單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗體藥物領域，特別涉及單克隆抗體及其應用。
【背景技術】
[0002] PD-L1：
[0003] 程序性死亡受體-1(programmeddeath-1PD-1)蛋白最初是在凋亡的T細胞雜交 瘤中利用削減雜交的方法得到的，由于其和細胞凋亡相關而被命名為程序性死亡-1受體。 目前發現的PD-1的配體被證實有兩個，分別是PD-L1 (又稱B7-H1，屬于B7超家族)和PD-L2 (又稱B7-DC)。人H)-L1基因定位于染色體9P24,其開放閱讀框編碼一個含有290個氨基酸的 I型跨膜蛋白，由胞外區IgV、IgC結構域、疏水性跨膜結構域、30個氨基酸片段且帶電荷的胞 內區組成。人H)-L1的胞外段與B7-1，B7-2具有較高的同源性，且該肽段含有4個明顯的半胱 氨殘基，便于其胞外段的重鏈和輕鏈形成二硫鍵結構。人ro-LlmRNA主要表達于胎盤(特別 是合體滋養層和外絨毛狀的細胞滋養層）、心臟（鼠中表達較低）、肝臟、肺、腎、骨骼肌等非 淋巴組織和少數造血組織(一些骨髓造血細胞以及白血病細胞系），但在淋巴結和脾臟等淋 巴組織的表達量甚微。PD-L1蛋白廣泛表達于抗原提呈細胞、活化T、B細胞、巨噬細胞、胎盤 滋養層、心肌內皮和胸腺皮質上皮細胞。在許多人類腫瘤組織中均可檢測到ro-Li蛋白的表 達，且許多腫瘤組織較正常組織中的ro-Li表達水平明顯上調。
[0004] ro-1/PD-Ll參與腫瘤免疫的逃逸機制
[0005]腫瘤免疫逃逸的機制包括:腫瘤細胞膜表面相容性復合物(MHC)類分子的表達下 調，缺少免疫共刺激分子，分泌免疫抑制性細胞因子，表達死亡配體或表達抑制性配體 等 [2]。許多腫瘤細胞系及腫瘤細胞高表達PD-L1分子，其與淋巴細胞表面的PD-1分子結合 后，削弱了機體的抗腫瘤免疫應答，從而導致腫瘤免疫逃逸的發生。另外，腫瘤微環境由腫 瘤細胞、血管、組織液、間質細胞和少量浸潤的淋巴細胞構成。腫瘤微環境還存在一些炎性 細胞因子，如IFN-α和IFN-γ等，這些細胞因子可促進腫瘤細胞表面H)-L1的表達，在腫瘤的 免疫逃逸過程中發揮了重要作用。
[0006] 之前的研究認為，腫瘤浸潤淋巴細胞(tumorinfiltratinglymphocyte，TIL)與 腫瘤細胞特異性結合后，可殺傷腫瘤細胞或誘導腫瘤細胞凋亡，從而起到抗腫瘤的作用。但 隨著研究的深入，人們發現腫瘤細胞高表達ro-Li分子，而TIL細胞高表達ro-i分子。腫瘤細 胞表達的ro-Li與til表達的ro-i結合后，可抑制til細胞的活化并誘導其凋亡，從而抑制機 體的抗腫瘤免疫，導致腫瘤免疫逃逸的發生。
[0007]治療性抗ro-Li抗體
[0008]PD-L1廣泛表達在造血系統和非造血系統腫瘤細胞表面。最初的研究發現，PD-L1主要表達于活化的T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等，但是隨著研究的深入，發現除 了淋巴細胞，PD-L1也表達于其他多種組織如胸腺、心臟、胎盤等的內皮細胞，以及胰島的β 細胞等。在臨床前的動物實驗模型中，用針對ro-1和其配體ro-Li兩個靶點的單克隆抗體阻 斷PD-1通路，能激發細胞毒活性并抑制腫瘤細胞的生長。目前作用于PD-1/PD-L1的這些藥 物雖然彼此在作用機制上有些許不同，但每個藥物都設計為阻斷PD-1和它的配體的相互作 用，從而使T細胞的"開關"保持在"開"的位置。
[0009]到目前為止，應用免疫組織化學方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、 卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤、黑素瘤等人類腫瘤組織中檢測到ro-Li 蛋白的表達，且ro-Li的表達水平和患者的臨床病理特征及預后緊密相關。
