專利名稱：針對tweak及tweak受體的拮抗劑和它們在治療免疫性疾病中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及組合物和方法，其中包括結合新蛋白TWEAK的制劑，本發明還涉及TWEAK結合制劑在阻斷免疫性疾病的發生(development)中的應用。TWEAK結合制劑包括單克隆抗體，其在本發明中用于阻斷慢性移植物抗宿主疾病的發生；可溶性TWEAK-受體-Ig融合蛋白或修飾TWEAK同其受體結合的其它分子。本發明的其它實施方案包括與TWEAK受體結合以修飾它們的活性或修飾它們的細胞內信號傳導的制劑。
背景技術：
免疫性疾病表現為多種疾病和病理狀態，包括自身免疫病、急性和慢性炎癥、器官移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVHD)、淋巴細胞惡變、敗血癥和其它形式的休克、見于HIV和SCIDS中的免疫應答能力的喪失、和對腫瘤生長的免疫應答失敗。
許多免疫性疾病由對抗原的異常或無控制的應答引起。自身免疫性疾病是由免疫系統對自身抗原不適當的反應造成的，結果導致細胞和組織的損害。當來自骨髓移植物(BMT)的供體細胞同宿主(即病人)的抗原發生反應時，GVHD發生。當病人的免疫系統同來自移植器官的抗原反應時器官移植排斥發生。急性炎癥反應例如超敏狀態和休克是對激發抗原無控制的免疫應答的結果。
T細胞依賴性免疫應答需要T細胞對抗原的識別。例如，GVHD是由供體T細胞同宿主免疫細胞間復雜的相互作用所引起的。首先發生的是供體T細胞對非自身即宿主抗原的識別。這些抗原被稱為同種異體抗原。供體細胞對同種異體抗原的識別導致免疫調節性和炎性細胞因子及趨化因子的產生，它們提高和加速供體抗宿主的免疫應答。這種疾病的發生可以是急性的或慢性的，這取決于控制免疫應答類型的細胞因子復雜網絡的調節作用。免疫應答可被鑒定為Th0、Th1或Th2，其依據1〕免疫應答過程中活化T細胞產生的細胞因子和趨化因子的性質2〕免疫應答過程中輔助細胞和其它細胞產生的細胞因子和趨化因子的性質。免疫應答過程中重要的非T細胞是B細胞、樹突細胞、單核細胞和巨噬細胞、濾泡樹突細胞和內皮細胞。所產生的細胞因子共同影響多種細胞類型的分化；所產生的趨化因子影響細胞的游走和定位。Th0應答的特點是此前未受過刺激的(初始的)T細胞受到短暫的刺激。Th0細胞產生中等量的多種細胞因子，其中，典型的是IL-2和TNF。在多種因素作用下，Th0細胞受到反復或慢性刺激后可分化成Th1或Th2細胞。這些因素包括但不限于輔助細胞細胞因子的產生、T細胞受體的參與程度和接受的第二信號如通過CD28共刺激受體傳遞的信號的性質。具體地，活化T細胞同最初由活化巨噬細胞產生的IL-12的接觸支持其向Th1細胞的分化，而同IL-4和IL-10的接觸支持其向Th2細胞分化。
Th1細胞產生與炎癥反應、T細胞細胞毒作用和巨噬細胞活化有關的細胞因子如IL-2和IFN-γ。Th1 T細胞同吸引細胞進入組織炎癥部位的趨化因子如Mip-1α、MIP-1β、RANTES、IP-10和MIG反應。因為細胞毒性T細胞和活化巨噬細胞有清除損傷和感染的細胞的作用，所以Th1應答負責控制對細胞內病原體的免疫應答。重要的是，巨噬細胞和內皮細胞中象IP10和MIG這樣的Th1趨化因子的產生受IFN-γ的密切調節，而IFN-γ即是Th1T細胞產生的典型的趨化因子。這樣，反饋環路便可在活化T細胞和它們的環境之間形成，反饋環路的形成促進了在特定時間和部位特定類型免疫應答的發生。
Th2 T細胞產生細胞因子如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，這些細胞因子有助于體液免疫應答的產生，包括需要IgE、IgA和IgG產生的體液免疫應答。這些Ig應答由T細胞介導的B細胞的活化引起，B細胞的活化即是將B細胞的Ig表型由表面結合型IgM和IgD“轉換”成分泌型Ig。正常情況下，分泌型Ig控制來自循環中的病原體的感染(IgG)、粘膜表面如腸道和口腔的感染(IgA)和呼吸道的感染(IgE)。Ig的過量產生可導致疾病，如SLE(IgG和IgA)、超敏反應(I型)(IgE)和GVHD(IgG、IgA和IgE)。Th2 T細胞也有助于那些介導對病原體產生急性應答(如在呼吸道中)的嗜酸性粒細胞和肥大細胞的活化。Th2 T細胞對趨化因子如eotaxin和MDC產生反應，這些趨化因子的產生受IL-4緊密調節，而IL-4是NK1.1和活化T細胞產生的典型的細胞因子。
T細胞和B細胞的相互作用是一個復雜的和受到精密調節的過程。為了開始活化過程，B細胞必須接受通過B細胞抗原受體(膜Ig)傳遞的抗原信號。繼而，B細胞須接受來自活化T細胞的特異性接觸依賴性和接觸非依賴性信號。其中一種所需的接觸依賴性信號通過T細胞表面CD40L和B細胞表面CD40的結合而傳遞；另一種所需的接觸依賴性信號通過活化T細胞和NK1.1細胞分泌的IL-4同B細胞表面IL-4受體的結合而傳遞。這些信號似乎出現在二級淋巴器官如脾臟的T細胞區域。脾臟、淋巴結、扁桃體、Peyer′s淋巴集結和其它二級和三級淋巴器官中有明顯的T細胞和B細胞定居的微解剖區。首先，通過跨越內皮細胞層如淋巴結和Peyer′s淋巴集結的高內皮小靜脈和脾臟的邊緣竇內皮細胞層，所有的淋巴細胞從血液或淋巴液中游出，進入這些器官的T細胞區域。然后，B細胞運動到稱為B細胞濾泡的B細胞區。穿越T細胞區后未活化B細胞幾天后離開濾泡。活化B細胞經歷一個分化的過程。一些稱為漿細胞的活化B細胞分泌大量抗原特異性、低親和力IgM或IgG抗體。這些B細胞通常在誘導免疫應答后的早期出現，然后轉移到脾臟的紅髓和其它解剖學部位，隨后的幾天它們在那里停留、分泌抗體。其它活化B細胞在被稱為次級濾泡或生發中心的濾泡部位分化。生發中心在稱為濾泡樹突細胞(FDC)的特異性抗原滯留細胞的網絡周圍形成，這些FDC提呈抗原以驅動或精神調節生發中心的反應。在生發中心中，B細胞轉換了它們的Ig表型并且經歷了“親和力成熟”的過程，因此，可對它們的抗原靶呈現很高的親和力。盡管在某些疾病如慢性GVHD和自身免疫性疾病中Ig識別自身抗原，但在正常情況下，抗原靶是外來抗原。最后，B細胞離開濾泡，再次通過T細胞區，通過輸出循環離開此器官進入血流。
已完全分化因而表達高親和力Ig的B細胞稱為母細胞，它們離開B細胞濾泡定居在其它各種環境中，包括脾臟的紅髓、骨髓、肝臟、或呼吸道和腸道的內壁粘膜層。這些完全分化的B細胞中有一部分稱為記憶細胞，它們能存活很長時間，如果再次遇到相同抗原，它們會迅速作出反應。
B細胞在淋巴器官中從一個部位向另一部位遷移需要特異性信號指導它們和保證它們存活。例如，脾臟中B細胞濾泡的組織需要多種信號。這些包括BCA配體與趨化因子BLR-1受體之間的相互作用、TNF與TNF-R55之間的相互作用和LTβ與LTβ-R之間的相互作用(參見Chaplin和Fu，最新免疫學觀點(Current Opin.Immunol.)10298-297(1998))。缺乏這些分子途徑中的任何一種的小鼠都將會喪失脾臟中B細胞濾泡的完整性。此外，所有這些基因缺陷型小鼠也喪失了在脾臟中經歷生發中心反應的能力。對其它分子途徑的阻斷僅僅影響生發中心反應。如，CD40L缺陷的小鼠保存了B細胞濾泡，但生發中心未形成。生發中心環境中的B細胞需要通過CD40的信號維持存活、下調IgM和轉換Ig的表達。
B細胞不但在濾泡和生發中心中移動，而且活化后離開濾泡，移向身體的其它部位。在骨髓中能發現記憶B細胞，并且，表達IgA的B細胞特異地移向腸道和其它粘膜部位的細胞層。其它信號可能指導活化T細胞到達淋巴區室內和淋巴區室之間的特定部位。例如，細胞毒性T細胞能遷移到感染或其它發現有抗原攻擊的部位，并且溶解它們的靶目標。指導不同微解剖部位之間T和B細胞的所有信號的一致性尚不為人知。但在二級淋巴器官和感染或炎癥部位似乎有多種途徑協調T和B細胞對抗原的應答。
