專利名稱：一種重組人粒細胞集落刺激因子的rp-hplc檢測方法
技術領域：
本發明涉及蛋白分析領域，具體地說，涉及一種精確測定重組人粒細胞集落刺激 因子化學穩定性的RP-HPLC方法。
背景技術：
DNA重組技術的出現使得大量的重組蛋白質成功應用于治療各種疾病，其中細胞 因子類就包括促紅細胞生成素(EPO)、干擾素(IFN-α，IFN-β、IFN-γ )、粒細胞集落刺激 因子(G-CSF)，巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)以及白細胞介素(IL)等。與小分子化學藥 相比，重組藥物蛋白質在較低濃度下就具有較高的活性和特異性。但是由于重組蛋白質本 身的物理及化學不穩定性，一般都采用注射給藥的方式。為了確保一定的有效期，藥用蛋白 質一般需要冷藏或者冷凍干燥以固體形式存放。蛋白質長期保藏中的不穩定性的主要原因是脫酰胺作用[Robinson NE. Protein deamidation[J], Proc Natl Acad Sci U S A. 2002,99(8) :5283_5288.]、氧化作 用[Stadtman, E R, Levine, R L Protein Oxidation[J].Ann. N. Y. Acad. Sci.,2000, 899 :191-208]禾口蛋白質聚集[Wang W. Protein aggregation and its inhibition in biopharmaceutics[J]. Int J Pharm. 2005，289 :1-30]。蛋白質氨基酸組成中的天冬酰胺 和谷氨酰胺都會發生脫酰胺作用，而且天冬酰胺比谷氨酰胺更容易發生脫酰胺作用。由于 rhG-CSF不含天冬酰胺(Asn)但含有17個谷氨酰胺，因此脫酰胺作用發生在谷氨酰胺上， 但是由于其制劑長期保存于PH4.0的微酸環境，脫酰胺作用相對不明顯。據Stadtman，E R 報道，蛋白質組成中的組氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸殘基容易被氧化，尤 其是甲硫氨酸和半胱氨酸更容易被氧化。重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)只有一個游離的半胱氨酸(Cys17)，含有4 個甲硫氨酸殘基，因此氧化主要發生在是Met上，四個甲硫氨酸被氧化的容易程度為=Met1 > Met138 > Met127 > Met122 [Reubsaet J L, Beijnen J H, Bult A. Oxidation of recombinant methionyl human granulocyte colony stimulating factor[J]. J Pharm Biomed Anal.， 1998，17 (2) =283-289]。各種環境條件，如曝光、儲藏溫度和活性氧對氧化作用影響較大，而 且制劑中吐溫80等輔料中含有的微量過氧化氫也是甲硫氨酸氧化的原因之一。在重組蛋 白制劑生產過程中可能混入少量的過渡態金屬離子也有可能導致蛋白質中氨基酸的氧化。 因此，有必要采用準確靈敏的分析方法來測定重組蛋白如重組人粒細胞集落刺激因子及其 注射液中在各種環境下穩定性情況。基于C4柱和C18柱的反相色譜法常用于檢測重組人粒細胞集落刺激因子及其注 射液中有效成分純度。已知重組人粒細胞集落刺激因子在穩定性試驗中主要是甲硫氨酸 殘基等發生氧化，已經知道有Met1，Met138, Met127, Met122都容易被氧化，因此有多種氧化形 式產生，但彼此間疏水性差異很小，由于C4柱的疏水性比C18柱弱，C4柱可能更適合用于 rhG-CSF 產品純度測定。《歐洲藥典》6. 3 版[European Pharmacopoeia 6. 3. Filgrastim concentrated solution[S]. 01/2009 :2206，EDQM]首先采用的 C18 柱，現行 6. 