型油菜控制開花相關的sBnFCA的可變剪接體sBnFCA-ε基因序列。所述序列編碼SEQ？ID？NO.2所述的氨基酸序列。在sBnFCA基因的研究上，可以繼續利用相關序列信息擴增出sBnFCA-ε基因的全長DNA序列，利用轉基因、基因干擾以及基因敲除等技術分析其對油菜開花早晚的影響。也可以研究sBnFCA-ε基因在響應生物節律鐘信號上的作用機制，為新型特早熟春性甘藍型油菜的早熟機理研究奠定基礎，為篩選、培育早熟優質油菜新品種提供理論依據和技術支撐。
【IPC分類】C12N15/29, C12N15/10, C07K14/415, A01H5/00
【公開號】CN105316347
【申請號】CN201510887654
【發明人】羅玉秀, 羅春燕, 杜德志, 趙志剛, 李小安, 姚艷梅, 張生萍
【申請人】青海大學
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年12月4日