】
[0059]實施例1:重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白表達載體的構建:
[0060]人工化學合成帶酶切位點及信號肽的重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白編碼基因序列，并將其克隆至PUC57 simple質粒載體中，得到含有融合蛋白編碼基因的質粒。(由南京金斯瑞生物技術有限公司完成)。該質粒融合蛋白的5’端含有XhoI酶切位點和信號肽剪切識別位點(即5’CTCGAGAAAAGA-);且3’端帶有NotI酶切位點(即3， GCGGCCGC-)
[0061]取pUC57simple-rhG-CSF_CTP3 的質粒及 pPICZaA 表達質粒，采用 XhoI 及 NotI限制性核酸內切酶進行雙酶切。雙酶切的反應體系為20 μ L，其中質粒10 μ L，NotI I μ L，XhoI I μ L，1X buffer H 2 μ L,無菌水6 μ L。37°C酶切5h。酶切產物采用I %瓊脂糖凝膠電泳分離，、采用膠回收試劑盒回收目的片段。其中pPiczaA表達載體回收3500bp左右的片段，pUC57simple-rhG-CSF-CTP3 載體回收 750bp 的片段。
[0062]連接反應在T4DNA連接酶催化下進行，pPiczaA表達載體酶切片段與pUC57simple-rhG-CSF-CTP3載體的摩爾數比約為1:4。連接反應體系為25 μ L，其中Τ4連接酶I μ L，10XT4DNA連接酶緩沖液2.5 μ L，16°C連接過夜。
[0063]連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5 α，涂布于Zeocin抗性LB平板上，37°C培養過夜，挑取單克隆，擴大培養后抽提質粒，采用NcoI及XhoI雙酶切。酶切產物采用I %瓊脂糖凝膠電泳分離，觀察酶切產物的大小，實驗結果如圖1所示。將擴大培養的菌液采用PET載體通用引物測序，測序反應由上海英濰捷基貿易有限公司完成；經測定，雙酶切產物大小約為750bp，與設計的792bp基本相同，且測序結果顯示設計的rhG-CSF-CTP3的序列和實際構建的融合蛋白的核苷酸序列完全相同。
[0064]實施例2重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白的表達
[0065]首先制備感受態畢赤酵母GS115細胞，具體步驟如下:首先挑取GS115的單克隆菌落于3mL的YPD培養基中，以180rpm的轉速于30°C恒溫搖動孵育48h。然后以1:200的接種量將培養好的畢赤酵母GSl 15細胞轉接入10mL的YPD培養基中，培養至0.D.600 =
1.2。以4000rpm/min4°C離心5分鐘，棄上清，收集沉淀以lmol/L的山梨醇溶液重懸兩次后，以4000rpm/min4°C離心10分鐘，用100 μ L的冰冷山梨醇溶液重懸沉淀，即制成感受態畢赤酵母GS115細胞。
[0066]其次將測序正確的表達重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白的表達載體pPICZaA-rhG-CSF-CTP3用限制性內切酶SacI進行單酶切線性化，并收集4000bp處的片段。
[0067]然后將10 μ g線性化好的轉化pPICZaA-rhG-CSF-CTP3質粒在1000mV/mm的場強下轉化感受態畢赤酵母GSl 15細胞。活化感受態細胞并涂在含有Zeocin的抗性板上培養。挑取單克隆轉化子備用。
[0068]將單克隆轉化子轉接入5mLBMGY培養基中于30°C恒溫連續振蕩培養48h后離心5min棄上清，加入5mLBMMY培養基，并每日往培養基中加入0.5%的甲醇誘導表達。連續恒溫連續振蕩培養96h。收集培養液上清進行SDS-PAGE電泳檢測。結果如圖2所示。結果表明與未經甲醇誘導對照組相比，甲醇誘導的實驗組在45KD附近有目的蛋白表達，大小與預期相符。
[0069]實施例3重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白的體外活性測定
[0070]本實施例依照中華人民共和國藥典(2010版，三部)，選用G-CSF依賴細胞株NFS60,以MTT法測定生物學活性。具體步驟如下:FS60細胞株用完全培養液于37°C、5%CO2培養，控制細胞濃度為每毫升含1*105個細胞用于測定。取足量NFS60細胞培養物，離心收集細胞，用RPMI1640培養液洗兩次，然后重懸于基礎培養液(RPMI 1640900ml+新生牛血清100ml)配成每毫升含2*105個細胞的細胞懸液。在加有標準品和供試品的96孔板中每孔加入細胞懸液50 μ L，于37°C、5% CO2培養72小時。每孔加入MTT溶液20 μ L，于37°C、5% CO2培養5小時。每孔加入裂解液100 μ L，37°C過夜，用酶標儀于波長570nm處測定吸光度。結果如圖3所示，rhG-CSF-CTP3的體外生物活性與G-CSF相似，顯著高于同類PEG產品 Neulasta0