8 版[European Pharmacopoeia 6.8. Filgrastim concentrated solution[S]· 07/2010 :2206, EDQM]，反映出C4柱檢測具有更高的靈敏度。但是《中國藥典》2010版還是采用C18柱的方法。其他公開文獻中關于穩定性試驗采用的液相色譜法主要有分子篩HPLC[謝異泓， 鐘英，黃建宏.中國醫藥工業雜志，2000，31 (03) :123-124;趙先亮，黃玉錄，王春雨，等.齊 魯藥事，2007，26 (06) :342-344]、反相層析C4柱[謝異泓，鐘英，黃建宏.中國醫藥工業雜 志，2000，31 (03) 123-124;鐘英.中國現代應用藥學，2000，17 (03) :220_222]，都不能靈敏 準確的檢測其氧化產物。Dalmora SL[Dalmora SL, Massiero S, Oliveira P, et al. Journal of liquid chromatography & related technologies，2006，29 1753-1767]采用了反相色譜法研 究rhG-CSF分子結構與生物活性分析之間的關系，采用的反相柱為Jupiter C4柱，規格為 4. 6 X 250mm,流速為0. 5mL/min,但是柱溫為25度，主峰保留時間為32min，并指出脫酰胺產 物在氧化峰與原型rhG-CSF之前出峰。這一結果不僅與《歐洲藥典》6. 8版相矛盾(脫酰胺 作用產物在原型rhG-CSF的1. 1倍保留時間處出峰)，也與我們的實驗結果相矛盾(采用 Vydac C4柱在主峰保留時間的1. 07處出峰)。

發明內容
本發明提供了一種重組人粒細胞集落刺激因子的RP-HPLC檢測方法，該方法包括 以下步驟(1)將重組人粒細胞集落刺激因子上樣于反相色譜柱，所述的重組人粒細胞集落 刺激因子的上樣量不低于6 μ g，所述的反相色譜柱為碳載量小于4%的C4柱，選自Vydac 柱子、Jupiter柱子或Devosil柱子；(2)進行梯度洗脫，洗脫流動相的乙腈梯度為0-30min內從25%提高至8075%，其 中流動相A為含三氟乙酸的水溶液，三氟乙酸濃度為0. 05-0. 1% ；流動相B為含三氟乙酸 的乙腈水溶液，三氟乙酸濃度為0. 05-0. 1%，乙腈濃度為72-100%;檢測波長為214nm或者 215nm，系統運行過程柱子溫度為60士3度。上述方法中，參照藥典要求，所述的重組人粒細胞集落刺激因子的上樣量優選不 低于10 μ go上述方法中，C4反相色譜柱可從商業渠道購買，例如Vydac柱子來自Grace公司， Jupiter柱子來自phenomenex公司，Devosil柱子來自Nomura公司；其中反相色譜柱優選 Grace 公司的 Vydac214TP5415，規格為 4. 6mmX 150mm,粒徑 5um,孔徑為 300nm。上述方法中，優選流動相A為含0. 1 %三氟乙酸的水溶液，流動相B為含0. 1 %三 氟乙酸的90%乙腈水溶液。上述方法中，乙腈梯度優選為0-30min內從36%提高至72%。上述方法中，系統運行過程中柱子溫度優選為60士 1度(°C)，最優為60度(。C)。上述方法中，洗脫流速為0. 6-lml/min，較優流速為0. 8ml/min。上述方法中，色譜儀可根據實際情況選用，優選使用安捷倫公司或島津公司制造的色譜儀。作為一種較為優選的測定重組人粒細胞集落刺激因子化學穩定性的RP-HPLC方法，該方法包括以下步驟(1)將重組人粒細胞集落刺激因子上樣于反相色譜柱，樣品上樣量不低于IOyg; 所述的反相色譜柱為Vydac 214TP5415,規格4. 6mmX 150mm,粒徑5um，孔徑為300nm ；(2)進行梯度洗脫，洗脫流動相的乙腈梯度為0-30min內從36 %提高至72 %，其中 流動相A為含0. 三氟乙酸的水溶液，所述的流動相B為含0. 三氟乙酸的90%乙腈水 溶液；流速為0. 6-lml/min，檢測波長為214nm，系統運行過程柱子溫度為60士 1度。目前已經報道了多種分析測定重組人粒細胞集落刺激因子化學穩定性的方法，例 如鐘英等[謝異泓，鐘英，黃建宏.中國醫藥工業雜志，2000,31(03) :123-124;鐘英.中國 現代應用藥學，2000，17(03) =220-222]的方法(A)如下色譜柱為C4柱(4. 6mmX 150mm)， 填料粒度為5 μ m,孔徑為300nm。流動相A 0. 1 %三氟醋酸(W/V)在注射用水中；流動相B
