專利名稱：：聚乙二醇單修飾的重組人集落細胞刺激因子賴氨酸缺陷體的制作方法
技術領域：
：本發明涉及了蛋白質聚乙二醇化修飾領域，更具體地說，涉及了一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(PEG-rhG-CSF-LysD)的制備和鑒定。
背景技術：
：天然人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)成熟蛋白具有174個氨基酸，分子量為19KDa，可誘導造血干細胞的增值和分化，導致血液中的中性粒細胞數增加；另外還能刺激成熟中性粒細胞數從骨髓中釋出，并激活中性粒細胞的功能。因此自1991年起rhG-CSF已經廣泛用于治療因放療、化療等引起的中性粒細胞減少癥，可以顯著改善中性粒細胞減少癥的嚴重性和持續時間。但是和許多分子量小于30kDa的蛋白質藥物一樣，rhG-CSF在其代謝過程中易由腎小球濾過，在通過腎小管時又被其中的蛋白酶部分降解并從尿中排出，因而半衰期短。rhG-CSF血清半衰期只有2-4小時，為維持一定的療效需要每天注射，持續注射5-7天，不僅增加了病人的痛苦而且易引發一系列副反應(WelteK等，ProcNatAcadSci,82:1526-1530(1985);FramptonJE等，Drugs,48(5):731-60(1994)),這不僅增加了病人的痛苦，也增加了醫療費用。聚乙二醇(PEG)化學修飾是延長蛋白類藥物半衰期的一個有效途徑。聚乙二醇(簡稱PEG)是一種惰性、兩親、不帶電荷的柔性長鏈高分子聚合物，化學式為H0(CH2CH20)nCH2CH200H，n為聚合單元的個數。PEG分子量隨n的增加可由lkDa增至50kDa，有線性和分支兩種構型，已經作為多種藥物的安全載體用于臨床應用。PEG通過共價鍵與蛋白質連接，可與蛋白質分子中的氨基(位于N末端的氨基或賴氨酸殘基)或者巰基(位于半胱氨酸)反應對蛋白質分子進行修飾。該修飾可以有效地改變蛋白類藥物在體內的分布和藥物學特性，延長蛋白質藥物的血藥濃度，同時還可降低免疫原性。目前已經有多種聚乙二醇藥物應用于臨床，如聚乙二醇單修飾重組人干擾素a2a(PEG-IFNa2a)(BailonP等，BioconjugateChem.，12:195-202(2001))、聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)(HarrisJM等，ClinPharmacokinet，40:539-551(2001))等。聚乙二醇(PEG)分子必須通過一個活化基團活化，才能與蛋白質表面的反應基團反應，以共價鍵形式連接到蛋白質分子上。但是，由于蛋白質分子量巨大，因此其潛在的可以與活性PEG反應的基團也是數目眾多。在不同的位點結合PEG，其產物的穩定性，生物學活性等性質都是不同的。Yu-SenWang(AdvancedDrugDeliveryReviews54:547-570(2002))研究重組人干擾素a2a(IFNa2a)的PEG修飾時，就對此問題進行了詳細闡述。當用12KDsucciniraidylcarbonatePEG(SC-PEG)修飾時，IFNa2a分子中包括N端氨基，Lys，His等共有14個基團可能被修飾，對于單修飾的PEG-IFNa2a,最終分析證明修飾制備所得的PEG-IFNa2a是由14種不同位點結合有一個PEG分子組成的混合物，而且這14種PEG-IFNa2a的活性是不一致的，其相對生物學活性最高保留了37%，最低僅保留了6%。OlafBKinstler等(美國專利US5985265，1999年公開)研究重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)的PEG修飾時就發現，當采用20KD的mPEG-SCM(N-hydroxysuccinimidylesterofcarboxymethylmethoxypolyethyleneglycol)修飾時，最終制備獲得的單一修飾的PEG-rhG-CSF是由N端，Lys35，Lys41分別結合有一個PEG分子組成的混合物。進一步分析這三種不同的PEG-rhG-CSF分子，發現N端修飾的PEG-rhG-CSF活性最高，保留了原有活性的68%，Lys35和Lys41修飾產物活性分別為56%和21%，而且Lys35修飾產物是不穩定的，在體外很容易被降解。為了達到特定修飾于某個位點，從而獲得相對均一的產物，該專利方法提供了另外一種特別的低pH修飾方法，使PEG能定向結合于rhG-CSF的N端，從而獲得均一，穩定而且高活性的PEG-rhG-CSF。其原理是利用蛋白質中不同伯氨基團的化學反應性差異a-氨基與e-氨基的沐a(解離常數)不同，a-氨基(位于N端)的pKa為7.8，e-氨基(位于賴氨酸殘基)的pKa為10.1。如果以醛基化的PEG(mPEG-aldehyde)進行氨基修飾，pKa低的ci-氨基比e-氨基更具有反應優勢，優先進行反應，可以實現蛋白質N端的優勢反應。因此在低pH下(pH5.0)用mPEG-丙醛對rhG-CSF的修飾，大于70n/。的修飾產物為N端特異性修飾。但這種方法仍存在缺點(l)在低pH下rhG-CSF雖然傾向于與N端的a-氨基反應，但其反應的選擇性只是相對的，rhG-CSF結構中其余的四個Lys殘基的氨基還是有少量副反應，因而最終獲得只是N-端修飾占大多數的PEG-rhG-CSF混合物。(2)所獲得最終產物可能是不同修飾位點的混合物，還可能有多修飾產物，這些對于PEG-rhG-CSF的后續純化及臨床應用等都是不利的。我們按照該專利的方法反復進行了試驗，最終產物始終有二修飾的PEG-rhG-CSF的存在，證明在該條件下除N端的a-氨基外，其余的四個Lys殘基確實也參加了反應，參見實例2的結果。(3)由于是在低pH條件下反應，因此反應時間很長，反應效率低。基于以上說明，因此，如果能找到一種方法能制備一種真正定點修飾的結構均一的單PEG化rhG-CSF產物，具有很重要的臨床和經濟意義。
