專利名稱：重組人粒細胞集落刺激因子的復性純化工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物制藥領域，涉及重組人粒細胞集落刺激因子(recombinanthuman granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)的制備方法。
背景技術：
人粒細胞集落刺激因子(human granulocyte colony stimulating factor，hG-CSF)屬于造血生長因子家族，主要產生細胞有單核一巨噬細胞、內皮細胞、成纖維細胞及某些腫瘤細胞如5637、CHU-2、ST-1等。hG-CSF是造血生長因子中特異地作用于粒系組細胞，促進其向成熟中性粒細胞增殖、分化的一種細胞因子。已經報道的hG-CSF沒有種屬特異性，它可以增強中性粒細胞的功能，增加成熟粒細胞數，促進中性粒細胞和祖細胞由骨髓釋放入外周血中，并可以增加多種早期祖細胞，從而促進造血干細胞由靜止期進入循環。
hG-CSF在各種原因造成的粒細胞減少癥中得到了非常廣泛的臨床應用，但是體內含量甚微，主要的生產途徑是通過基因工程方法。1980年，日本東京大學醫學研究所新藥研究實驗室的Shigekazu Nagata等通過測定純化的G-CSF的部分氨基酸序列，構建了寡核苷酸探針，從CHU-2細胞mRNA所構建的cDNA文庫中得到了含有G-CSF片斷的cDNA，并用COS細胞表達出有活性的G-CSF蛋白(Nagata S，et al，Nature，1986，319415-418)。L.M.Souza等在人膀胱癌細胞系5637的培養液中也分離到了人G-CSF的基因，并通過E.Coli表達得到了具有多潛能生物活性的rhG-CSF蛋白(Souza L M，et al，Sicense，1986，23261-65)。
大腸桿菌(E.coli)表達系統是生產外源蛋白的主要方法，但是外源蛋白的高表達，往往使蛋白不能折疊成為具有一定空間結構和特定生物學功能的蛋白質，而是聚集成直徑為0.5～1μm的不可溶的致密顆粒，稱為包涵體(InclusionBody，IB)。包涵體形成的主要原因是因為外源蛋白在表達過程中，缺乏某些蛋白質折疊過程中需要的酶和輔助因子，或者是因為表達宿主的環境不合適，在表達過程中無法折疊形成正確的高級結構(Li lie H，et al，Curr OpinBiot，1998，9442)。以E.Coli為表達系統生產rhG-CSF，表達時也形成不溶性的包涵體。
包涵體的形成雖然能夠有效的防止細胞內蛋白酶的水解，使表達蛋白易于與其它雜蛋白分離，但是表達蛋白必須經過變性和復性過程，使包涵體折疊成為正確的高級結構，才能具有生物活性。包涵體在蛋白變性劑的作用下，成為可溶性的伸展狀態，在去除變性劑或者變性劑的濃度降低時，蛋白自發的從變性的熱不穩狀態向穩定狀態轉換，形成具有生物活性的天然結構。然而在去除變性劑的同時，分子內部的二硫鍵、疏水鍵等往往來不及形成，從而導致分子間存在大量錯誤的折疊和聚合，以至蛋白沉淀，使復性收率大大降低，平均只有20％左右。
目前，蛋白質的復性方法主要有稀釋復性法、透吸、超濾、凝膠過濾色譜等溶劑交換法，以及將變性蛋白吸附至固相支持物上的柱復性方法等等(US5849883、CN1083488、US2005159589、《軍事醫學科學院院刊》2000年第3、4期)。但上述方法存在設備要求高、收率低、操作繁瑣、存在異構體、易產生沉淀等諸多問題。因此，把rhG-CSF包涵體復性為有生物活性的蛋白質，并盡可能提高復性收率，對生物工作者來說，是一個很大的挑戰。