0.三氟醋酸(W/V)在乙腈水(9 1)混合液中；流速設定0. Sml/min，梯度為30分鐘 流動相B由25%至80%，檢測波長214nm，系統運行過程柱子溫度為25度。本發明方法(B)的典型操作如下色譜儀為來自安捷倫公司的1100或1200，DAD 或者VWD檢測 器。采用自動進樣器，色譜柱為C4柱，來自Grace公司的Vydac 214TP5415， 規格4. 6mmX 150mm,粒徑5um，孔徑為300nm。柱溫為60度，檢測波長為214nm。流動相 A為含0. 1 % TFA的水溶液，流動相B為含0. 1 % TFA的90%乙腈水溶液。流速為0. 8mL/ min,梯度為0-30min從36 %到72 %乙腈梯度對應B相含量從40到80 %。上樣量為不低于 10 μ g0歐洲藥典6. 8版質量標準(C)如下色譜柱采用C4 ( 丁烷基)硅烷鍵合硅膠)為 填充劑，規格為4. 6mmX 250mm，粒徑5um，孔徑為300nm。流動相A 在IOOml的色譜級乙腈 中，加入899ml超純水(R)混合均勻，再加入Iml三氟乙酸，混勻。流動相B 在199ml的超 純水中，加入800ml色譜級乙腈，再加入Iml三氟乙酸，混勻。在60°C溫度下進行梯度洗脫， 梯度0-35min 66 % B-73 % B, 35_50min 73 % B-90 % B, 50_60min 90 % B-66 % B0 上樣 量不低于10 μ g，流速為0. 6mL/min,于波長215nm處檢測。rhG_CSF保留時間大約在28分 鐘，rhG-CSF氧化峰1 =約0. 85倍；rhG_CSF氧化峰2 =約0. 95倍；脫酰胺作用產物=約
1.1倍。氧化峰1和2的分離度大于1. 5。每個單雜的比例均不大于2. 0%，總雜質不大于 3. 5%。歐洲藥典6. 3版質量標準(D)如下色譜柱采用C18 (十八烷基硅烷)鍵合硅膠為 填充劑，規格為4. 6mmX 150mm,粒徑3um，孔徑為200nm。流動相A 在499ml的色譜級乙腈 中，加入500ml超純水(R)混合均勻，再加入Iml三氟乙酸，混勻。流動相B 在49ml的超 純水中，加入950ml色譜級乙腈，再加入Iml三氟乙酸，混勻。在65°C溫度下進行梯度洗脫， 梯度如下:0-4min 8% B，4_19min 8~28% B, 19-19. Imin 28-100% B, 19. l_21min 100% B,21-21. Imin 100-8% B,21. l_25min 8% B。上樣量不低于 10 μ g,流速為 1. OmL/min, 于波長215nm處檢測。rhG-CSF保留時間大約在12分鐘，rhG-CSF氧化峰1 =約0. 90倍； rhG-CSF氧化峰2 =約0. 95倍。每個單雜的比例均不大于2. 0%，總雜質不大于3. 5%。中國藥典2010版質量校準(E)如下色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充 齊U;以A相(三氟乙酸-水溶液取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻)、B相(三氟 乙酸_乙腈溶液取1. Oml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，充分混勻)為流動相，在室 溫條件下，進行梯度洗脫(0 70%B相)。上樣量不低于10yg，于波長214nm處檢測，以G-CSF色譜峰計算理論板數應不低于1500。按面積歸一化法計算，重組人G-CSF主峰面積 應不低于總面積的95.0%。以上5個方法采用歐洲藥典標準品分別進行系統適應性試驗，統計結果如表1所 示。典型圖譜如