發明內容本發明的一個目的是避免現有PEG修飾重組人粒細胞集落刺激因子技術存在的缺陷，提供一種聚乙二醇(PEG)單修飾的結構均一的重組人粒細胞集落刺激因子突變體。本發明的另一個目的是提供一種聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體的制備方法。本發明的另一目的是提供一種包含上述聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體的藥物制劑及其在制備治療因放療、化療等引起的中性粒細胞減少癥藥物中的應用。本發明是通過如下技術方案實現最終目的通過基因突變技術,將重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)—級結構中的4個賴氨酸殘基Lysl7,Lys24，Lys35和Lys41分別突變為除Lys外的其它19種人體天然氨基酸之一。通過噬菌體展示技術表達所有不含賴氨酸的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(re—conibinanthumangranulocytecolonystimulatingfactorLysinedeficient,rhG-CSF-LysD)，然后利用重組人粒細胞集落刺激因子受體篩選出具有基本保留rhG-CSF原有的生物學活性的重組人粒細胞集落剌激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)。突變后的rhG-CSF-LysD僅保留有N端一個a-氨基，當與聚乙二醇(PEG)氨基反應試劑反應吋，PEG特異性結合于rhG-CSF-LysD其N端的a-氨基，從而獲得N端定點修飾結構均一的PEG-rhG-CSF-LysD產物。重組人重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)—級結構中有4個賴氨酸殘基，分別為Lysl7，Lys24，Lys35和Lys41。通過基因突變技術，可以將這4個賴氨酸殘基分別突變為除Lys外的其它19種人體天然氨基酸之一，并且突變后的不含賴氨酸的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(recombinanthumangranulocytecolonystimulatingfactorLysinedeficient,rhG—CSF—LysD)要基本保留rhG—CSF原有的生物學活性，所謂基本保留rhG-CSF原有的生物學活性是指突變后的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體的生物學活性至少在rhG-CSF原有活性的80%以上。生物學活性的測定可參照2005年版《中國藥典》第三部附錄58所示的方法。為了得到用其他合適的氨基酸取代賴氨酸又基本保留了rhG-CSF活性的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)，需要利用噬菌體展示技術對突變后的rhG-CSF-Ly^進行篩選。噬菌體展示技術是目前一種廣泛使用的高親和力和高活性蛋白質篩選技術，該技術能夠在絲狀噬菌體表面上表達多種隨機的蛋白質，再經過與特定配基結合、洗脫和重復篩選，最后得到與受體或者配體有高親和力蛋白質。本發明中，為了構建4個賴氨酸全被替換的具有生物活性的rhG-CSF-LysD，首先我們利用PCR法創建一個4個Lys編碼被隨機替代的rhG-CSF-LysDcDNA文庫(具體方法見實例1)，然后通過噬菌體展示技術，用重組人粒細胞集落刺激因子受體作為配體，通過多輪篩選后得到了4個活性基本保留的rhG-CSF-LysD，其氨基酸序列見表l，其體外活性和rhG-CSF相當(見表2)。表14個高活性rhG-CSF-LysD的賴氨酸取代氨基酸(表中字母為氨基酸縮寫)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2rhG-CSF和各種rhG-CSF-LysD修飾前后的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*修飾在N端篩選到的rhG-CSF-LysD蛋白可以通過原核生物或真核生物宿主基因重組技術表達外源性DNA序列而得到，合適的原核生物宿主包括各種細菌(如Ecoli.);合適的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞)。依據所用的宿主的不同，rhG-CSF-LysD表達產物可能會被哺乳動物或其它真核細胞中的碳水化合物所糖基化修飾。對于本發明所用的人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)，優選的采用原核表達系統或酵母表達系統的產物，例如E"7i或甲醇酵母表達系統。這些改構的rhG-CSF-Lys由于蛋白序列中只存在一個a-氨基，不存在e-氨基。因此，這些突變體用聚乙二醇氨基反應試劑修飾，在不同pH，不同PEG摩爾比條件下，所的的產物均是定點單修飾的，而沒有二修飾或多修飾產物的存在，實例2的結果表明rhG-CSF-LysD確實僅存在N端a-氨基一個反應位點。