發明內容
本發明提供了一種能夠工業化生產的重組人粒細胞集落刺激因子的復性方法。針對重組人粒細胞集落刺激因子在生產中存在的制備過程復雜、存在異構體和復性收率低的問題，本發明設計了能夠顯著提高復性收率、減少異構體，設備要求簡單、成本低的復性液配方和復性方案。
本發明通過改變復性液組成中的離子強度、氧化還原劑比例、增加添加劑等，并使用合適的裂解和復性方法進行包涵體的裂解和復性，使重組人粒細胞集落刺激因子的復性質量收率高于50％；復性液基本不含異構體，而且復性溶液完全澄清，沒有沉淀，不需離心和透析即可以進行下一步的層析分離；經進一步層析純化后，RP-HPLC的純度即可達97％以上，高于《中華人民共和國藥典2005版》第三部的要求。
本發明利用rhG-CSF基因工程菌，按照常規發酵技術發酵后，取濕菌體，用常規中性PBS緩沖液洗去菌體中夾帶的未利用的培養基。洗滌后的菌體再重新置于同樣的PBS緩沖液中，用高壓勻漿法或超聲破碎法破碎菌體，收獲包涵體粗品。包涵體粗品用含有Urea和Triton的Tris-HCl緩沖液洗滌，獲得高純度包涵體。
將洗滌后的包涵體用含有Urea的裂解液進行裂解，得到均一澄清的裂解液，離心，并使用SephadexG-25層析除去裂解液中過量的還原劑。利用本發明的復性液將rhG-CSF包涵體的裂解上清液稀釋、復性。
本發明的rhG-CSF包涵體復性液由鹽酸胍(Guanidine-HCl)30-150mmol/L，尿素(Urea)0.3-2.5mol/L，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)20-150mmol/L(pH7.0-9.0)，半胱氨酸(Cysteine)0.2-5mmol/L，胱氨酸(Cystine)0.04-1mmol/L甘油(Glycerol)1-6％和適量的去離子水組成。優選Guanidine-HCl為50-130mmol/L，Urea為0.6-2.0mol/L，Tris-HCl為40-120mmol/L(pH7.2-8.8)，Cysteine為0.5-3mmol/L，Cystine為0.1-0.6mmol/L，Glycerol為2-5％。更優選Guanidine-HCl為60-100mmol/L，Urea為0.8-1.2mol/L，Tris-HCl為60-100mmol/L(7.5-8.5)，Cysteine為1-2mmol/L，Cystine為0.2-0.4mmol/L，Glycerol為3-4％。
將rhG-CSF復性液直接進行SP-Sepharose Fast Flow等陽離子層析和Superdex 75等凝膠過濾層析，收集得到rhG-CSF產品。活性檢測、電泳檢測、HPLC檢測表明，本發明獲得的rhG-CSF的質量超過了《中華人民共和國藥典2005版》第三部的要求。


圖1為復性并純化后的rhG-CSF還原SDS-PAGE檢測結果圖2為復性并純化后的rhG-CSF非還原SDS-PAGE檢測結果圖3為復性并純化后rhG-CSF的RP-HPLC檢測結果圖4為復性并純化后rhG-CSF的GF-HPLC檢測結果具體實施方式
實施例實施例1rhG-CSF高純度包涵體的獲取rhG-CSF基因工程菌(華北制藥金坦生物技術股份有限公司提供)發酵后，取濕菌體1kg，用PBS緩沖液(60mmol/L PB，150mmol/L NaCl，1mmol/LEDTA，pH 7.0)洗滌，洗去菌體中夾帶的未利用的培養基等雜質，8000g離心(Avanti J-25，Beckman公司)，收集沉淀，再重新置于以上溶液中，在固液比為1∶10的條件下，混合成均一的懸液，泵入高壓勻漿泵中進行高壓勻漿破碎(APV30-30CD，APV GAULIN公司)，繼而通過離心分離得到濕的包涵體粗品120g。
將上述得到的粗包涵體用緩沖液A(urea 4mol/L，Tris-HCl 20mmol/L，EDTA10mmol/L，TritonX-100 0.2％，pH8.0)和緩沖液B(Tris-HCl 50mmol/L，EDTA10mmol/L，pH8.0)依次洗滌，得高純度包涵體102g。
實施例2rhG-CSF包涵體的裂解取5g高純度包涵體，以固液比1∶100的比例用裂解液(8mol/L Urea，100mmol/L Tris-HCl，5mmol/L DTT，2mmol/L EDTA)裂解，室溫溫和攪拌2-3小時，離心得上清液510ml，并用Lowry法測定蛋白濃度。
將裂解液進行SephadexG-25分離，去除多余的還原劑DTT。
實施例3rhG-CSF包涵體的復性將實施例2獲得的去除還原劑的rhG-CSF包涵體的裂解液，分別利用復性液A、B、C、D連續流加稀釋5-6小時，最終濃度控制在0.12mg/ml。流加結束后，在4-8℃下，溫和攪拌10-12小時。然后在10-15℃下，溫和攪拌6-8小時，進行復性。該實施例所用的四種復性液如下