GVHD是抗原驅動免疫應答的很好的研究例證。GVHD是人類患者骨髓移植(BMT)常見的致命后果。此疾病可為急性或慢性。GVHD急性和慢性形式分別是抗原特異性Th1和Th2應答的典型實例。此疾病的急性形式發生在BMT后的最初二個月內，以供體細胞毒T細胞介導的皮膚、腸道、肝臟和其它器官的損傷為其特點。此疾病的慢性形式出現較晚(BMT后100天以上)，以免疫球蛋白(Ig)包括自身抗體的過量產生，以及Ig沉積引起的皮膚、腎臟和其它器官的損傷為其特點。急性GVHD的產生可以預見其隨后的慢性GVHD的發生。因而，同一病人可先后產生這兩種疾病。大約50％BMT病人發生急性或慢性GVHD。近90％的急性GVHD病人發展為慢性GVHD。目前對大多數病人中慢性GVHD的治療方法都未獲成功。
GVHD可用親代至F1代細胞移植方案構建小鼠模型。在此處描述的模型中，將來自DBA2小鼠的脾細胞靜脈注入稱為B6D2F1的(DBA2xC57B1/6)F1代小鼠體內。注入的脾細胞構成移植物，DBA2是該移植物的供體。接受移植物的F1小鼠是宿主。移植物中的供體T細胞將宿主細胞上MHC標志物的一半(單體型)識別為異物，因為它們來源于親代C57B1/6。這引發了供體T細胞對宿主的應答，導致GVHD的發生。當DBA/2親代脾細胞注入B6D2F1宿主體內時，慢性GVHD發生。相反，當C57B1/6脾細胞注入B6D2F1宿主體內時，急性GVHD發生。盡管使用這兩種注射方案引起不同疾病的內在機制尚不清楚，但人們相信包含在DBA/2脾細胞移植物中的細胞表達的細胞因子易于使慢性GVHD的發生；包含在C57B1/6脾細胞移植物中的細胞表達的細胞因子易于使急性GVHD的發生。干擾T細胞與抗原提呈細胞(樹突細胞、巨噬細胞、B細胞APC)相互作用的制劑能有效地阻斷急和慢性GVHD。
多組證據提示急性GVHD是Th1介導的疾病(Krenger和Ferrara，免疫學研究(Immunol.Res.)1550-73(1996)；Willianson等，免疫學雜志(J.Immunol.)157L689-699(1996))。CD4+和CD8+T細胞、自然殺傷(NK)細胞、和活化粒細胞如巨噬細胞的細胞毒活性是Th1介導的T細胞應答的很明確的結果，并且呈現對IL-2和IFN-γ表達的特征性依賴，IL-2和IFN-γ是典型的Th1細胞因子。這種細胞毒作用是急性GVHD的一個明確特征。此外，阻滯涉及Th1 T細胞分化的關鍵性細胞因子的制劑，如針對IL-2和IL-12的mAb，可以阻斷急性GVHD的發生。細胞毒作用可以直指細胞(如通過宿主細胞的吞噬作用)或者通過分泌的細胞因子如能導致凋亡或細胞死亡的TNF的作用來實現。供體抗宿主細胞毒作用的后果表現為多種形式。首先，宿主淋巴細胞被迅速破壞，導致患急性GVHD的小鼠的深度免疫抑制。第二，供體淋巴細胞移入宿主脾臟中并擴增，而且它們的細胞毒作用可以在體外利用表達被供體細胞識別為異己的宿主抗原的細胞系直接檢測。例如，表達合適抗原的細胞系可以用放射性鎘51同位素標記。培養基中該放射性同位素的釋放是被標記細胞死亡的證據。第三，當其它組織和細胞群也遭到破壞時，此疾病即向危重演變，所以，是否存活是此疾病的可預測的后果。
慢性GVHD傾向于是Th2 T細胞介導的疾病(De Wit等，免疫學雜志(J.Immunol.)150361-366(1993))。在小鼠模型中，此疾病的發生依賴于Th2細胞因子IL-4，并且用抗IL-4的mAb處理能阻斷其發生。這樣處理也能阻斷宿主B細胞的擴展和伴隨的高Ig產生。GVHD可以以多種方式隨后出現。供體T細胞和宿主B細胞群的擴展可以通過脾指數測定，脾指數是脾重與體重的比值，用對照(無疾病的)小鼠校準。疾病小鼠的B細胞活化可以利用對B細胞活化標志物的分析檢測。最后，B細胞活化效應可以通過循環中(即血清中)的Ig水平或誘導疾病的幾周后收獲的宿主脾細胞培養液中產生的Ig水平觀察到。發病動物的循環Ig將包含抗自身的抗體。最終，發病動物由于累積的Ig沉積而導致腎臟和其它器官的衰竭，并因此使存活性成為疾病活動的相關指標。
在本發明中，我們用慢性GVHD小鼠模型展示了TWEAK特異性單克隆抗體能有效和特異地阻斷GVHD的發生。在經過抗-TWEAK治療的動物體內，脾指數的降低、宿主B細胞活化標志物的丟失和Ig產量的下降提示慢性GVHD的發生受到阻斷。
發明概述本發明提供阻斷動物體內免疫性疾病產生或處理或降低其嚴重程度或影響的方法，其包括投放包含治療有效量的TWEAK阻滯劑和可藥用載體的藥物組合物。此組合物可以是直接針對TWEAK配體的抗體；直接針對TWEAK受體的抗體；修飾TWEAK受體與配體結合的制劑；修飾細胞表面受體集聚的制劑；能阻斷TWEAK受體細胞內信號傳導的制劑。在優選實施方案中，抗體是單克隆抗體。在更優選實施方案中，單克隆抗體直接針對TWEAK表面配體。使用的動物可以是哺乳動物和人。TWEAK阻滯劑可以是可溶性的TWEAK受體，其有一個能選擇性地與表面TWEAK配體相結合的配體結合區域。在一個實施方案中，可溶性TWEAK受體可以包括一種人免疫球蛋白IgG區。在一個優選實施方案中，人的免疫球蛋白IgG區包括特異性抗原結合區。
本發明進一步包括抑制動物體內免疫應答的方法，該方法包括投放包含治療有效量的TWEAK阻滯劑和可藥用載體的藥物組合物。免疫應答可以是Th1或Th2介導的免疫應答或同時發生這兩種免疫應答。
本發明也包括含有治療有效量的TWEAK阻滯劑和可藥用載體的組合物。
附圖簡述

圖1顯示可溶性重組小鼠和人TWEAK蛋白的序列對照。
圖2顯示對倉鼠抗TWEAK mAb AB.D3與表達小鼠TWEAK蛋白或人TWEAK蛋白的EBNA293細胞結合的熒光活化細胞篩選(FACS)分析結果，其與識別非相關蛋白(匙孔_血藍蛋白，Keyhole Limpey Hemocyanin)的倉鼠mAb的結合作用比較。
圖3顯示對mAb AB.D3阻斷FLAG標記的重組可溶性人TWEAK與TWEAK受體陽性細胞結合的作用的FACS分析結果。
圖4顯示用抗TWEAK mAb AB.D3、抗CD40L mAb MR1、對照mAb處理的或未經任何處理的慢性GVHD小鼠體內B細胞活化狀態的FACS分析結果。
發明詳述定義為了能完全理解此處描述的發明，進行以下詳細說明。
本發明中術語“體液應答”和“細胞應答”是指動物對抗原的免疫應答，表現為動物產生針對抗原的抗體或對抗原產生細胞毒應答或兩者兼有。Th1類T輔助細胞對細胞應答的誘導是重要的，而Th2類T輔助細胞對高親和力抗體的有效產生是重要的。
本發明中使用的術語“T輔助(Th)細胞”是T細胞的一個功能亞群，其輔助產生細胞毒性T細胞，并且與B細胞合作刺激抗體產生。T輔助細胞識別與MHC II類分子相結合的抗原，并且對效應細胞提供接觸依賴和接觸非依賴性(細胞因子和趨化因子)信號。
術語“Th1”是T輔助細胞的一個亞類，其產生TNF、γ干擾素和IL-2(和其它細胞因子)，引發與細胞性(即非免疫球蛋白)應答有關的炎癥反應。
術語“Th2”是T輔助細胞的一個亞類，其產生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和其它細胞因子，它們與針對免疫攻擊的免疫球蛋白(體液)應答有關。
本發明中使用的術語“生發中心”是指抗原免疫后形成的二級B細胞濾泡。該組織學位點的出現與最佳記憶的產生、同種型轉換、體細胞高變和因此的抗體應答的親和力成熟有關。
術語“抗體產生細胞”是指獲得來自Th細胞的接觸依賴和接觸非依賴信號并分泌免疫球蛋白IgM、IgG、IgA或IgE的B細胞。
術語抗體的“Fc區”是指抗體分子中包含鉸鏈區、CH2和CH3區，但不包括抗原結合部位的部分。此術語也包括IgM或其它抗體同種型的等價區域。