所述的帶聚乙二醇氨基反應試劑為有氨基反應基團的聚乙二醇分子，詳細可參考StevenM(ModificationofCD4I隱unoadhesinwithMonomethoxypoly(ethyleneglycol)aldehydeviaReductiveAlkylation,Bioconjugate.Chem，1994,5:133-140)論文中第134頁表1中列舉的PEG種類以及姜忠義等(蛋白質和肽類分子的聚乙二醇化化學，《有機化學》2003年第23巻12期1340-1347)論文中所描述的那些PEG衍生物，包括但不局限于PEG琥珀酰亞胺碳酸酯，PEG對硝基苯碳酸酯，PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯，PEG碳酰咪唑，PEG苯并三唑碳酸酯(BTC-PEG)，PEG苯基琥珀酰亞胺碳酸酯，甲氧聚乙二醇羥琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidylcarbonate,mPEG-SC)，甲氧聚乙二醇醛如甲氧聚乙二醇丙醛(mPEG-propinaldehyde，mPEG-ALD)、甲氧聚乙二醇丁酸等，以及將兩個線性的BTC-PEG或mPEG-SC鏈連到賴氨酸的a-氨基和e-氨基形成的分支狀的PEG衍生物等。聚乙二醇氨基反應試劑可以和rhG-CSF-LysD的a-氨基基團特異性的結合,獲得聚乙二醇定點單修飾的產物。這些活性聚乙二醇可以是分子量大于5kDa的任意大小的PEG，其形狀可以是單鏈或者分支狀，其中優選分子量在5kDa到40kDa之間的線性或分枝PEGs,更優選分子量為20kDa的單鏈聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD2。。。0)。如前所述，由于rhG-CSF-LysD的蛋白序列中只存在一個反應氨基(a-氨基)，因此，帶有氨基反應基團的PEG只能和rhG-CSF-Ly^的N-端的a-氨基基團特異性的結合,獲得聚乙二醇定點單修飾的產物，這克服了
背景技術：
中PEG修飾的多氨基修飾所帶來的反應位點不一和多修飾產生等缺陷，簡化了后續純化過程，提高了蛋白收率。本發明還提供一種聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)的制備方法，其包括如下步驟(1)在含水介質中，帶有氨基反應基團的聚乙二醇分子與重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)中的a-氨基反應；(2)任選地從反應混合物中分離聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)的產物。較合適的修飾反應條件是rhG-CSF-LysD濃度大于l毫克/毫升，蛋白質:PEG分子的比例在1:1-1:20之間，pH條件為酸性、中性或堿性，優選為pH7-9.5。帶有氨基反應基團的聚乙二醇分子可為甲氧聚乙二醇羥琥珀酰酯,如甲氧聚乙二醇羥琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidylcarbonate,mPEG-SC)或甲氧聚乙二醇醛，如甲氧聚乙二醇丙醛(mPEG-propinaldehyde，mPEG-ALD)。經修飾反應后獲得的為含有PEG-rhG-CSF-Lys')的混合物，其中含有PEG-rhG-CSF-LysD、未反應的活性PEG分子和rhG-CSF-Lys"等。需要通過合適的分離純化方法，例如通過離子交換層析和分子篩層析的組合來純化上述混合物體系，最終獲得的制品含有至少90%以上的PEG-rhG-CSF-Lys"和至多10%的未發生聚乙二醇化的rhG-CSF-LysD，優選制品含有至少95%以上的PEG-rhG-CSF-Ly^和至多5%的未發生聚乙二醇化的rhG-CSF-LysD，更優選制品含有至少99%以上的PEG-rhG-CSF-LysD。本發明所制備的PEG-rhG-CSF-LysD，與以前的方法相比，由于采用不含賴氨酸的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)，僅保留了N端a-氨基一個反應位點與聚乙二醇氨基反應形式相結合的技術方案，因而在蛋白質修飾方面獲得了顯著的有益效果，對采用上述方法形成的蛋白分子進行檢驗，得到如下結果(l)定點修飾結構均一，均為蛋白質N末端的a-氨基連接一個PEG分子，沒有一個蛋白分子連接幾個PEG的產物，也沒有其他位點連接PEG的異構現象；(2)反應效率高，最高可以達到95%-99%;反應時間短，反應時間在2-4h內完成；(3)體外比活性降低很少(見表2);(4)體內活性實驗明顯長效，動物實驗證實，其體內半衰期延長到了14.6小時，比未修飾的G-CSF(1/2=2.2小時)提高了7倍，達到了長效、減少給藥次數的目的。本發明還提供了一種含有聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(PEG-rhG-CSF-LysD)的藥用組合物，該藥物制劑含有上述的有效量的生物制品和藥用稀釋劑、佐劑或載體等。該藥劑可用于治療因放療、化療等引起的中性粒細胞減少癥，由于半衰期延長，因此可實現每周只給藥1次。優選制劑為注射水針，每毫升含6mgmPEG-rhG-CSF-Lys0.35mg乙酸鈉，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20和0.02mg的氯化鈉，pH為4.0。以下實例將進一步說明本發明。圖1為重組人粒細胞集落刺激因子通過PCR定點突變獲得賴氨酸缺陷體的示意圖，其中N和S分別代表G/A/T/C和G/C。圖2為rhG-CSF和rhG-CSF-LysDPEG修飾和純化的SDS-PAGE電泳圖，其中1為marker,從上到下分子量分別為97KD，66KD,43KD,31KD，21KD和14KD;2為純化的rhG-CSF;3為rhG-CSFPEG修飾反應混合物;4為純化的rhG-CSF-LysD;5為rhG-CSF-LysDPEG修飾反應混合物；6為ResourceS洗脫峰l;7為濃縮的ResourceS洗脫峰2。