實施例4rhG-CSF的純化將復性后的rhG-CSF溶液用0.5mol/L鹽酸調pH4.0，上樣于SP-SepharoseFast Flow陽離子層析交換介質，在50mmol/L醋酸鈉-醋酸，檸檬酸鈉-檸檬酸的緩沖系統中進行進一步分離，用NaCl的鹽梯度洗脫吸附的rhG-CSF。
將離子層析后收集的活性組份進行進一步的分子篩層析精制，層析介質選用高分辨率的Superdex-75，緩沖液選用pH4.0，50mmol/L的醋酸鈉-醋酸緩沖液系統。
實驗例實驗例1rhG-CSF包涵體復性液的蛋白含量和活性檢測用Lowry法測定rhG-CSF包涵體復性后的rhG-CSF濃度，用小鼠骨髓白血病細胞(NSF-60)/MTT比色法測定rhG-CSF的活性，測定結果見下表

實驗例2rhG-CSF純化后的比活性和純度檢測用NSF-60/MTT比色法檢測用復性液A復性并純化后的rhG-CSF的比活性，高于1×108IU/mg；還原和非還原SDS-PAGE檢測為一條帶(附圖1、2)，掃描純度大于99％；RP-HPLC檢測(附圖3)和GF-HPLC檢測(附圖4)純度均高于97％。發明人針對用復性液B、C和D復性并純化后的rhG-CSF也進行了同樣的活性和純度檢測，得到了相同的結論。具體檢測結果見下表

實驗例3rhG-CSF的穩定性考察對上述4種復性液制備的rhG-CSF產品分別進行常溫和加速穩定性考察。結果表明，本發明制備的rhG-CSF產品穩定好，不僅在4℃下0-24個月的活性、電泳、HPLC等結果沒有明顯變化，而且25℃保存6個月后的活性、電泳、HPLC也沒有明顯變化。
4℃條件下0-24個月的rhG-CSF比活性(108IU/mg)考察結果 4℃、25℃條件下6個月的hG-CSF穩定性(％)、活性(108IU/mg)考察結果
權利要求
1.一種重組人粒細胞集落刺激因子包涵體復性液，由下列組分組成鹽酸胍30-150mmol/L，尿素0.3-2.5mol/L，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽20-150mmol/L，pH7.0-9.0，半胱氨酸0.2-5mmol/L，胱氨酸0.04-1mmol/L，甘油質量體積百分比1-6％和適量去離子水。
2.權利要求1的重組人粒細胞集落刺激因子包涵體復性液，其中鹽酸胍50-130mmol/L，尿素0.6-2.0mol/L，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽40-120mmol/L，pH7.2-8.8，半胱氨酸0.5-3mmol/L，胱氨酸0.1-0.6mmol/L，甘油2-5％。
3.權利要求1的重組人粒細胞集落刺激因子包涵體復性液，其中鹽酸胍60-100mmol/L，尿素0.8-1.2mol/L，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽60-100mmol/L，pH7.5-8.5，半胱氨酸1-2mmol/L，胱氨酸0.2-0.4mmol/L，甘油3-4％。
4.一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，包括重組人粒細胞集落刺激因子包涵體的裂解、復性和純化，其特征在于，復性步驟采用權利要求1-3所述任一復性液。
5.權利要求4的制備方法，其中復性步驟為復性液連續流加稀釋后，在4-8℃下攪拌10-12小時，然后在10-15℃下攪拌6-8小時。
6.權利要求5的制備方法，其中復性液連續流加稀釋5-6小時，最終濃度控制在0.12mg/ml。
7.權利要求4-6的任一制備方法，其特征在于，所述裂解步驟包括最后將裂解液分離去除還原劑。
全文摘要
本發明涉及一種用于重組人粒細胞集落刺激因子(recombinant humangranulocyte colony stimulating factor，rhG－CSF)的制備方法，包括包涵體的裂解液、復性液組成和裂解、復性方法。復性液由鹽酸胍(Guanidine－HCl)、尿素(Urea)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris－HCl)、半胱氨酸(Cysteine)、胱氨酸(Cystine)和甘油(Glycerol)等組成。利用該復性液復性rhG－CSF包涵體，復性工藝簡單，成品純度高，穩定性好。
文檔編號C07K1/06GK101045742SQ200610012520
公開日2007年10月3日 申請日期2006年3月27日 優先權日2006年3月27日
發明者郝愛魚, 董愛華, 黃曉蘭, 梁倩, 張衛婷, 宋欣, 孔德清, 高文利, 趙軍強, 暴娜, 周興軍, 王惠欣, 任樂民, 姜楊 申請人:華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司, 華北制藥金坦生物技術股份有限公司