一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，包括：對rhG-CSF基因工程菌進行發酵培養，然后將培養菌體混懸于裂解液中，制得包涵體；將包涵體進行變性處理，然后用柱層析進行復性，得rhG-CSF復性液；最后進行陽離子層析和凝膠過濾層析，收集得到重組人粒細胞集落刺激因子。采用柱層析復性的方法，簡化了操作方式，使重組人粒細胞集落刺激因子的復性收率高于70%；復性液經過陽離子交換和分子篩層析后制備成rhG-CSF的原液。原液電泳純度達到99%以上，RP-HPLC的純度達到98%以上，比活性6.6×107IU/mg。
【專利說明】一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制藥領域【技術領域】，特別涉及一種重組人粒細胞集落刺激因子 (recombinant human granulocyte colony stimulating factor, rhG-CSF)的制備方法。

【背景技術】
[0002] 人粒細胞集落刺激因子（human granulocyte colony stimulating factor， hG-CSF)屬于造血生長因子家族。內毒素、TNF-a和IFN-γ可活化單核細胞和巨噬細胞產 生G-CSF。此外，成纖維細胞、內皮細胞、星狀細胞和骨髓基質細胞等在LPS、IL-1或TNF- α 刺激活化后也可分泌G-CSF。某些白血病細胞以及CHu-2人口腔癌細胞、5637人膀胱癌細 胞、MIAPa Ca-2胰腺癌細胞可組成性地表達G-CSF。
[0003] 1986年G-CSF cDNA克隆成功，C-CSF基因全長2. 5kb，包括5個外顯子和4個內含 子。人類有兩種不同的G-CSF cDNA，分別編碼含207和204氨基酸的前體蛋白，均有30個 氨基酸的先導序列，成熟蛋白分子分別為177和174個氨基酸，前者除了在成熟分子N端35 位處插入了 3個氨基酸外，其余的序列與174氨基酸分子相同，人G-CSF分子量為19. 6kDa， PI6. 1，0-糖基化，對酸堿（pH2?10)、熱以及變性劑等相對較穩定。G-CSF有5個半胱氨 酸，Cys36與Cys42, Cys74與Cys64之間形成兩對二硫健，Cysl7為不配對半胱氨酸，二硫 鍵對于維持G-CSF生物學功能是必須的因素。
[0004] 人粒細胞集落刺激因子（hG-CSF)是一種在哺乳動物中調節粒細胞(尤其是中性粒 細胞)成熟與生長的造血生長因子。它通過刺激粒細胞巨噬細胞集落形成單位（CFU-GM)向 粒細胞集落形成單位（CFU-G)的分化和成熟，動員成熟中性粒細胞向外周血的釋放，從而促 進中性粒細胞的生長。在臨床上用來治療各種原因引起的中性粒細胞減少癥，有很大的經 濟意義和社會意義。
[0005] hG-CSF的天然來源有限，產量甚微，還不能滿足臨床應用的需要。利用基因工程技 術生產是獲取大量hG-CSF的一條途徑。天然hG-CSF雖是一種糖蛋白，但文獻報導，未經糖 基化和利用大腸桿菌表達的重組hG-CSF具有與天然hG-CSF同樣的生物活性。
[0006] 利用基因工程手段構建的表達外源目的基因的菌株常采用大腸桿菌表達系統，目 的蛋白多以包涵體形式表達于菌體內。在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生 物大分子，它們致密地集聚在細胞內，或被膜包裹或形成無膜裸露結構，這種水不溶性的結 構稱為包涵體。包涵體一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、夕卜 膜蛋白、環狀或缺口的質粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0. 5-lum，難溶于水，只溶于變 性劑如尿素、鹽酸胍等。包涵體的形成主要因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質 折疊的輔助因子或環境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。
[0007] 包涵體是以表達產物為主，聚集形成的蛋白性質顆粒，目的蛋白具有正確的一級 結構順序，但缺乏正確的構象，因而不具備其生物活性。表達蛋白必須經過變性和復性的過 程，使包涵體折疊成為正確的高級結構，才能具有生物活性。包涵體在蛋白變性劑的作用 下，成為可溶性的伸展狀態，通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態恢復 到正常的折疊結構，形成具有天然生物活性的天然結構。在去除變性劑的同時，分子內部的 二硫鍵、疏水鍵等往往來不及形成，從而導致分子間存在大量錯誤的折疊和聚合，以至蛋白 沉淀。復性是一個非常復雜的過程，除與蛋白質復性的過程控制相關外，很大程度上與蛋白 質本身的性質有關。一般說來，蛋白質的復性效率在20%左右。影響復性效率的因素有蛋 白質的復性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強度、共溶 劑和其他添加劑的存在與否等。
[0008] 目前，蛋白質的復性方法主要有稀釋復性、透析復性、超濾復性等方法。但這些方 法存在設備要求高、收率低、操作繁瑣、易產生蛋白沉淀等諸多問題。因此，把rhG-CSF包涵 體復性為有生物活性的蛋白質，并盡可能提高復性收率，是一個很大的挑戰。