圖3為SourceS分離純化PEG-rmhG—CSF的層析圖圖4為小鼠皮下給藥后rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-LysD的血藥濃度-時間圖圖5為小鼠皮下給藥后rhG-CSF、PEG-rhG-CSF-LysD和空白對照的白細胞總數變化情況具體實施例方式實例1高活性重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)的獲得a.展示人粒細胞集落剌激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)的噬菌體文庫構建為了構建4個賴氨酸全被替換的具有生物活性的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)，我們用隨機序列替代4個Lys的編碼序列來創建一個重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)的cDNA文庫。用NNS序列通過3步PCR隨機的取代Lys的編碼序列(附圖1)。首先我們要先構建pUC118-rhG-CSF質粒。rhG-CSF基因的克隆方法可參考中國專利CN96106418.8實施例1。以獲得的cDNA為模板，設計引物如下上游引物5LGMTTCATGACACCATTAGGC-3，；下游引物5，-GGATCCTTAGGGCTGGGCMGGTGGCGT-3'(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)，用常規PCR方法進行目的基因的擴增。PCR產物經回收、純化，裝到pGEM-T載體，轉化DH5a感受態細胞，經藍白斑篩選，將陽性克隆送測序檢測。將測序正確的克隆基因用EcoRI和BaraHI從pGEM-T上切割回收，然后裝到經同樣酶切處理的pUC118上，T4DNA連接酶，12.5'C連接過夜，同樣轉化DH5a感受態細胞，經篩選鑒定，獲得pUC118-rhG-CSF質粒。然后以此pUC118-rhG-CSF質粒為模板經過三輪PCR反應即第一輪PCR反應是以質粒PUC118-rhG-CSF為模板，以Oligo-1和Oligo-2作為引物的，通過標準PCR方法，獲得長度為88bp的PCR產物，用低熔點瓊脂糖凝膠電泳純化回收第一輪的PCR產物；第二輪PCR仍然以質粒pUC118-rhG-CSF為模板，但是反應的引物對是第一輪的PCR產物和Oligo-3，通過標準PCR方法，獲得長度為130bp的PCR產物，用低熔點瓊脂糖凝膠電泳純化回收第二輪的PCR產物；第三輪PCR反應還是以質粒PUC118-rhG-CSF為模板，但是反應的引物對是第二輪的PCR產物和Oligo-4，通過標準PCR方法，獲得長度為537bp的PCR產物，用低熔點瓊脂糖凝膠電泳純化回收第三輪的PCR產物。最終的PCR產物回收后用限制性內切酶EcoRI和BamHI切割，將一部分回收的酶切產物用DNA連接酶和同樣用EcoRI和BamHI切割的噬菌粒載體pUC118連接，將連接產物轉化TG1感受態細胞，轉化后的感受態細胞涂布含有Amp和IPTG及X-gal的2XYT平板(配方見分子克隆第2版附錄，冷泉港出版社)，37'C培養過夜，挑取白色的單克隆擴增培養后少量提取質粒，進一步酶切鑒定證實已獲得重組的噬菌粒pUC118-重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)(具體的操作參見分子克隆)。Oligol—4序列如下，其中Oligol—3設計含有NNS序列，(N和S分別代表G/A/T/C和G/C，來取代編碼G-CSF中的Lysl7，Lys25,Lys34，Lys41序列)。Oligo-1:5，-GAATTCATGACACCATTAGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCNNSTGCTTA-3'Oligo-2:5，-CATCGCCCTGGATS剛CCTCACTTG-3'01igo-3:5，-ACAGSNNGTAGGTGGCACACAGS剛CTC-3'Oligo-4:5，-GGATCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT-3'含重組噬菌粒的大腸桿菌TGI培養液以10mL/L接種于含Amp的2XYT培養基中，37。C搖床培養至A600nm值為0.6，加入輔助噬菌體M13K07繼續培養1h，4000g離心15min，收集的菌體加入到新鮮的含Amp,Kan的2XYT培養基中，30。C搖床培養]4~18h。將上述培養物10800g,4。C離心10min，收集上清。加入1/6體積PEG/NaCl(200g/LPEG8000'2.5mol/LNaCl)，充分混勻后4。C靜置1h，10800g,4"離心30min，TBS溶解，加入1/6體積的PEG/NaCl,充分混勻后0。C放置20min，10800g，4。C離心30min,TBS溶解，10800g，4。C離心10min，吸取上清，即為表面呈現重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-Ly。的重組噬菌體。b.高活性的人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)文庫篩選取提前配制好含0.1g/L疊氮鈉的封閉液14mL稀釋PEG沉淀的16ml重組噬菌體，室溫下孵育1015min后，取20raL加入G-CSF受體(R&D公司)包被的錐形培養瓶中，37。C孵育2h。