術語“抗TWEAK抗體”是指能與TWEAK蛋白至少一個表位特異結合的任何抗體。
術語“抗TWEAK受體抗體”是指能與TWEAK受體至少一個表位特異結合的任何抗體。
術語“TWEAK受體信號傳導”是指與TWEAK受體途徑和其導致的下游反應有關的分子反應。
術語“TWEAK或TWEAK受體修飾劑”是指能修飾配體與TWEAK受體的結合、能修飾細胞表面TWEAK受體集聚或TWEAK受體信號傳導、或能影響TWEAK受體細胞內信號傳導中止方式的任何制劑。
術語“TWEAK配體”或“TWEAK蛋白”是指能與TWEAK受體特異性結合的TWEAK的任何單聚體、多聚體或異源多聚體復合物或它們的衍生物。
術語“實驗對象”是指一種動物或來源于一種動物的一種或多種細胞。優選所述動物為哺乳動物。細胞可以是任何形式的，包括但不限于存留在組織中的細胞、細胞集聚物、永生化的細胞、轉染或轉化的細胞和來源于在物理(physically)和表型方面已改變了的動物的細胞。
TWEAK配體TWEAK是近來發現的TNF蛋白家族成員(Chicheportiche等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)5132401-32410(1997))。TNF蛋白家族成員與TNF受體(TNF-R)家族中蛋白的受體結合。TNF家族蛋白與它們的受體之間的作用影響免疫系統的許多功能。人們熟知的實例包括CD40L蛋白，其結合CD40受體從而促進B細胞分化成為抗體產生細胞(Grewal和Flavell，免疫學研究1657-70(1997))；淋巴毒素-β配體(LT-β)，其與淋巴毒素β受體結合，通過調節濾泡樹突細胞的分化狀態影響體液免疫應答(Mackay和Browning，自然39526-27(1998))，和OX40L，其結合OX40受體以調節B細胞對T細胞信號的應答(Flynn等，實驗醫學雜志188297-304(1998))。TNF/TNF-R家族中人們熟知的在免疫系統中起重要作用的其它配體/受體對包括TNF/TNF-R55、FasL/Fas和CD27/CD70。
至今人們只了解TWEAK生物學的部分內容。純化的可溶性TWEAK蛋白可用于誘導一些腫瘤細胞系的分化和/或死亡。這些腫瘤細胞系包括HT29腺癌細胞(細胞通過凋亡過程死亡)、HeLa子宮頸癌細胞(形態學的改變)和A375黑色素瘤細胞(抗增殖)。TWEAK還可誘導HT29和A375細胞系分泌趨化因子IL-8，并且對成纖維細胞系WI-38也有相同作用(Chicheportiche等，生物化學雜志5132401-32410(1997))。另外，TWEAK也可誘導多種正常內皮細胞系的增殖(Lynch等，干擾素細胞因子研究雜志(J.InterferonCytokine Res.)18A-46(1998))。
已有人描述了一種假定的TWEAK受體(Marsters等，當代生物學(Curr.Biol.)8525-528(1998))。此受體可稱為TRAMP、Apo3、WSL-1、DR-3、或LARD，是TNF-R家族的一個成員。TRAMP的活化能通過參與級聯反應依賴性細胞死亡信號傳導途徑或經由NF-kB信號途徑的細胞活化誘導凋亡(Ashkwnazi和Dixit，科學2811305-1308(1998))。
TWEAK在小鼠和人組織中廣泛表達，在其它組織例如心臟、大腦、肺、肝臟中、在二級淋巴器官如脾臟、淋巴結中和外周血淋巴細胞(PBMC)中已發現其信使RNA(mRNA)。在免疫系統細胞發育地初級淋巴器官如胸腺、骨髓和胎肝臟中未見TWEAK表達。因此，TWEAK在免疫系統中的作用可能表現在免疫應答方面而不是表現在免疫系統的發育方面。
蛋白配體和它們的受體之間的相互作用可通過許多特定的方式修飾。例如，特異識別配體的單克隆抗體可以通過識別結合部位或通過生理性干擾配體和受體之間的相互作用阻斷或修飾配體和受體的結合。另一方面，當多種配體對應一個受體時，抗-配體mAb可通過影響它與其它配體的結合而影響受體的信號傳導。已發現B7家族CD28配體的mAb存在這樣復雜的作用(Lenschow等，實驗醫學雜志1811145-1155(1995))。在一種特定配體存在多種受體的系統中，抗-配體mAb可通過例如，修飾與一種配體結合的受體，而使與另一種受體結合的配體保持不變而發揮更復雜的效應。識別所述受體的mAb也可以用來修飾配體的結合，或它們自身也可誘導或修飾受體的信號傳導。因此，抗-受體mAb可以用作拮抗劑或激動劑。用來在人或小鼠多系統中修飾TNF/TNF-R家族成員中配體/受體相互作用的mAb包括特異性針對TNF、CD40L、LT-β、Fas-L和TR2/HVEM的mAb。MAb可用來阻斷免疫性疾病和其它疾病的發生或發展。例如，抗-CD40L可在系統性紅斑狼瘡(SLE)的治療中應用，以及用于控制器官移植失敗。
把編碼受體細胞外部分的序列克隆到編碼人免疫球蛋白(Ig)重鏈的序列上，然后在適當的細胞系中用適當的基因啟動子表達此雜交基因，也可以產生配體/受體相互作用的有效抑制物。純化的受體-Ig融合蛋白在體內和體外可用于結合現有蛋白配體，進而修飾該配體與天然的細胞結合的受體之間的相互作用。修飾作用可通過多種機制產生，這與上述抗-配體mAb的情況相似。在小鼠或人的系統中修飾TNF/TNF-R家族成員的配體/受體相互作用的受體-Ig融合蛋白有TNF-R55-Ig、TNF-R75-Ig、LTβ-R-Ig和OX40-Ig等。受體-Ig融合蛋白能用來阻斷免疫性疾病或其它疾病的發生或發展。例如，TNF-R75-Ig已用來治療炎性Bowel病(IBD)。
在本發明中我們證實特異地結合小鼠和人TWEA的mAb可阻斷一種典型的抗原引發的免疫性疾病-移植物抗宿主疾病(GVHD)的發生。我們的發明預示TWEAK和TWEAK受體修飾劑在治療外源抗原進入病人體內所導致的多種免疫性疾病，如骨髓或干細胞移植引起的GVHD，和移植物排斥引起的器官移植失敗中的應用。此發明進一步預示TWEAK和TWEAK受體修飾劑在治療各種自身免疫性疾病中的應用，所述疾病如SLE、特發性血小板減少性紫癜、Wegener′s肉芽腫病、結節性多動脈炎、視網膜葡萄膜炎、急性進行性新月形腎小球腎炎、類風濕性關節炎、多發性硬化癥和潰瘍性結腸炎等。其它預示的應用包括治療急慢性炎癥如過敏性炎癥、哮喘、嗜酸性粒細胞增多癥、Graves′病和Chagas′病等。
材料和方法小鼠6到8周齡的雌性DBA/2、C57B1/6小鼠和(DBA/2×C57B1/6)的F1代雜交小鼠購自Jackson實驗室(Bar Harbor，ME USA)，常規保護條件下圈養，根據慣例處理。
單克隆抗體 識別人和小鼠TWEAK蛋白的單克隆抗體在美國倉鼠體內用可溶性人TWEAK蛋白制成，可溶性人TWEAK蛋白是用桿狀病毒制成并依照Chicheportiche等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)(1997)5132401-32410所述純化的。第一次免疫，每只倉鼠腹膜內注射在弗氏完全佐劑(CFA)中的50μg TWEAK。隨后的各次免疫(首次免疫后的14、28、42天)每只倉鼠腹膜內注射在弗氏不完全佐劑(IFA)中的50μg TWEAK(14和28天)或33μg TWEAK。用不含佐劑的100μg TWEAK腹膜內注射進行脾細胞融合形成雜交瘤前的最后一次免疫。應用標準方法生成雜交瘤(Lerner，Yale，耶魯生物醫學雜志54387-402(1981))。
產生抗鼠CD40L mAb MR1的雜交瘤(Noelle等，美國國家科學院院報896550-6554(1992))購自ATCC(Rockville，MD USA)。產生抗-KLH mAbHa4/8的雜交瘤從Dr.Mendrick(人類基因組科學有限公司Rockville，MDUSA)獲得。
