專利名稱：一種純化重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的方法
技術領域：
本發明涉及生物制藥領域，尤其涉及藥用重組人粒細胞巨噬細胞集落剌激因子蛋
白的純化，特別涉及重組人粒細胞巨噬細胞集落剌激因子的純化方法。
背景技術：
1977年，Bugress等從小鼠肺條件培養液中發現_種能剌激粒細胞和巨噬細胞形 成集落的因子，命名為粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子(grnaulocyte-macorphgaeeolony stimulatingafetor， GM-CSF) 。 1984和1985年，小鼠和人的GM-CSF的cDNA分別克降成 功。GM-CSF主要是由T淋巴細胞在抗原或有絲分裂原的剌激下產生的；單核細胞、內皮細 胞、成纖維細胞等也可產生GM-CSF。 GM-CSF有127個氨基酸殘基，含兩個二硫鍵(C54_C%， C88-C121)，只有第-對二硫鍵與活性相關。不同來源的GM-CSF的相對分子質量范圍為 14500-35000，相對分子質量差異是由于糖基化程度的不同，GM-CSF的等電點為3. 5_4. 5。 GM-CSF的生物學功能主要是對粒細胞系和單核細胞系細胞的維持存活、促進生長、誘導分 化和增強功能等。 在臨床上，重組人GM-CSF制劑已作為治療造血系統異常的有效藥物，主要用于治 療包括腫瘤化療所致的造血障礙、艾滋病、骨髓移植、再障等各種原因引起的白細胞減少 癥，能有效提高患者的免疫能力。 早在80年代中期wong等克隆了 rhGM-CSF的cNDA，并在哺乳動物細胞培養中得 到表達。所以目前基礎研究和臨床上應用的rhGM-CSF都是通過基因工程技術重組生產的。 利用重組克隆的方法在大腸桿菌中成功表達hGM-CSF是最具有吸引力的表達系統之一。據 文獻報道，rhGM-CSF的cDNA編碼成熟蛋白N端的堿基GC含量較高，還含有大腸桿菌極少 用的密碼子，因此在大腸桿菌中重組表達時，阻礙了轉錄的速度，從而導致表達水平大幅度 下降。因此有文獻報道對rhGM-CSF cDNA的5/端作了修飾，降低GC含量之后，表達水平有 所提高。另外，目前國內外已公開報道了許多關于將rhGM-CSF與其他細胞因子以融合蛋 白的方式表達方面的研究，并證明其作用顯著高于單個因子或者兩者合用的效果。從目前 對融合蛋白的一些研究結果來看，它比單個的細胞因子對造血細胞有著更高的綜合促進作 用，因此它們有可能成為臨床使用的新一代高效造血剌激因子。 重組人粒細胞巨噬細胞集落剌激因子的分離純化技術有許多中，其中色譜法已是 當前分離純化最普遍的方法。目前，大多采用將復性后的重組人粒細胞巨噬細胞集落剌激 因子經DEAE離子交換色譜，進行分離。選用這種色譜方法分離純化工藝簡單，成本低，但重 組人粒細胞巨噬細胞集落剌激因子蛋白的純度通常只能達到90%左右。也有采用親和色譜 或反相色譜，疏水色譜，離子交換色譜，凝膠色譜的組合等方法純化重組人粒細胞巨噬細胞 集落剌激因子蛋白。但親和色譜配體生產困難，費用高，且配體脫落影響產物純度。而反相 色譜(RPLC)與其他色譜方法相比具有分辨率和回收率高、重復性好、操作簡便等優勢。由 于RPLC可使用揮發性體系如水溶三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)等，純化產物不必進行洗脫， 因此大大簡化了操作步驟。另外，在RPLC中，蛋白質分子通過色譜柱時會發生或多或少的去折疊，內部某些疏水殘基暴露并與固定相相互作用，從而表現出與其他色譜及電泳方法 不同的選擇性，提供其他方法不能提供的信息，這成為RPLC在蛋白質分離分析中的又一有 利因素。 本專利采用反相色譜填料對重組人粒細胞巨噬細胞集落剌激因子進行純化，不僅 使其回收率達到滿意的結果，還提高分離純化后的蛋白純度、比活和穩定性，大大簡化了操 作步驟、縮短了生產周期。
發明內容
本發明要解決的技術問題在于克服現有技術的不足，從對重組基因工程菌菌株的 分離純化的手段的創新，來大幅度提高重組人粒細胞巨噬細胞集落剌激因子分離純化后的 蛋白純度、比活、穩定性。 本發明解決的技術問題所采用的技術方案是在純化工藝中采用了反相填料的精 細分離純化步驟。包括步驟a、選用工程菌做菌株進行發酵培養；b、對發酵培養所得菌體 進行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；c、對精制包涵體進行復性，獲得復性產物；d、 對復性產物進行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產物；e、對陰離子柱層析產物進行
陽離子柱層析，得到陽離子柱層析產物；f、對陽離子柱層析產物進行精細分離，采用反相填 料柱層析處理，得到重組人粒細胞集落剌激因子。 同現有技術相比較，采用本專利的反相填料精細分離，蛋白電泳純度由90%提高 到98%， HPLC純度由90%提高到98%，其比活由1. 1 X 107lU/mg提高到2. 5X107IU/mg。 4t:條件下蛋白穩定性由原有的3個月提高到12個月。可見，采用本發明的重組人粒細胞 巨噬細胞集落剌激因子的純化工藝，可以大幅度的提高蛋白的純度、比活、穩定性。