PBS，PBST洗培養瓶，然后將10mL培養至對數生長期的TG1細胞加入上述免疫吸附后的培養瓶內，37t:孵育lh,讓吸附的重組噬菌體感染TG1細胞，完成第一輪篩選。將10mL感染了重組噬菌體的TG1細胞轉移至50mL細菌培養管中，加氨芐青霉素至100mg/L、葡萄糖至終濃度20g/L，再加入輔助噬菌體M13K07，37°C，250r/min震蕩培養1h，同前述方法一樣進行又一輪篩選.用相同方法完成第3、第4輪篩選，再感染TG1細胞，得到富集的噬菌體克隆。隨機挑選經篩選后的單克隆400個，利用NFS-60細胞的生長對G-CSF的依賴性進行體外生物活性檢測，以天然的G-CSF為對照，MTT色素還原法測定樣品的生物學活性。結果顯示在這些克隆中有165個克隆的生物活性和天然的G-CSF相似。對這些陽性克隆進行DNA序列分析發現，其中有4個克隆，4個lysine完全被其他氨基酸取代(表3),其體外生物學活性和G-CSF相當(表4)。表34個高活性rhG-CSF-Lys°的賴氨酸取代氨基酸及其核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>中的表達、純化和性質鑒定取隆編號為19、53、124和137的高活性的人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-LysD)，參照中國專利(96106418.8)進行克隆表達、純化和性質鑒定，最后獲得純度、和活性等都符合要求的rhG-CSF-Lys"進行修飾，以下實例部分僅取19號的rhG-CSF-Ly^進行PEG修飾、純化和性質鑒定。，實例2PEG-rhG-CSF-LysD的制備a.rhG-CSF和rhG-CSF-LysD的PEG修飾rhG-CSF的PEG修飾:準備5ml5mg/ml的rhG-CSF，100mMNaAc(pH5.0)，然后加入平均分子量為20KDa的MPEG-ALD(聚乙二醇-丙醛，直鏈)和20mMNaCNBH4，在4度下輕輕攪動16h后，SDS-PAGE分析結果表明16個小時后rhG—CSF的修飾率已經達到90%以上，包括單修飾和多修飾的PEG-rhG-CSF(圖2，泳道3)。rhG-CSF-Lys。的PEG修飾準備5ral2mg/ml的rhG-CSF-Lys。(19號)，100mMPBS(Ph7,5)，然后加入平均分子量為20KDa的MPEG-ALD(聚乙二醇-丙醛，直鏈)和20mMNaCNBH4，在25度下輕輕攪動4h后，SDS-PAGE分析結果表明4個小時后rmhG—CSF的修飾率已經達到95X以上，而且只有單修飾的PEG-rhG-CSF-LysD(圖2，泳道5)。因此，利用rhG-CSF-LysD進行PEG修飾有以下兩個優點(1)修飾后的PEG-rhG-CSF-LysD均是單修飾的(圖2，泳道5),沒有rhG-CSF進行PEG修飾后產生的多修飾和不定點修飾問題。這為后續的純化和規模法生產提供了方便；(2)反應效率高，最高可以達到95%-99%;反應時間短，反應時間在4h內完成。b.PEG-rhG-CSF-LysD的制備然后用注射用水把反應液稀釋到lmg/ml，pH以稀鹽酸調至4.0，過source30S離子交換柱(16X10)，在0-0.5MNaCl,20mMNaAc(pH4.0)中梯度洗脫，其中單修飾的PEG-rhG-CSF-LysD在20X梯度洗脫下。收集和合并峰(圖3)，SDS-PAGE電泳顯示該峰為單條帶，收率達到50%以上實例3PEG-rhG-CSF-LysD等生物學活性的分析體外生物活性的測定采用MTT方法((WelteK等，ProcNatAcadSci，82:1526-1530(1985))。具體步驟為在96孔細胞培養板中接種一定濃度的細胞懸液(50uL/孔)，將rhG-CSF標準品(中國藥品生物制品檢定所)和修飾rhG-CSF樣品系列對倍稀釋，各取50!iL加入培養板相應孔中。設陽性對照、陰性對照(不含rhG-CSF)和空白對照(只含培養液)，37°C,5%C02培養36-48h，加MTT溶解液100uL/孔，次日測定各孔A57。/A63。值。經生物學活性測定顯示(表5)修飾前的rhG-CSF和rhG-CSF-Ly^分別為0.82xl08IU/mg和0,78xl08IU/mg，兩者活性相當，說明我們篩選到高活性的rhG-CSF-LysD;而修飾后的PEG-rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-Lys。分別為0.58xl08IU/mg和0.57xl08IU/mg，兩者活性還是相當，說明rhG-CSF和rhG-CSF-LysD的PEG修飾過程和性質是相似的，而且PEG修飾的rhG-CSF-LysD更定點和專一。表5.各種G-CSF體外生物學活性比較SpecificRelativebioactivitybioactivity(%)(X108IU/mg)(%)rhG-CSF0.82100PEG-rhG-CSF0.5871rhG-CSF-LysD0.7895PEG-rhG-CSF-LysD0.5770實例4PEG-rhG~CSF-LysD體內藥物代謝動力學和藥效動力學的分析藥代動力學的測定采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣品中rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-LysD的血藥濃度。每組三只18~22g雄性SPF級ICR小鼠，參照表6進行注射和采集血樣后，再將血樣離心30min后分離血清，-20。C保存待測。用雙抗體夾心ELISA法檢測樣品中rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-LysD的血藥濃度，具體操作參見HumanG-CSFDuoSet試劑盒(R&DSystems)的操作手冊。