Mab活性的ELISA分析 抗人TWEAK mAb結合人和小鼠TWEAK的能力可以通過多種實驗檢測。抗人TWEAK的幾種mAb在用ELISA檢測法進行最初的篩選時發現其也識別小鼠TWEAK蛋白。小鼠TWEAK蛋白用與Chicheportiche等，生物化學雜志5132401-32410(1997)中所述的人TWEAK蛋白生成的相同方法在桿狀病毒中產生。用純化的人和小鼠TWEAK蛋白包被96孔板，檢測各種倉鼠mAb與這些已固定的蛋白的結合能力。用過氧化物酶偶聯的驢抗倉鼠IgG(Jackson免疫研究，West Grove，PAUSA)和相應依賴過氧化物酶的酶反應觀察固定的TWEAK蛋白對倉鼠mAb的捕獲。
MAb活性的FACS分析 可溶性TWEAK蛋白可誘導HT29細胞的凋亡，這提示這些細胞表達TWEAK受體(Chicheportiche等，生物化學雜志5132401-32410(1997))。檢測純化的mAb(10μg/ml)對FLAG標記的鼠或人TWEAK與HT29細胞結合的阻斷能力，這通過生物素化的抗FLAG抗體、鏈親和素-過氧化酶和適當的酶底物來檢測。
慢性GVHD的誘導 將6到8周齡的DBA/2和B6D2F1雌性小鼠處死，用無菌技術取脾。將該器官在粗燥的玻片之間輕輕研磨，使大塊組織碎片沉降，制備成單個細胞懸液，然后沉淀已澄清的上清液。將此細胞沉淀重新懸浮在Gey′s緩沖的高滲溶液中，再冰浴3分鐘溶解紅細胞。每個被粉碎的脾臟加5ml Gey′s液。重新沉淀細胞溶液，將其重新懸浮在無菌、無致熱原的PBS中，再次沉淀，并重懸于無菌、無熱原質的PBS中。用血球計數器測定細胞數量，調細胞密度至2X108/ml。使該溶液濾過70μm的細胞濾器，將其保存在冰上直至使用。6-8周齡的B6D2F1雌性小鼠用作接受者。給每個接受者尾靜脈注射800μl(18)細胞。實驗組接受DBA/2移植物(DBA/2＞F1)；對照動物組接受B6D2F1移植物(F1＞F1)。注射的14天后檢測動物的慢性GVHD的產生。
對慢性GVHD的阻斷 小鼠接受抗TWEAK mAb AB.D3、抗CD40LmAb MR1、對照mAb Ha4/8的處理或不接受任何處理。治療的時間安排是移植物注射之4小時前以及之后的2、4和6天每次腹膜內注射mAb 250μg。
對疾病發生情況的檢測 實驗的第14天，處死小鼠并稱重。然后無菌技術取脾并稱重。依照脾重比體重的比值計算對照F1＞F1組每個動物的脾指數，計算后取一個均值。其它組的平均脾指數用對照值校正。依照前述方法分離這些脾臟中的脾細胞，在無菌PBS中稀釋到1×107細胞/ml的濃度。染色100μl細胞的下列細胞表面標志以便FACS分析。所述所有mAb均購自Pharmingen(San Diego，CA.USA)。鏈親和素試劑購自南方生物技術公司(Birmingham，AL.，USA)。脾細胞用生物素化抗-H-2Kb染色，H-2Kb是區別供體細胞(H-2Kb-)和宿主細胞(H-2Kb+)的一種單體型標志，它通過與直接偶聯的FITC或PE標記的抗-CD4、抗-CD8、抗-B220、抗-CD69、抗-I-Ad、抗-L-選擇素、抗-H2Dd在包含阻斷Fc受體非特異結合的10μg/ml FcBlocktm(Pharmingen)的PBS/0.5％牛血清白蛋白(BSA)/0.1％疊氮納(FACS緩沖液)中的不同組合來實施所述區別。將細胞與mAb在冰上孵育1小時。然后將每個標本重懸在2ml FACS緩沖液中，洗滌，離心以沉淀細胞。將細胞重新懸浮在包含CyChrome標記的鏈親和素的FACS緩沖液中，其中鏈親和素與生物素化的mAb結合而為FACS分析提供第三條途徑。最后一次洗滌后，用FACS掃描儀和Cellquest軟件(Becton Dickenson，San Jose，CA.USA)分析。
使細胞沉淀，將其以1×107細胞/ml的濃度重新懸浮在包含10％胎牛血清(FBS)/4mM谷氨酰胺的DMEM中，進行Ig分泌的體外分析。6孔培養板中每孔加入1ml，24小時后收集細胞上清液。
抗-TWEAK抗體的來源 在本發明的一個實施方案中，直接針對TWEAK的抗體(Ab)行使TWEAK阻滯劑的功能。可針對TWEAK蛋白可能的單體型、雙體型或三體型產生Ab，而不管它們是否包含異源亞單位。此外，可以針對TWEAK蛋白的可溶型、突變型、改變型或嵌合形式產生Ab。此發明中的抗一TWEAK Ab可以是多克隆或單克隆的(mAb)，也可以通過修飾使它們阻斷TWEAK與其受體結合的能力、它們的體內生物可利用性、穩定性或其它所需最優選。
直接針對TWEAK的多克隆抗體血清可以通過常規技術制備，包括用完全弗氏佐劑(CFA)中的人TWEAK皮下注射動物如山羊、兔子、大鼠、倉鼠或小鼠，然后，使用不完全佐劑(IFA)腹膜內或皮下加強注射。用常規免疫學方法篩選含有直接針對TWEAK的所需Ab的多克隆抗血清。
用常規方法制備直接針對人TWEAK的倉鼠單克隆抗體(mAb)，即用CFA中的重組可溶性人TWEAK皮下注射亞美尼亞(armenian)倉鼠，然后，用IFA中的重組可溶性人TWEAK腹膜內或皮下加強注射。根據布達佩斯條約的規定，將產生倉鼠抗TWEAK mAb AB.D3的雜交瘤細胞系(AB.D3.7.2.)存放在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)，保藏號為＿＿。一旦該申請被授予專利，對公眾獲得上述ATCC保藏物的所有限制永遠取消。
各種形式的抗TWEAK Ab也可以通過常規DNA重組技術制備(Winter和Milstein，自然349，293-99(1991))。例如，“嵌合”抗體可通過動物抗體的抗原結合區與人抗體的恒定區的連接而構建(Cabilly等，US 4,816,567；Morrison等，美國國家科學院院報81，6851-55(1984))。當嵌合Ab用于人體的臨床治療時，可以降低動物Ab引發的可觀察到的免疫應答。
另外，識別TWEAK的重組“人源化抗體”可以人工合成。人源化Ab是主要包含人IgG序列的嵌合體，其中已插入特異性抗原結合區(WO94/04679)。用所需抗原免疫動物，分離相應的Ab，再去除可變區序列中與抗原特異結合的部分。任何將動物源抗原結合區克隆到人的抗體基因中已刪除抗原結合區的相應部位。人源化Ab使人類抗體中異源(種間)序列的使用最小化，并減少受治療者中激發免疫應答的可能性。
不同類別的重組抗-TWEAK Ab的構建，也能通過制造含抗TWEAK可變區與分離自不同類免疫球蛋白的人的恒定區(CH1、CH2、CH3)的嵌合或人源化Ab來完成。例如，抗原結合價提高了的抗-TWEAK IgM Ab也可以重組產生，其方式是將抗原結合位點克隆到攜有人IgM重鏈恒定區的載體上(Arulanandam等，實驗醫學雜志177，1439-50(1993)；Lane等，歐洲免疫學雜志22，2573-78(1993)；Traunecker等，自然339，68-70(1989))。
除此之外，標準重組DNA技術可以通過改變抗原結合位點鄰近區的氨基酸殘基來改變重組Ab與它們的抗原的親和力。人源化Ab的抗原結合親和力可通過基于分子模型的誘變提高(Queen等，美國國家科學院院報86，10029-33(1989)；WO 94/04679)。
有可能根據靶向的組織類型或預想的具體治療方案提高或降低抗TWEAK Ab對TWEAK的親和力。例如，通過使病人抗TWEAK Ab的水平保持不變，而修飾TWEAK途徑的能力下降，將有利于進行半預防性治療。同樣，對TWEAK的親和力提高的TWEAK Ab有利于短期治療。
倉鼠抗人TWEAK單克隆抗體的產生舉例說明于實施例1。