具體實施例方式以下通過實施例、實驗例詳細說明本發明的內容，但這些實施例并不構成對本發
明的限制。 實施例l 使用半制備型MKF-RP柱。 樣品陽離子層析產物200ml，蛋白濃度1. Omg/ml。 配制洗脫液A為含50mmolNaCl和20mmo1 Tris-HCl緩沖液(pH 8)，洗脫液B為含 50mmolNaCl溶液20mmo1 Tris-HCl 60%乙腈(pH 8)。 先用洗脫液A洗脫，再用梯度洗脫15% _90%洗脫液8洗脫，10-55分鐘收集樣品 峰。 被收集的樣品經低溫蒸發，除去有機物質，然后透析濃縮后保存在4t:條件下。 實施例2 使用XK 50/30柱，用SBC MCL GEL型反相制備液相色譜填料裝柱。
樣品陰離子層析產物500ml，蛋白濃度1. 2mg/ml。 洗脫液A為20%磷酸鹽緩沖液，洗脫液B為含0. 02% tween80的30%甲醇溶液， 流速為15ml/min。 梯度洗脫，在10-80分鐘20% _ %洗脫液8洗脫，收集樣品峰。收集樣品時，收集中間部分。被收集的樣品經低溫蒸發，除去有機物質，然后透析濃縮后保存在4t:條件下。 實施例3 使用Butyl-S印harose 4Fast Flow, XK50 H16層析柱。 樣品陰離子層析產物500ml，蛋白濃度1. Omg/ml 。添加硫酸銨到0. 8M。 平衡液20mmol/ml Tris-HCl， PH8. 0,0. 8M硫酸銨 預洗脫液20讓ol/ml Tris-HCl， ffl8. 0，0. 5M硫酸銨 洗脫液20mmol/ml Tris-HC1， PH8. 0， 0. 2M硫酸銨 收集洗脫液洗脫部分，透析除鹽即得。 在4。C條件下對實施例1、2、3的樣品進行穩定考察，考察結果如下 0月
批號比活電泳純度HPLC純度內毒素蛋白濃度
實施例12. 5X107IU/mg98%98%符合規定1. 2mg/ml
實施例22. 3X107IU/mg98%98%符合規定1.2mg/ml
實施例31. lX107lU/mg92%92%符合規定1. Omg,/ml 3月
批號比活電泳純度HPLC純度內毒素蛋白濃度
實施例12. 5X107IU/mg98%98%符合規定1. 2mg,/ml
實施例22. 3X107IU/mg98%98%符合規定1. 2mg/ml
實施例31. 0X107IU/mg91%91%符合規定1.Omg/ml 6月
批號比活電泳純度HPLC純度內毒素蛋白濃度
實施例12. 4X107IU/mg98%97%符合規定1. 3mg/ml
實施例22. 3X107IU/mg98%97%符合規定1. 2mg/ml
實施例30. 9X107IU/mg89%88%符合規定1. lmg/ml 12月
批號比活電泳純度HPLC純度內毒素蛋白濃度
實施例12. 3X107IU/mg97%97%符合規定1. 2mg/ml
實施例22. 1 X 107IU/mg97%97%符合規定1. 2mg/ml
實施例30. 6X107IU/mg86%85%符合規定].Omg/ml 以上數據說明，通過反向填料方法獲得的實施例1、2樣品較實施例3，電泳純度與 HPLC純度在12個月內均大于97% ，比活達到2. 1 X 107IU/mg以上，其他各項指標也符合藥
5典要求，實施例1、2樣品可在4t:條件下放置12個月，實施例3樣品在考察6個月時出現比 活降低，蛋白純度下降的現象。說明通過反向填料方法獲得重組人粒細胞集落剌激因子蛋 白更加穩定。
權利要求
一種重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的純化工藝方法。其特征在于采用了反相填料層析分離。
2. 根據權利要求1所述的反相填料層析分離前的樣品要求，其特征在于經過分離純化 后的樣本。
3. 根據權利要求2所述的分離純化，其特征在于先經過陰離子柱層析處理，再經過陽 離子柱層析處理，最后進行精細分離。
4. 根據權利要求1所述的反相填料柱，其特征在采用半制備型柱和制備型柱。
5. 根據權利要求1所述的反相填料層析，其特征在采用反相色譜預裝柱或反相填料預 裝柱。
全文摘要
本發明涉及一種純化重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的方法。本發明首次將反相填料的精細分離步驟應用于重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的純化工藝中。同現有技術相比較，采用本發明的反相填料精細分離，電泳純度由90％提高到98％，HPLC純度由90％提高到98％，其比活由1.1×107IU/mg提高到2.5×107IU/mg。可見，采用本發明的重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的純化工藝，可以大幅度的提高其蛋白純度、比活、穩定性，將行效降低其在臨床中的副作用。
文檔編號C07K1/20GK101717429SQ200810137280
公開日2010年6月2日 申請日期2008年10月9日 優先權日2008年10月9日
發明者呂延杰, 吳志軍, 王 忠 申請人:哈藥集團生物工程有限公司;哈爾濱醫科大學