【發明內容】

[0009] 本發明所要解決的技術問題是提供一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法， 采用柱層析復性的方法，簡化了操作方式，使重組人粒細胞集落刺激因子的復性收率高于 70% ;復性液經過陽離子交換和分子篩層析后制備成rhG-CSF的原液。原液電泳純度達到 99%以上，RP-HPLC的純度達到98%以上，比活性6. 6X 107IU/mg。
[0010] 本發明的一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，包括：
[0011] (1)對rhG-CSF基因工程菌進行發酵培養，然后將培養菌體混懸于裂解液中，經超 聲破碎和離心處理，制得包涵體；
[0012] (2)將上述包涵體經洗滌和溶解后，進行變性處理，得到變性蛋白溶液；
[0013] (3)將所得變性蛋白溶液進行稀釋，然后用柱層析進行復性處理，得rhG-CSF復性 液；
[0014] (4)將復性液直接進行陽離子層析和凝膠過濾層析，收集得到重組人粒細胞集落 刺激因子。
[0015] 所述步驟（1)中的裂解液為 20mMTris-HCl，EDTAlmM，DTT1. 5g/L，ρΗ8· 0 ;
[0016] 所述步驟（2)中用溶液6Μ鹽酸胍，20mM醋酸-醋酸鈉，ρΗ5. 4對包涵體進行變性 處理；
[0017] 所述步驟（3)中用稀釋液6Μ鹽酸胍，20mM醋酸-醋酸鈉，ρΗ5. 4將變性蛋白溶稀 釋到1?2mg/ml ;
[0018] 所述步驟（3)中的柱層析，所用層析介質為Sephadex G_25coarse、Sephadex G_25media、Sephadex G_25fine 或 Sephadex superfine ；
[0019] 所述步驟（3)中的柱層析，層析柱直接在5_20cm，柱床高度60-100cm ;
[0020] 所述步驟（3)中的柱層析，層析上樣蛋白濃度1. 0?2. Omg/ml，上樣體積小于柱床 體積的20%，上樣和洗脫流速為5-lOcm/h ;
[0021] 所述步驟（3)中的柱層析，所用洗脫液為pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液。
[0022] 本發明的柱層析復性主要是使用脫鹽的原理，變性劑是高濃度的鹽，在層析過 程中，被緩慢的脫去，rhG-CSF隨著變性劑濃度逐漸降低，而重新折疊變成具有活性的 rhG-CSF 分子。
[0023] 有益效果
[0024] 本發明采用柱層析復性的方法，簡化了操作方式，使重組人粒細胞集落刺激因子 的復性收率高于70%。柱層析所收獲的復性液無沉淀，溶液澄清透明，可以直接進行下一步 的純化分離。復性液經過陽離子交換和分子篩層析后制備成rhG-CSF的原液。原液電泳純 度達到99%以上，RP-HPLC的純度達到98%以上，比活性6. 6X 107IU/mg。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為RP-HPLC空白對照圖譜；
[0026] 圖2為柱層析復性后收集的洗脫峰RP-HPLC純度檢測圖譜；
[0027] 圖3為rhG-CSF原液RP-HPLC純度檢測圖譜；
[0028] 圖4為rhG-CSF原液的純度非還原性SDS-PAGE圖譜；
[0029] 圖5為rhG-CSF原液的還原性SDS-PAGE圖譜。

【具體實施方式】
[0030] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0031] 實施例
[0032] rhG-CSF包涵體的獲取
[0033] rhG-CSF基因工程菌(工程菌株pBVQG8/MM294,由中國軍事醫學科學院提供）按常 規的高密度發酵(采用分批補料培養方式進行工程菌發酵，當菌體密度達0D值到達30時， 對工程菌進行誘導發酵，表達外源蛋白；其中，補料培養基配方為：酵母浸出粉450g/L、葡 萄糖500g/L ;發酵培養基配方為：蛋白胨12g/L、酵母膏24g/L、甘油4ml/L、葡萄糖20g/L、 磷酸二氫鉀2. 31g/L、磷酸氫二鉀12. 54g/L、硫酸鎂0. 75g/L)后，采用8000g離心力收集菌 體。
[0034] 收集后的濕菌體，放置于_20°C，凍融一次。取400克凍融后的菌體，按固液比1:10 (g/ml)比例混懸于裂解液中（20mMTris-HCl，EDTAlmM，DTTl. 5g/L，pH8. 0)，混合成均一的懸 液后，使用大功率超聲波細胞破碎儀對混懸液進行破菌及勻漿處理，l〇〇〇〇g離心力離心收 集包涵體60克。離心機為Avanti J-25, Beckman公司。
[0035] rhG-CSF包涵體的洗滌和溶解
[0036] 收集的包涵體60g依次用注射用水、A液（ImM EDTA，0. 1M NaCl)、B液 (50mMTris-HCl，5mM DTT，5mM EDTA，1% 脫氧膽酸鈉，ρΗ9·0)進行洗滌，采用 10000g 離心力 離心收集包涵體70g ;然后將收集的包涵體70g用C液（50mMTris-HCl，2%十二烷基肌氨酸 鈉，PH8. 0)溶解，室溫攪拌過夜，用丙酮沉淀蛋白，獲得高純度的包涵體50g。
[0037] rhG-CSF包涵體的變性處理