抗TWEAK mAb在阻斷慢性GVHD(一種由抗原引起的免疫性疾病)的發生中的應用。我們現在顯示，在小鼠慢性移植物抗宿主疾病(GVHD)模型中TWEAK阻滯劑mAb AB.D3對免疫應答的發生的作用。對慢性GVHD的阻斷能力包括對B細胞活化和增殖的作用，和對分泌型IgG產生的作用。小鼠用250μg抗TWEAK mAb AB.D3、抗-KLH對照mAb Ha4/8或抗-CD40L mAb MR1進行腹膜內(ip)注射，或不作任何處理。4小時后，給小鼠靜脈注射(iv)0.5m1 1×108個自DBA/2中分離的脾細胞。靜脈注射的DBA/2脾細胞構成同種異體移植物。給予移植物的2、4和6天后，小鼠再次用250μg抗TWEAK mAb AB.D3、抗-KLH對照mAb Ha4/8或抗-CD40L mAb MR1處理。對照組小鼠接受1×108個不能在B6D2F1接受者體內引起疾病的B6D2F1脾細胞。另外，未接受移植物或未接受處理的B6D2F1小鼠用作對照。給予移植物的14天后，處死小鼠，檢查疾病的證據。
未經處理的接受移植物的小鼠的表現能提示發生了慢性GVHD的各種癥狀。脾增大是供體T細胞和宿主B細胞活化，并且，正經歷多克隆擴增，伴隨細胞數量的顯著增加的證據。在B細胞亞群上出現表面蛋白如CD69提示B細胞的活化。CD4+和CD8+T細胞失去L-選擇素分子表示T細胞活化。Ig分子如IgG類、IgA和IgE分泌到血清中或體外細胞培養液中提示B細胞已經活化，并且已進行了Ig類別轉換。鑒于此，血清中或體外細胞培養液中抗自身Ig的出現提示正在生成的Ig對自身抗原存在不適當的識別作用。最后，檢測抗體存活可判斷不同治療效果。
在脾增大、B細胞活化和GVHD期間Ig的分泌方面我們對對照小鼠和未經處理的接受同種異體移植物的小鼠進行了比較。抗CD40L mAb MR1在這些實驗中被用作陽性對照，因為以前已有實驗證明，阻滯CD40L/CD40之間的相互作用是一種有效的干擾慢性GVHD發生的方式(Durie等，臨床研究雜志941333-1338(1994))。針對匙孔_血藍蛋白(KHL)的倉鼠mAb Ha4/8作為陰性處理對照。兩個實驗的結果顯示在表2中。在兩個實驗中，用抗-TWEAK mAbAB.D3進行的處理可降低脾腫大程度約33％(與未經處理的同種異體移植物接受者相化)。用陰性對照mAb Ha4/8處理無效果，但用抗CD40L mAb MR1處理可阻斷脾腫大近70％。為研究抗TWEAK mAbAB.D3處理對細胞群體的影響，對注射移植物14天后的受體小鼠的脾細胞進行FACS分析。從每組小鼠中取3-4個小鼠的脾細胞進行分離和匯集。受體B細胞的活化是慢性GVHD的確定特征。在未治療組和對照mAb治療組的小鼠中，一小部分但可觀察到的B200+B細胞表達活化標志物CD69(圖4和表3)。相反，在MR1或AB.D3治療的小鼠中確無B200+B細胞表達CD69。在AB.D3小鼠脾臟中，未檢測到B細胞活化可能是因為幾種作用機制中的一種或一種以上在起作用，包括T細胞的活化失敗、B細胞活化失敗或細胞死亡(凋亡)。其次，我們檢測不同處理組中小鼠脾細胞培養液中IgG的總量，以判斷B細胞群CD69活化標志物的丟失是否與功能表現即IgG的產生相關。未經處理的對照小鼠、MR1處理的小鼠和經AB.D3處理的小鼠產生的IgG的總量比未處理的或經Ha4/8處理的同種異體移植物受體小鼠(表4)明顯降低。此結果顯示活化B細胞的Ig分泌作為慢性GVHD的確定特征被抗-TWEAK mAb的處理阻斷。抗-TWEAK mAb在阻斷慢性GVHD的發生中的應用在實施例2中說明。
其它抗體介導的疾病 許多器官特異性和系統性自身免疫病涉及病理性抗體應答。這樣的情況包括重癥肌無力、自身免疫性溶血性貧血、Chaga′s病、Grave’s病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、Wegener′s肉芽腫病、結節性多動脈炎和急性進行性新月形腎小球腎炎(摘自Benjamini等，免疫學簡論(Immunology，A Short Course)，(Wiley-Liss，NewYork 3d ed.(1996))。
盡管SLE的病因尚未明確，但對臨床病理的免疫學機制已相當了解。出于未知原因，SLE患者產生抗機體核成分的抗體(抗核抗體(ANA))特別是抗天然雙鏈DNA的抗體。臨床上，這些抗體的存在與SLE中發生的腎臟病變密切相關。這些抗體與DNA的復合物似乎來源于正常組織的降解，并且，象任何免疫集聚物疾病一樣，這樣的復合物形成沉淀，沉積在腎小球基底膜上、動脈壁中和關節滑膜腔中。這些復合物活化補體級聯反應并吸引粒細胞。緊隨其后的炎癥反應以腎小球腎炎為特點，引起腎臟的損傷，導致蛋白尿和血尿。
SLE已經在小鼠模型中研究了幾十年。阻斷T和B細胞活化關鍵步驟的制劑如CTLA4-Ig融合蛋白和抗CD40L可阻斷SLE的發生(Grewal和Flavell，免疫學綜述15385-106(1996))。近來，在幾個模型中對特異性針對鼠CD40配體的制劑的治療功效進行了評價(Mohan等，免疫學雜志154，1470-1480(1995))。將誘導病理性抗體產生的細胞移入體內可使狼瘡加重，這可通過投入阻斷CD40/CD40配體相互作用的單克隆抗體得到抑制。而且，用抗CD40配體的抗體短期治療狼瘡小鼠時發現，抗體從它們的系統中被清除后很久還對它們的自發疾病有延續的治療效果。實驗提示，病理性B細胞即使在該治療后9個月也不能產生抗體，提示自身免疫性記憶B細胞的擴增有一段時間的延遲，其可使治療效果維持很長的一段時間。進一步地，抗CD40L治療能阻斷或延遲自發性SLE小鼠模型的SLE的進展(Kalled等，免疫學雜志1602158-2165(1998))。正如我們所顯示的那樣，調節TWEAK/TWEAK受體之間的相互作用的制劑在體內可抑制B細胞活化和Ig的產生，此發明的試劑將用于SLE的治療或預防。
對一些致病性感染因子的正常免疫應答可引發自身抗體應答，其可超過正常范圍和出現醫學問題。一個實例是Chagas′病，一種炎性心肌病，它在慢性克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)感染的人和實驗動物體內發生。近來，幾項研究已經鑒定了Chagas′病人體內的抗自身抗體(Bach-Elias等，寄生蟲研究(Parasitol.Res.)84796-799(1998))。此外，有確切實驗證據表明，心臟特異性自身免疫應答的誘導是人Chagas′心肌病的可能發病機制。近期研究(Tibbetts等，免疫學雜質152，1493-1499(1994))測定心臟抗原特異性抗體可在克氏錐蟲感染的心臟病C57B1/6小鼠體內產生。克氏錐蟲巴西(Brazil)株的感染使C57B1/6小鼠出現與慢性感染人體中所見組織學類似的心肌病。這些小鼠的抗血清與三種心臟抗原反應，而感染了克氏錐蟲Guayas株后不產生心肌病的C57B1/6小鼠不產生這些抗體。這些資料提示這些抗體是心肌病的特異性標志物。TWEAK修飾劑阻斷B細胞活化和Ig產生的能力對阻斷Chagas′病患者發生心臟損傷是有用的。
特定傳染病或其它未知的原因所產生的自身抗體對細胞造成損傷的另一個實例是特發性血小板減少性紫癜(ITP)。在這種情況下，直接針對血小板的抗體引起血小板的破壞(通過補體或帶有Fc或C3b受體的巨噬細胞)，從而導致出血。體內抑制這類抗體介導型自身免疫應答的制劑如本發明抑制抗體產生的TWEAK修飾劑也可用于治療或預防這些自身免疫疾病。
對某些致病性感染因子的正常免疫應答也能激發過度超敏反應，其本身成為醫學問題。I型超敏反應最常見實例是過敏反應。它們由IgE抗體介導，IgE通過其Fc部分結合到肥大細胞和嗜堿性粒細胞的受體上，激發能介導過敏反應的藥理活性物質的釋放。ITP和Goodpasture′s綜合癥有時被認為是II型反應，其IgM或IgG抗體結合到細胞表面的抗原上并活化補體系統時產生。然后，粒細胞被吸引到活化部位，粒細胞的裂解酶的釋放損傷細胞使其被破壞。風濕性關節炎被認為是由III型超敏反應引起，其由結合到正常IgG的Fc部分的免疫復合物(在此實例中是風濕因子，一種IgM自身抗體)介導。這些免疫復合物參與引起關節的炎癥和此疾病特征性的損傷。因為這些病理變化部分由抗體介導，抑制抗體產生的制劑如本發明中的TWEAK修飾劑對這些疾病的治療和預防也是有用的。