[0010]抗PD-L1單抗的臨床研究
[0011] 隨著人們對腫瘤分子發生機制研究的不斷深入，越來越多的學者把癌癥的發生發 展歸因于一系列的腫瘤細胞的免疫逃逸策略。分子免疫治療將會是除手術及化學藥物治療 之外的另一有效的治療手段。目前生物治療在腫瘤治療中的作用逐年提高，生物治療在防 止腫瘤復發、治療晚期癌癥及其并發癥等諸多方面具有諸多優勢，但是安全性也是現在關 注的重點。期中抗ro-Li單抗是臨床上非常具有前景的單抗之一。
[0012] 鼠源單克隆抗體技術(雜交瘤技術）
[0013] 雜交瘤技術的基本原理
[0014]小鼠骨髓瘤細胞能在體內外無限增殖和分泌無抗體活性的免疫球蛋白，而免疫小 鼠脾細胞具有產生抗體的能力，但不能無限增殖。因此，采用融合劑將這兩種細胞融合成雜 交瘤細胞，這種雜交瘤細胞具有親代細胞的主要特征，既能在人工培養的條件下無限增殖， 又能產生特異性的抗體。由于每一個被免疫的淋巴細胞只能對某個單一的抗原決定簇產生 特異性抗體，因而在將其克隆化后產生的單克隆細胞系，就能產生大量單一的高純度抗體， 即"單克隆抗體"。
[0015]細胞融合培養時加入HAT(H-次黃嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶）選擇系統，目的 是保證只有雜交瘤細胞的生長。融合細胞能在HAT選擇性培養基上生長的原理是：在HAT系 統中，A阻斷了核酸合成的主要途徑，這時正常細胞可以通過"補救途徑"，由胸腺嘧啶激酶 (TK)和次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)利用T和Η合成核酸。骨髓瘤細胞，因缺乏 HGPRT不能利用"補救途徑"，所以在HAT系統中不能存活。而骨髓瘤細胞和脾細胞的雜交細 胞，從正常的脾細胞獲得了HGPRT，能夠存活，正常脾細胞沒有在體外長期生長的能力。
[0016]雜交瘤技術的優、缺點
[0017]由于鼠源單克隆抗體是單細胞繁殖的細胞所產生的抗體，具有特異性強，純度高， 可以大規模工廠化生產等優點，從而使免疫分析技術準確性高，重復性好，方法簡便。但該 技術所需儀器設備昂貴，加之實驗程序較為復雜，又因單克隆抗體針對某一抗原決定簇，抗 原化合價常常不能與抗原形成網絡沉淀，不能用于沉淀衍生出來的免疫技術。
[0018] 雜交瘤技術的應用
[0019] 20世紀70年代中期以細胞融合為基礎的鼠雜交瘤技術的問世，由此制備出的單克 隆抗體是抗單一抗原決定簇的抗體，具有高度的特異性和均一性，且能使得人們能夠大量 獲得鼠源單抗，這成為抗體研究領域的一次重大革命。早期的鼠源單抗在臨床上有多方面 的應用，如感染性疾病和腫瘤的治療、體內定位診斷、免疫調節等。
[0020] 第一個應用單抗治療的病例發生在1982年，Levy等制備了針對一位B淋巴細胞瘤 患者瘤細胞的獨特性單抗，患者經此抗體治療后，病情緩解，瘤體消失。此次臨床治療的成 功，使治療性單抗成為生物醫學的研究熱點，許多以單抗為研究對象的公司也隨之相繼成 立。1986年，應用此技術制備的第一個單克隆抗體藥物0KT3被美國Π)Α批準上市，被用于治 療器官移植后的免疫排斥。但由于抗體是鼠源的，在病人中引發了嚴重的免疫反應，這就大 大阻礙了抗體藥物的發展。
[0021] 人源單克隆抗體技術
[0022] 隨著抗體被用來開發成藥物，它的一些特征也被嚴格考量，如免疫原性、親和力、 穩定性、效應功能、半衰期、組織滲透性及其分布等。在鼠源MAb生產變得成熟時，研究者便 預想通過常規的雜交瘤技術生產人源MAb，但由于人雜交瘤細胞系不能穩定的生產高產量 的抗體，并且對于很多抗原來說，人的體內免疫是不可行的。這樣，基因工程抗體由然而生， 1994年，第一個嵌合抗體ReoPro獲準上市，臨床應用表明其免疫原性遠優于鼠源抗體，這就 掀起了繼雜交瘤單克隆抗體之后抗體工程研究領域的又一次革命。特別是90年代中期以 來，為進一步降低免疫反應的發生，多種人源化改造技術被成功開發并得以應用，各種各樣 的基因工程抗體及抗體庫不斷出現，使得大規模生產醫用人源化抗體成為可能。從1997年 開始，大批的單抗藥物被FDA批準上市。