[0038] 取上述包涵體，用D液（6M鹽酸胍，20mM醋酸-醋酸鈉，pH5. 4)溶液進行變性，室溫 溫和攪拌2-3小時，采用33000g離心力離心收集上清液，即為rhG-CSF蛋白變性溶液。采 用考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度，用D溶液（6M鹽酸胍，20mM醋酸-醋酸鈉，pH5. 4)將其蛋白 濃度稀釋至1. 5mg/ml，準備進行柱上復性。
[0039] rhG-CSF包涵體的柱層析復性
[0040] 使用XK50/100柱子，柱床高度80cm，層析介質為Sephadex G_25media。先用 0. 2MNa0H清洗1個柱體積，注射用水沖洗3個柱體積，用pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液 平衡柱子至少3個柱體積，待電導和pH值穩定后上樣。
[0041] 上樣體積200ml，流速5cm/h，上樣完畢后，用pH5. 420mM醋酸-醋酸鈉緩沖液進行 洗脫，洗脫流速5cm/h，收集洗脫峰，洗脫峰即為rhG-CSF復性液。洗脫峰進行RP-HPLC檢測 (圖2)，如圖所示，正確構象的rhG-CSF的含量高達95. 4%，異構體雜質含量為4. 6%。
[0042] rhG-CSF 的精純
[0043] 將復性后的rhG-CSF溶液，上樣于CM-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析介 質，用pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡2個柱體積，用0. 3M NaCl溶液進行洗脫，收集 洗脫峰。上樣、平衡和洗脫流速均為lOcm/h。
[0044] 離子交換洗脫峰進行進一步的分子篩凝膠過濾層析。層析介質選用Sephacryl S200層析介質，用pH4. OlOmM醋酸-醋酸鈉緩沖進行洗脫，收集洗脫峰。洗脫峰合并即為 rhG-CSF原液。原液進行非還原性SDS-PAGE電泳（圖4)和還原性SDS-PAGE電泳（圖5)電 泳純度均為100%。RP-HPLC檢測（圖3)，其純度為100%。
[0045] 按照中國藥典進行活性檢測，其活性高達7. 6X 107IU/mg。
[0046] 雖然本發明已將較佳實施例揭示如上，然其并非用以限定本發明的內容，任何熟 悉此技藝者，在不脫離本發明的主要精神和內容范圍內，當可作各種更動與潤飾，因此發明 的保護范圍應以申請專利的實際權利要求范圍為準。
【權利要求】
1. 一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，包括： (1) 對rhG-CSF基因工程菌進行發酵培養，然后將培養菌體混懸于裂解液中，經超聲破 碎和離心處理，制得包涵體； (2) 將上述包涵體經洗滌和溶解后，進行變性處理，得到變性蛋白溶液； (3) 將所得變性蛋白溶液進行稀釋，然后用柱層析進行復性處理，得rhG-CSF復性液； (4) 將復性液進行陽離子層析和凝膠過濾層析，收集得到重組人粒細胞集落刺激因子。
2. 根據權利要求1所述的一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（1)中的裂解液為 20mMTris-HCl，EDTAlmM，DTT1. 5g/L，ρΗ8· 0。
3. 根據權利要求1所述的一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（2)中用溶液6Μ鹽酸胍，20mM醋酸-醋酸鈉，ρΗ5. 4對包涵體進行變性處理。
4. 根據權利要求1所述的一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（3)中用稀釋液6Μ鹽酸胍，20mM醋酸-醋酸鈉，ρΗ5. 4將變性蛋白溶稀釋到1? 2mg/ml〇
5. 根據權利要求1所述的一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（3)中的柱層析，所用層析介質為Sephadex G_25coarse、Sephadex G_25media、 Sephadex G_25fine 或 Sephadex superfine。
6. 根據權利要求1所述的一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（3)中的柱層析，層析柱直接在5-20cm，柱床高度60-100cm。
7. 根據權利要求1所述的一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（3)中的柱層析，層析上樣蛋白濃度1. 0?2. Omg/ml，上樣體積小于柱床體積的 20%，上樣和洗脫流速為5-10cm/h。
8. 根據權利要求1所述的一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（3)中的柱層析，所用洗脫液為pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液。
【文檔編號】C07K14/53GK104120159SQ201310150982
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月26日 優先權日:2013年4月26日
【發明者】岑仡, 宋宏 申請人:上海三維生物技術有限公司