[0071]實施例4重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白的體內活性測定
[0072]用環磷酰胺(CTX)建立小鼠白細胞低下模型測定融合蛋白體內活性，以200mg/kg的劑量注射于BALB/c小鼠皮下，測定3天小鼠白細胞數，發現小鼠的白細胞數連續3天均低于5000個/mm3.所有建模小鼠從第四天開始給藥，實驗組于實驗開始第一天的尾靜脈注射一次rhG-CSF-CTP3融合蛋白，共計注射一次。陽性對照組分別注射Neulasta和瑞白(rh-GCSF)。而陰性對照組則注射醋酸緩沖液。連續觀察12天。每天取小鼠尾部末梢靜脈血計數白細胞的數量，統計結果如圖4所示，在12天內，融合蛋白rhG-CSF-CTP3與Neulasta及每天注射瑞白的藥效程度相當，在注射7天后仍能保持較好的藥效。
【主權項】
1.一種長效的重組人粒細胞集落刺激因子，其特征在于，由一個重組人粒細胞集落刺激因子和一個或多個人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基端118位到145位的氨基酸所組成的短肽(CTP)融合表達制成長效融合蛋白； 所述CTP短肽的氨基酸序列為SEQ ID N0.1所示； 所述的人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)其氨基酸序列由SEQ ID N0.2所示。2.按權利要求1所述的長效的重組人粒細胞集落刺激因子，其特征在于，編碼所述的人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基端118位到145位的氨基酸所組成的短肽(CTP)核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。3.按權利要求1所述的長效的重組人粒細胞集落刺激因子，其特征在于，所述的長效的重組人粒細胞集落刺激因子由一個重組人粒細胞集落刺激因子和一至多個CTP短肽融合表達制成長效融合蛋白，其組合方式為:Ν-端的一個CTP和C-端的一個rhG-CSF融合(CTP-rhG-CSF)，N-端兩個 CTP 和 C-端的一個 rhG-CSF 融合(CTP-CTP-rhG-CSF)，N-端的rhG-CSF和C-端的一個CTP融合(rhG-CSF-CTP)，N-端的rhG-CSF和C-端的兩個CTP融合，N-端的一個CTP及C-端的一個CTP共同與rhG-CSF融合(CTP-rhG-CSF-CTP)，或，N-端的一個 CTP 及 C-端的兩個 CTP 共同與 rhG-CSF 融合(CTP-rhG-CSF-CTP-CTP)。4.編碼權利要求3中任一所述的長效人粒細胞集落刺激因子融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0.4?9所示。5.按權利要求1所述的長效的重組人粒細胞集落刺激因子，其特征在于，所述的長效的重組人粒細胞集落刺激因子由重組人粒細胞集落刺激因子和CTP短肽融合表達而成，其組合方式為:N-端的一個CTP及C-端的兩個CTP共同與rhG-CSF融合表達制成融合蛋白CTP-rhG-CSF-CTP-CTP。6.含有所述重組人粒細胞集落刺激因子和所述CTP短肽的核苷酸序列的載體。7.含有所述重組人粒細胞集落刺激因子和所述CTP短肽的核苷酸序列的的宿主細胞。8.按權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞選自大腸桿菌，畢赤酵母，或哺乳動物細胞。9.權利要求項1-5中任一項所述的長效人粒細胞集落刺激因子融合蛋白在制備治療放化療或其他原因造成的中性粒細胞減少癥，及骨髓抑制的藥物中的用途。
【專利摘要】本發明屬生物制藥技術領域，涉及人粒細胞集落刺激因子的重組融合蛋白，具體涉及一種長效的重組人粒細胞集落刺激因子及其制備方法和用途。本發明由一個重組人粒細胞集落刺激因子和一個或多個人絨毛膜促性腺激素(hCG)β亞基端118位到145位的氨基酸所組成的短肽(CTP)融合表達制成長效融合蛋白；在保持人粒細胞集落刺激因子的原有活性的前提下，延長該蛋白質在體內的半衰期，進一步用于制備抗放化療或其他原因造成的中性粒細胞減少癥以及骨髓抑制的藥物。本發明的融合蛋白可在畢赤酵母中高效表達，制備工藝簡單，可用于大規模的藥物級融合蛋白的生產制備。
【IPC分類】A61K47/48, C12N15/62, C07K19/00, A61P37/04, A61P7/00, A61K38/19
【公開號】CN105461810
【申請號】CN201410439810
【發明人】鞠佃文, 范佳君, 李玉彬, 王子玉, 王紹飛, 宋平, 陳其成
【申請人】復旦大學
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2014年8月31日