導致對病人顯著抗體介導型損傷的這類疾病的其它實例包括Graves′病和急性溶血性貧血。預計TWEAK修飾劑在預防和治療這樣的疾病方面會顯示功效。
對細胞免疫應答的抑制 我們證實體內給予TWEAK蛋白活性修飾劑可阻斷抗體介導的(體液的)免疫疾病、慢性GVHD。其它有效的能阻斷GVHD發生的免疫系統修飾劑包括抗CD40L和CTLA4-Ig融合蛋白。這些制劑可阻斷T和B細胞活化關鍵步驟(Grewal和Flavell，免疫學綜述15385-106(1996))。所以，對所述其它有效免疫系統途徑的制劑處理不限于體液免疫應答。例如，抗CD40L和CTLA4-Ig可分別或聯合用于控制動物模型體內的器官移植排斥(Kirk等，美國國家科學院院報948789-8794(1997))。對移植器官的免疫應答主要由Th1 T細胞介導，并包含細胞毒細胞免疫應答。在其它多種免疫疾病如炎性腸道疾病、類風濕性關節、多發性硬化癥、糖尿病、潰瘍性結腸炎和Crohn′s病等自身免疫疾病中，這些細胞免疫應答引起細胞介導型損傷。基于TWEAK或TWEAK受體修飾劑具備阻斷慢性GVHD發生的能力，我們的發明預計它們能在細胞免疫疾病中得到應用。
利用TWEAK和TWEAK受體修飾劑的治療 給予有效量本發明組合物以治療特定臨床疾病。針對具體應用的優選藥物和治療有效量方案可由本領域技術人員視具體情況，如病人的病情和體重、期望治療的程度和該病人對該治療的耐受情況而定。
預計約5mg/kg的TWEAK或TWEAK受體修飾劑適于作為最佳治療劑量的起點。
治療有效劑量可通過體外實驗確定，該實驗測定包被靶細胞(根據所述修飾劑分別為TWEAK或TWEAK受體陽性細胞)至適當(治療)時間段所需修飾劑的濃度。本文所述FACS和ELISA受體-配體結合實驗能用來監控所述細胞包被反應。可根據這些體外結合實驗的結果選出適于在動物中進行檢測的修飾劑濃度范圍。
本發明可溶性修飾劑(包括抗TWEAK和抗TWEAK-R抗體的分離和純化形式、受體-Ig融合蛋白、其它TWEAK和TWEAK受體修飾劑包括天然試劑或化學衍生的試劑、和它們的鹽或可藥用衍生物)可用顯示免疫抑制活性的任何常規可接受之給藥模式單獨或聯合給藥。
在這些治療中使用的藥物組合物也可有多種形式。例如，固體、半固體、和液體劑型，如片劑、丸劑、粉劑、液體溶液或懸浮劑栓劑、注射液和浸劑(infusible solution)。優選形式取決于給藥模式及所用治療劑。給藥模式可包括口服、腸胃外、皮下、靜脈、傷口內或局部給藥。
在本發明中，可把TWEAK和TWEAK受體修飾劑放進無菌、等滲配方中，加入或不加入刺激攝入或促進穩定的輔因子。優選配方是液體，或凍干粉劑。例如，本發明中的TWEAK和TWEAK受體修飾劑可以用5.0mg/ml一水合檸檬酸、2.7mg/ml檸檬酸三鈉、41mg/ml甘露醇、1mg/ml甘氨酸和1mg/ml聚山梨醇酯(polysorbate)20的緩沖液稀釋。此溶液可冰凍干燥，冰凍儲存并在投藥之前用無菌的注射用水(USP)重新溶解。
組合物也優選包括本領域熟知的常規可藥用載體(參見Remington氏藥物學，第16版，Mac出版公司，1980)。這些可藥用載體包括其它藥劑、載體、基因載體、佐劑、賦形劑等，如人血清白蛋白或血漿制品。組合物優選為單位劑型并通常每天給藥一次或多次。
本發明的藥物組合物也可以已微球體、脂質體、其它微顆粒運送系統或控釋制劑的形式被置于受感染組織或血流內、附近或其它相關聯部位。控釋載體的適當實例包括以成型顆粒的形式存在的半滲透性多聚基質如栓劑或微膠囊。可植入式或微膠囊式控釋基質包括多聚乳糖(美國專利3773319；EP58481)，L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，生物多聚物(Biopolymers)，22，547-56(1985))；聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)或乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，生物醫學研究雜志(J.Biomed.Mater.Res.)，15，167-277(1981)；Langer，化學技術(Chem.Tech.)，12，98-105(1982))。
包含TWEAK或TWEAK受體修飾劑的藥物組合物的優點 本發明的TWEAK或TWEAK受體修飾劑能抑制免疫應答，表現為對慢性GVHD模型中B細胞活化和Ig產生的抑制。選擇性抑制這類免疫介導型應答的能力可用于免疫性疾病包括各種自身免疫病、器官移植排斥、和急、慢性炎癥的治療。此類病理性免疫疾病的治療通常需要對廣泛的細胞類型和免疫學應答具有多種效應的免疫調節和免疫抑制制劑。這些非特異性免疫抑制劑通常需要以引起不良副作用的高且頻繁的細胞毒劑量使用。例如，目前常用的三種免疫抑制劑包括類固醇、環磷酰胺和硫唑嘌呤。類固醇是多效的抗炎制劑，它以逆轉多種病理性T細胞效應的方式抑制活化巨噬細胞并抑制抗原提呈細胞的活性。環磷酰胺(一種烷基化制劑)通過抑制DNA的復制和修復而介導細胞死亡。硫唑嘌呤是一種抑制DNA合成的抗增殖制劑。這些非特異性免疫抑制制劑通常需要以增加其毒性(例，腎-和肝-毒性)和引起不良反應的高劑量使用。因而，它們不適合長期使用。
因而，急需能克服常規治療所帶來的問題的其它制劑和藥物。
以下實施例描述了本發明的抗-TWEAK mAb、該mAb的鑒定方法和該mAb在阻斷抗原驅動型免疫疾病方面的使用。這些實施例不應解釋為限制這些實例只為了達到說明的目的，而本發明只受權利要求的限制。
實施例實施例1針對TWEAK蛋白的單克隆抗體的產生識別人和鼠TWEAK蛋白的單克隆抗體在美國倉鼠體內用如所述產生于桿狀病毒中的可溶性人TWEAK蛋白制成(Chicheportiche等，生物化學雜志5132401-32410(1997))。第一次免疫，每只倉鼠腹膜內注射50μg在弗氏完全佐劑(CFA)中的TWEAK。隨后的各次免疫(首次免疫后的14、28、42天)每只倉鼠腹膜內注射在弗氏不完全佐劑(IFA)中的TWEAK 50(14和28天)或33(42天)μg。用不含佐劑的100μg TWEAK腹膜內注射進行脾細胞融合形成雜交瘤前的最后一次免疫。應用標準方法生成雜交瘤(Lerner，耶魯生物醫學雜志54387-402(1981))。
用ELISA format試驗初步篩選Mab活性。鼠TWEAK蛋白用類似于TWEAK蛋白生成的相同方法(Chicheportiche等，生物化學雜志5132401-32410(1997))在桿狀病毒中產生。用純化的人和鼠TWEAK蛋白包被96孔板，檢測各種倉鼠mAb與這些固相化蛋白的結合能力。用HRP偶聯的驢抗倉鼠IgG(Jackson免疫研究，West Grove，PA USA)和相應酶反應觀察固相化TWEAK蛋白對倉鼠mAb的捕獲。23種mAb中有8種mAb既可識別鼠TWEAK蛋白又可識別人TWEAK蛋白(表1)。