得到標準品的數據用MicroCalOrigin軟件中的四參數邏輯曲線繪制標準曲線，并求回歸方程及相關統計參數；用MicrosoftExcel2003軟件將樣品數據代入標準曲線的回歸方程計算相關數值并作圖；最后用3P87軟件進行曲線擬合并計算主要藥代動力學參數。表6皮下給藥和取樣方法樣品動物數量劑量給藥給藥取樣時間途徑時間PEG-rhG-CSF-Lys039lmg/kgSCDl0，0.5,2，4，8，12，24,48，72,96,120hrhG-CSF30lmg/kgSCDl0，5，15，30min，1，2，4,8，12，24,48hSC=subcutaneous;Dl=firstday結果rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-Lys"j、鼠皮下給藥(subcutaneous,SC)后的血藥濃度-時間數據主要藥動學參數見表7，PEG-rhG-CSF-Ly^與rhG-CSF在小鼠體內的血藥濃度-時間曲線比較見圖4。從表7中可看到rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-Lys"血清中藥物的半衰期(T1/2)分別為2.2h和14.6h,后者是前者的7倍；PEG-rhG-CSF-Lys。的AUC值為14400nghml-1，是rhG-CSF的16倍；從圖4的血藥濃度-時間曲線圖可直觀看出，達峰時間PEG-rhG-CSF-LysD明顯大于rhG-CSF，并且在70h后在血液中可以檢測到PEG-rhG-CSF-LysD的血藥濃度，血藥濃度的波動顯著減少。從上述藥代參數對比來看，PEG修飾技術確實可以延長rhG-CSF的半衰期，從而達到長效的目的。表7小鼠皮下給藥后rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-LysD<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>CL/f(s)L.h-l.kg-l0.115±0.0260.007±0.002V/f(c)L.kg—10.352±0.0290.162±0.028Abbreviations:SC=subcutaneous;T1/2=terminalhalf-life;T(peak)=timeofmaximumconcentration;C(max)=maximumconcentration;AUC=areaunderthecurve;CL/f(s)=clearanceoverbioavailability;V/f=volumeofdistributionusingtheterminalphase.藥效動力學的分析自中科院上海實驗動物中心購入l纊23glCR小鼠245只(125只雄性，120只為雌性)，除正常對照組注射等量的生理鹽水外，其余小鼠注射環磷酰胺lmg/10g體重，連續3天，隨機取正常和造模小鼠5只，經測試造模成功。將造模成功小鼠隨機分成3組，分組和給藥見下表8，給藥劑型為水針，每毫升含6mg的mPEG-rhG-CSF-LysD，0.35mg乙酸鈉，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20,和0.02mg的氯化鈉，pH為4.0。采集各組給藥后D2、D4、D6、D8天各5只小鼠血樣進行血細胞計數和白細胞分類計數和評價。表8分組和給藥<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>Dl結果如下表9、圖5分別為小鼠皮下給藥后rhG-CSF、PEG-rhG-CSF_Lys°和對照的白細胞總數表和圖。從中可看出PEG-rhG-CSF-LysD對環磷酰胺引起的小鼠白細胞減少癥有升白作用，其5天一次注射的效果與每天注射的rhG-CSF效果相當。表9小鼠皮下給藥后rhG-CSF、PEG-rhG-CSF-LysD和對照的的白細胞總數<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>序列表〈110〉杭州九源基因工程有限公司〈120>聚乙二醇單修飾的重組人集落細胞刺激因子賴氨酸缺陷體〈160>4〈170〉Patentlnversion3.3〈210>SeqIDNo.1<21]>175〈212>PRT<213>智人(Homosapiens)<鄉〉SeqIDNo.1MetThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGinSerPheLeuLeu151015MetCysLeuGluGinVaJAryArglieGinGlyAspGlyAlaAlaLeu202530GinGluleuLeuCysAlaThrTyrArgLeuCysHisProGluGluLeu354045ValLeuLeuGlyHisSerLeuGlylieProTrpAlaProLeuSerSer505560CysProSerGinAlaLeuGinLeuAlaGlyCysLeuSerGinLeuHis65707580SerGlyLeuPheLeuTyrGinGlyLeuLeuGinAlaLeuGluGlylie859095SerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGinLeuAspvalAla100105110AspPheAlaThrThrlieTrpGinGinMetGluGluLeuGlyMetAla115120125ProAlaLeuGinProThrGinGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAla130135140PheGinArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGinSer0PheLeuGluvalSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGinPro165170175<210>SeqIDNo.2〈211>175〈212>PRT〈213〉智人(Homosapiens)<400>SeqIDNo.2MetThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGinSerPheLeuLeu151015AlaCysLeuGluGinValAryHislieGinGlyAspGlyAlaAlaLeu202530GinGluArgLeuCysAlaThrTyrValLeuCysHisProGluGluLeu354045ValLeuLeuGlyHisSerLeuGlylieProTrpAlaProUuSerSer505560CysProSerGinAlaLeuGinLeuAlaGlyCysLeuSerGinUuHis65707580SerGlyLeuPheLeuTyrGinGlyLeuLeuGinAlaLeuGluGlylie859095SerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGinLeuAspvalAla100105110AspPheAlaThrThrlieTrpGinGinMetGluGluLeuGlyMetAla115120125ProAlaLeuGinProThrGinGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAla130135140PheGinArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGinSer0PheLeuGluvalSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGinPro165170175〈210>SeqIDNo.3<211>175<212>PRT〈213>智人(Homosapiens)〈400〉SeqIDNo,3MetThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGinSerPheLeuLeu151015ArgCysLeuGluGinValArylielieGinGlyAspGlyAlaAlaLeu202530GinGluArgLeuCysAlaThrTyrArgLeuCysHisProGluGluLeu354045ValLeuLeuGlyHisSerUuGlylieProTrpAlaProLeuSerSer505560CysProSerGinAlaLeuGinLeuAlaGlyCysLeuSerGinLeuHis65707580SerGlyLeuPheLeuTyrGinGlyLeuLeuGinAlaLeuGluGlylie859095SerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGinLeuAspvalAla100105110A印PheAlaThrThrlieTrpGinGinMetGluGluLeuGlyMetAla115120125ProAlaLeuGinProThrGinGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAla130135140PheGinArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGinSer0PheLeuGluvalSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGinPro165170175〈210〉SeqIDNo.4<211>175〈212>PRT〈213〉智人(Homosapiens)〈400〉SeqIDNo.4MetThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGinSerPheLeuLeu151015ThrCysLeuGluGinValAryGlylieGinGlyAspGlyAlaAlaLeu202530GinGluArgLeuCysAlaThrTyrSerLeuCysHisProGluGluLeu354045ValLeuLeuGlyHisSerLeuGlylieProTrpAlaProteuSerSer505560CysProSerGinAlaLeuGinLeuAlaGlyCysLeuSerGinLeuHis65707580SerGlyLeuPheLeuTyrGinGlyLeuLeuGinAlaLeuGluGlylie859095SerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGinLeuAspvalAla100105110A印PheAlaThrThrlieTrpGinGinMetGluGluLeuGlyMetAla115120125ProAlaLeuGinProThrGinGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAla130135140PheGinArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGinSer0PheLeuGluvalSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGinPro16517017權利要求1、一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體，其特征在于(1)所述的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體為將重組人粒細胞集落刺激因子一級結構中的Lys17、Lys24、Lys35和Lys41這4個賴氨酸殘基分別突變為除Lys外的其它19種人體天然氨基酸之一，并且突變后的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體基本保留重組人粒細胞集落刺激因子原有的生物學活性；(2)聚乙二醇定點結合于重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體的N-端。2、根據權利要求1所述的聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體，其特征在于所述的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體氨基酸序列與SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4中所示的序列一致。3、根據權利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體，其特征在于所述的聚乙二醇為帶有氨基反應基團的聚乙二醇分子。4、根據權利要求3所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體，其特征在于所述的聚乙二醇分子為PEG琥珀酰亞胺碳酸酯、PEG對硝基苯碳酸酯、PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯、PEG碳酰咪唑、PEG苯并三唑碳酸酯(BTC-PEG)、PEG苯基琥珀酰亞胺碳酸酯、甲氧聚乙二醇羥琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidylcarbonate,mPEG-SC)、甲氧聚乙二醇醛或將兩個線性的BTC-PEG或mPEG-SC鏈連到賴氨酸的a-氨基和e-氨基形成的分支狀的PEG衍生物等。5、一種含有如權利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體的生物制品，其特征在于所述制品含有至少90%以上的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體和至多10%的未發生聚乙二醇化的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體。6.權利要求1-5中任一項的生物制品在制備治療因放療、化療等引起的中性粒細胞減少癥藥物中的應用。7、一種制備如權利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體的方法，其包括如下步驟(1)在含水介質中，帶有氨基反應基團的聚乙二醇分子與重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體中的a-氨基反應；(2)任選地從反應混合物中分離聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體的產物。8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于重組人粒細胞集落剌激因子賴氨酸缺陷體蛋白濃度大于l毫克/毫升，蛋白質:PEG分子的比例在1:1-1:20之間。9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于含水介質的pH條件為酸性、中性或堿性。10.根據權利要求7-9任一項所述的方法，其特征在于所述的聚乙二醇分子為PEG琥珀酰亞胺碳酸酯、PEG對硝基苯碳酸酯、PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯、PEG碳酰咪唑、PEG苯并三唑碳酸酯(BTC-PEG)、PEG苯基琥珀酰亞胺碳酸酯、甲氧聚乙二醇羥琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidylcarbonate,mPEG-SC)、甲氧聚乙二醇醛或將兩個線性的BTC-PEG或mPEG-SC鏈連到賴氨酸的a-氨基和e-氨基形成的分支狀的PEG衍生物等。全文摘要本發明公開了一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(PEG-rhG-CSF-Lys^D)。通過噬菌體展示技術表達所有賴氨酸突變的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-Lys^D)，然后利用重組人粒細胞集落刺激因子受體篩選出具有高活性的rhG-CSF-Lys^D。最后，高活性的重組人粒細胞集落刺激因子賴氨酸缺陷體(rhG-CSF-Lys^D)經聚乙二醇氨基反應試劑定點化學修飾，獲得N端定點修飾結構均一的PEG-rhG-CSF-Lys^D產物。該產物可以用來治療因放療、化療等引起的中性粒細胞減少癥。文檔編號A61K47/48GK101352573SQ20071007037公開日2009年1月28日申請日期2007年7月27日優先權日2007年7月27日發明者劉曉妮,單劍峰,徐飛虎,戎亞雯,方井晉,王同映,榮金,馬國昌,黃巖山申請人:杭州九源基因工程有限公司