圖1所示。表1.五種不同的分析方法結果匯總
權利要求
1.一種重組人粒細胞集落刺激因子的RP-HPLC檢測方法，該方法包括以下步驟(1)、將重組人粒細胞集落刺激因子上樣于反相色譜柱，所述的重組人粒細胞集落刺激 因子的上樣量不低于6 μ g，所述的反相色譜柱為碳載量小于4%的C4柱，選自Vydac柱子、 Jupiter柱子或Devosil柱子；(2)、進行梯度洗脫，洗脫流動相的乙腈梯度為0-30min內從25%提高至75%，其中流 動相A為含三氟乙酸的水溶液，三氟乙酸濃度為0. 05-0. 1 % ；流動相B為含三氟乙酸的乙腈 水溶液，三氟乙酸濃度為0. 05-0. 1 %，乙腈濃度為72-100 % ；檢測波長為214nm或者215nm， 系統運行過程柱子溫度為60士3度；
2.根據權利要求1所述的RP-HPLC檢測方法，其特征在于，所述方法步驟(1)中，重組 人粒細胞集落刺激因子的上樣量不低于10 μ g。
3.根據權利要求1所述的RP-HPLC檢測方法，其特征在于，所述方法步驟(1)中的反相 色譜柱為 Vydac 214TP5415,規格為 4. 6mmX 150mm,粒徑 5um，孔徑為 300nm。
4.根據權利要求1所述的RP-HPLC檢測方法，其特征在于，所述方法步驟O)中，流動 相A為含0. 三氟乙酸的水溶液，流動相B為含0. 三氟乙酸的90%乙腈水溶液。
5.根據權利要求1所述的RP-HPLC檢測方法，其特征在于，所述方法步驟O)中，乙腈 梯度為0-30min內從36%提高至72%。
6.根據權利要求1所述的RP-HPLC檢測方法，其特征在于，所述方法步驟O)中，系統 運行過程中柱子溫度為60士 1度。
7.根據權利要求6所述的RP-HPLC檢測方法，其特征在于，所述方法步驟O)中，系統 運行過程中柱子溫度為60度。
8.根據權利要求1所述的RP-HPLC檢測方法，其特征在于，所述方法步驟O)中，洗脫 流速為 0. 6-lml/min。
9.根據權利要求8所述的RP-HPLC檢測方法，其特征在于，所述方法步驟O)中，洗脫 流速為 0. 8ml/min。
10.一種重組人粒細胞集落刺激因子的RP-HPLC檢測方法，該方法包括以下步驟(1)、將重組人粒細胞集落刺激因子上樣于反相色譜柱，所述的重組人粒細胞集落刺激 因子上樣量不低于 ο μ g ；所述的反相色譜柱為Vydac 214TP5415，規格4. 6mmX 150mm,粒 徑5um,孔徑為300nm ；(2)進行梯度洗脫，洗脫流動相的乙腈梯度為0-30min內從36%提高至72%，其中流 動相A為含0. 三氟乙酸的水溶液，所述的流動相B為含0. 三氟乙酸的90%乙腈水溶 液；洗脫流速為0. 6-lml/min，檢測波長為214nm，系統運行過程柱子溫度為60士 1度。
全文摘要
本發明涉及一種重組人粒細胞集落刺激因子的RP-HPLC檢測方法。該方法采用Vydac C4柱，乙腈梯度洗脫，柱溫為60±3度。本方法使用的C4柱與中國藥典2010版使用的C18柱不同，但是檢測靈敏度和準確度更高。而歐洲藥典雖然采用C4柱，但是其所使用的乙腈梯度范圍較小，分離時間較長，因此新方法比歐洲藥典能夠更快捷、更準確的測定重組人粒細胞集落刺激因子在不同存儲條件下的穩定性。本發明對現有藥典記載的重組人粒細胞集落刺激因子的檢測分析方法進行了改進，使之更適用于rhG-CSF產品純度檢測，檢測靈敏度和準確度更高。該方法對其他重組蛋白的穩定性試驗方法的發展亦具有重要的參考意義。
文檔編號G01N30/89GK102128907SQ20101052364
公開日2011年7月20日 申請日期2010年10月27日 優先權日2010年10月27日
發明者方井晉, 李輝, 沈玲, 郭旺明, 陳海紅 申請人:杭州九源基因工程有限公司