表1克隆人TWEAK 鼠TWEAK 配體封閉 對hTWEAK/293的對mTWEAK/293的ELISAELISA FACSFACS結合 FACS結合AB.D3.7.2 +++ +++ ++ +AA.DB5+++ - +/- + +AC.H5.24 +++ +++ -nd ndAA.G9+++ - +/- + -AB.H12.1 +++ +++ -- -BA.F5.35.2*+++ +++ ++ -BG.A12.5*++ +++ ++ -BE.D5 ++ - +/- + -AF.D4 ++ - ++ -AB.G11.1*+++ +++ ++ +BE.B3.6.1*++ - -+ -AA.AC2.3.2 +++ - +/- nd ndBB.B12.1.31.3 ++ - +/- + -AA.DG7.14*+++ +++ ++ +BD.A3 ++ - -- -BC.B10.21*+++ +++ ++ +BG.E8 ++ - +/- + -AE.C10.4*+++ - ++ -AA.BB4.2*+++ - ++ -AA.EC10.2*+++ - ++ -AD.B5.9*+++ - -- -AB.D4.67.19 +++ - -- -人TWEAKELISA測定mAb與人TWEAK包被板結合的能力鼠TWEAK ELISA測定mAb與鼠TWEAK包被板的交叉反應配體封閉FACS檢測mAb是否能封閉與HT29細胞結合的人TWEAK標記EBNA293轉染體的FACS分析用人和鼠TWEAK的cDNA轉染EBNA293細胞，3天后檢測mAb的反應性種系之間抗原表位的保守性意外地使小鼠和人TWEAK之間在一定程度上保持蛋白同源性(圖1)。用FACS分析來確定抗-TWEAK mAb是否能與表達在細胞表面的TWEAK蛋白結合。將人和小鼠TWEAK cDNA序列克隆至表達載體CH269(Chicheportiche等，生物化學雜志132401-32410(1997))，這些構建體用于轉染以在EBNA293細胞中產生瞬時表達蛋白。包括AB.D3在內的四種mAb與表達小鼠TWEAK的EBNA293細胞緊密結合(圖2)。這四種mAb也能阻斷人TWEAK與已知表達一或多種TWEAK受體的HT29細胞結合(例如，圖3)。這些FACS分析結果綜合提示抗-TWEAK mAb能特異識別TWEAK蛋白，并能修飾TWEAK蛋白與一或多種TWEAK受體結合的能力。
實施例2抗-TWEAK mAb AB.D3在阻斷慢性GVHD小鼠模型的脾腫大、B細胞活化和Ig產生方面的應用6-8周齡B6D2F1雌性小鼠按“方法”一節中所述用DBA/2脾細胞移植物誘導慢性GVHD。每個接受者尾靜脈注射500μl(1×108)細胞。實驗組接受DBA/2移植物(DBA/2＞F1)，對照組動物接受B6D2F1移植物(F1＞F1)。小鼠接受抗TWEAK mAb AB.D3、抗CD40L mAb MR1、對照Ha4/8的處理或不接受任何處理。移植物注射之前4小時以及注射后的2、4和6天腹膜內注射mAb 250μg。實驗的第14天處死小鼠，計算對照F1＞F1組每個動物的脾重比體重的比值作為脾指數，取均值。其它組的平均脾指數用該對照值校正。兩個獨立實驗的結果在表2中顯示。接受DBA/2移植物(DBA/2＞F1)的動物，未接受任何處理或用對照mAb Ha4/8處理的動物與F1＞F1移植物對照組相比脾重明顯增加。此結果反映在脾指數上，其從校正的對照值1.0增加到2.6。用抗CD40L mAb MR1處理的小鼠，脾指數降至接近對照水平(1.1)，用抗TWEAK mAb AB.D3處理的小鼠，脾腫大降低了35％，脾指數到1.7(表2)。
表2處理組實驗1 實驗2 均值F1＞F1(對照組)1.01.01.0DBA/2＞F1，未處理組 2.72.62.65DBA/2＞F1，Ha4/8處理組2.92.62.75DBA/2＞F1，MR1處理組 1.11.11.1DBA/2＞F1，AB.D3處理組1.81.71.75實驗的第14天，處死小鼠并稱重。然后無菌取脾并稱重。計算對照F1＞F1組每個動物的脾重比體重的比值作為脾指數，取均值。其它組的平均脾指數用該對照值校正。
用FACS分析對照小鼠和疾病小鼠(代表各種處理組)脾臟中各群淋巴細胞的活化狀態。首先，我們分析了各組小鼠中移入的供體細胞數量。在所有DBA/2＞F1處理組中，宿主小鼠脾臟中檢測到的供體細胞為幾乎相同的百分數(平均＝6.2％)(表3)。此結果提示不同的mAb處理不影響供體細胞的移入。
表3處理組％H-2Kb陰性(供體)細胞F1＞F1(對照組)0.2DBA/2＞F1，未處理組 5.9DBA/2＞F1，Ha4/8處理組9.9DBA/2＞F1，MR1處理組 5.5DBA/2＞F1，AB.D3處理組4.3各組小鼠脾細胞在冰上用PE-偶聯的抗-H2Kb和FITC-偶聯的抗-H2Dd染色，用FACS分析來檢測MHC等位基因的表達。宿主脾細胞的兩種標志物均為陽性，但供體脾細胞為H2Kb陰性。百分數值反映淋巴細胞群中的事件，如通過前向和側向散射特性所確定。
隨后，利用淋巴細胞活化兩個標志物在B220+B細胞上表達的CD69和在CD4+和CD8+T細胞上表達的L-選擇素。當比較對照組和未處理組的DBA/2＞F1小鼠時，我們注意到CD69+B細胞從2.5％增加到6.2％(表4)。CD69+B細胞數量的增加被MR1(3.3％)或AB.D3(2.1％)的處理阻斷，但不被Ha4/8(6.5％)的處理阻斷(圖4和表3)。兩個實驗的數據見表4。
表4處理組％B220+/CD69+(雙陽性)細胞實驗1 實驗2均值F1＞F1，對照組2.5 2.02.25DBA/2＞F1，未處理組 6.2 5.55.9DBA/2＞F1，Ha4/8處理組6.5 4.75.6DBA/2＞F1，MR1處理組 3.3 nd 3.3DBA/2＞F1，AB.D3處理組2.1 3.22.65脾細胞用PE-標記型抗-B220和FITC-標記型抗-CD69在冰上染色1小時，然后用FACS緩沖液洗滌并分析。百分數是基于在淋巴細胞群中收集到的基本數據，如通過前向和側向散射特性所確定。
為了進行Ig分泌的體外分析，對從各處理組收獲的脾細胞的培養上清進行ELISA分析。表5的結果為第二次實驗每組3只小鼠的均值。用MR1或AB.D3處理使未處理組和Ha4/8處理的DBA/2＞f1組中觀察到的自發IgG生成的4-8倍增加被阻止。
表5處理組 自發性體外IgG生成F1＞F1(對照組) 125ng/ml+/-20ng/mlDBA/2＞F1，未處理組 750ng/ml+/-65ng/mlDBA/2＞F1，Ha4/8處理組 500ng/ml+/-150ng/mlDBA/2＞F1，MR1處理組 0DBA/2＞F1，AB.D3處理組 125ng/ml+/-20ng/ml為了進行Ig分泌的體外分析，使細胞沉淀，以1×107細胞/ml的濃度重懸于含10％胎牛血清(FBS)/4mM谷氨酰胺的DMEM中。6孔培養板中每孔加入1ml。24小時后收集細胞上清液。取每個處理組3只小鼠之每只小鼠兩個孔的均值。
序列表<110>BIOGEN，INC.<120>修飾TWEAK活性的試劑及其作為治療劑在免疫性疾病的治療中的應用<130>A068PCT<140>PCT/US00/01044<141>2000-01-14<150>60/116，168<151>1999-01-15<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>225<212>PRT<213>鼠<400>1Val Leu Ser Leu Gly Leu Ala Leu Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Val1 5 10 15Val Val Ser Leu Gly Ser Trp Ala Thr Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ser20 25 30Gln Glu Glu Leu Thr Ala Glu Asp Arg Arg Glu Pro Pro Glu Leu Asn35 40 45Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp Val Val Pro Phe Leu Glu Gln Leu50 55 60Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro Lys Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg65 70 75 80Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp85 90 95Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Thr100 105 110Lys Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu Arg Tyr Asp Arg Gln Ile Gly Glu115 120 125Phe Thr Val Ile Arg Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His130 135 140Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asn145 150 155 160Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala165 170 175Ser Ser Pro Gly Pro Gln Leu Arg Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu180 185 190Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Arg Ile Arg Thr Leu Pro Trp Ala195 200 205His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val210 215 220His225<210>2<211>249<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu Pro1 5 10 15Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly Leu Ala Leu20 25 30Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly Ser Arg Ala35 40 45Ser Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ala Gln Glu Glu Leu Val Ala Glu Glu
50 55 60Asp Gln Asp Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp65 70 75 80Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro85 90 95Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu100 105 110Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly115 120 125Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu130 135 140Arg Tyr Asn Arg Gln Ile Gly Glu Phe Ile Val Thr Arg Ala Gly Leu145 150 155 160Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr165 170 175Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu180 185 190Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro Gln Leu Arg195 200 205Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu210 215 220Arg Ile Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu225 230 235 240Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val His24權利要求
1.阻斷動物中免疫性疾病的發生或處理或降低其嚴重程度或其影響的一種方法，其包括投放藥物組合物的步驟，該藥物組合物包括一種治療有效量的TWEAK阻滯劑和可藥用載體。
2.一種抑制動物免疫應答的方法，此方法包括投放藥物組合物的步驟，此藥物組合物包括一種有效劑量的TWEAK阻滯劑和藥學上有效的載體。
3.依照權利要求1或2的方法，其中TWEAK阻滯劑從下列選擇(a)一種直接針對TWEAK配體的抗體；(b)一種直接針對TWEAK受體的抗體；(c)一種修飾TWEAK配體與受體結合的制劑；(d)一種修飾細胞表面受體聚集的制劑；和(e)一種能阻斷TWEAK受體的細胞內信號傳遞的制劑；
4.依照權利要求1或2的方法，其中所述動物為哺乳動物。
5.依照權利要求4的方法，其中所述哺乳動物是人。
6.依照權利要求1或2的方法，其中所述TWEAK阻滯劑包括一種可溶性的TWEAK受體，它有一個能選擇性地與表面TWEAK配體結合的配體結合區。
7.權利要求6的方法，其中可溶性TWEAK受體包括人免疫球蛋白IgG區。
8.權利要求7的方法，其中人免疫球蛋白IgG區包括負責特異性抗原結合的區域。
9.依照權利要求1或2的方法，其中直接針對TWEAK受體的抗體包括單克隆抗體。
10.依照權利要求1或2的方法，其中TWEAK阻滯劑包括直接針對TWEAK表面配體的單克隆抗體。
11.依照權利要求10的方法，其中所述抗體直接針對TWEAK配體的一個亞單位。
12.依照權利要求2的方法，其中免疫應答是Th1細胞介導的免疫應答。
13.依照權利要求2的方法，其中免疫應答是Th2細胞介導的免疫應答。
14.依照權利要求2的方法，其中免疫應答包括Th1和Th2細胞介導的免疫應答。
15.依照權利要求2的方法，其中TWEAK阻滯劑包括直接針對TWEAK受體的單克隆抗體。
16.一種藥物組合物，其包括一種治療有效量的TWEAK阻滯劑和可藥用載體。
17.依照權利要求16的組合物，其中TWEAK阻滯劑從下列選擇(a)一種直接針對TWEAK配體的抗體；(b)一種直接針對TWEAK受體的抗體；(c)一種修飾TWEAK配體與受體結合的制劑；(d)一種修飾細胞表面受體聚集的制劑；和(e)一種能阻斷TWEAK受體的細胞內信號傳遞的制劑。
18.依照權利要求16的組合物，其中TWEAK阻滯劑包括一種可溶性的TWEAK受體，它有一個能選擇性地與表面TWEAK配體結合的配體結合區。
19.依照權利要求18的組合物，其中可溶性TWEAK受體包括人免疫球蛋白IgG區，該區中已插入了負責特異性抗原結合的區。
20.權利要求16的組合物，其中TWEAK阻滯劑包括直接針對TWEAK受體的單克隆抗體。
21.依照權利要求16的組合物，其中TWEAK阻滯劑包括直接針對TWEAK表面配體的單克隆抗體。
22.依照權利要求21的組合物，其中所述抗體直接針對TWEAK配體的一個亞單位。
全文摘要
本發明涉及可修飾TWEAK活性的制劑和它們作為治療制劑在免疫性疾病的治療中的應用。
文檔編號A61P21/00GK1387538SQ00804735
公開日2002年12月25日 申請日期2000年1月14日 優先權日1999年1月15日
發明者保羅·倫納特 申請人:比奧根公司