[0023] 單抗人源化改造技術的應用打破了抗體藥物產業化的瓶頸。迄今，按照人源化程 度的高低大體可分為三種技術:人鼠嵌合、人源化和全人源，其基因中人源序列占比分別為 75%、95%和100%。其中嵌合抗體是將鼠雜交瘤單克隆抗體基因的可變區和人的恒定區連 接在一起，然后在哺乳動物細胞中進行表達產生;而人源化抗體則是除了將抗體的恒定區 換成人源的之外，更進一步的將可變區的FR區轉換成人源的，從而降低免疫原性;而全人源 抗體制備則是有四種途徑，一種從采集的病人血樣中構建Fab或者ScFv文庫，并通過噬菌體 展示篩選抗體庫，來產生人源MAb。2002年，第一個全人源MAb阿達木單抗(Humira)就是通過 噬菌體展示開發出來的。第二種生產人源抗體的策略是用含有人免疫球蛋白基因位點的轉 基因小鼠，進行免疫，可以產生人抗體的免疫應答，這樣通過傳統的雜交瘤技術可以來生產 人源MAb。第三種途徑是通過分離培養人外周血淋巴細胞或扁桃體淋巴細胞，然后用抗原進 行免疫刺激，產生免疫應答，然后再和人類骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞，經篩選得到人 源單克隆抗體，并立即進行分子克隆抗體基因，使用其他可長期穩定表達的哺乳動物細胞 來表達目的抗體，這種抗體完全是在人細胞環境中生成的。第四類途徑是通過分離和低密 度(約500B細胞每96孔)培養人外周血淋巴細胞或扁桃體淋巴細胞，對培養上清進行抗原特 異性篩選，對陽性孔B細胞進行分子克隆獲得人抗體基因，再使用其他可長期穩定表達的哺 乳動物細胞來表達目的抗體。
[0024] 隨著人源化和全人源抗體技術的成熟，如何提高抗體的親和力成了目前所有基因 工程抗體藥物需要解決的關鍵問題。這是因為增加一個抗體的親和力將降低抗體藥物的劑 量并起到更好的生物活性，還可能使其治療更多的疾病及降低劑量相關的毒性。此外，費用 也將大大降低。多項獨立的研究表明，抗體親和力和生物學活性在達到極限值之前是成線 性關系的。圍繞這一問題人們已經從不同的方向展開了研究，提高抗體親和力的途徑基本 有兩條途徑，其中一個途徑是通過隨機突變CDR或是整個的VR，然后從這個大量的突變體庫 里篩選更高親和力的抗體;另一個途徑是通過集中突變或是建模模擬體內親和力成熟的熱 點區域，建立一個小的突變體庫。綜合起來說，當進行體外抗體親和力成熟時，應考慮4個主 要方面:①在抗體基因的何處導入突變;②如何導入突變;③如何從較低親和力的抗體中選 擇稀有的更高親和力抗體。④如何鑒別更高親和力抗體。
[0025] 總之，單抗是特異性很強的藥物，人源化單抗很好地解決了免疫原性等問題，它在 治療腫瘤或其他疾病領域比其化學藥物的副作用低得多。所以，長遠地說，人源化單抗有著 廣闊的前景。從商業的角度來講，治療性人源抗體的市場也是巨大的。隨著基因組學和蛋白 組學的發展，越來越多的基因及其相關蛋白的發掘，與腫瘤和其他疾病相關的抗原就成為 了治療性抗體研究的主要靶標，治療性人源單抗將在人類疾病治療中扮演重要角色。

【發明內容】

[0026]有鑒于此，本發明提供單克隆抗體及其應用。作為抗PD-L1的新抗體，能夠結合人PD-L1及猴PD-L1，可呈劑量依賴性阻斷人PD-L1與人PD-1的結合;結合細胞表面H)-L1并劑 量依賴性阻斷細胞表面人PDL-1與人Η)-1的結合;促進T細胞的增殖，刺激淋巴細胞IL-2和 IFNy的分泌。通過阻斷PD-1/PD-L1信號可以促進腫瘤抗原特異性T細胞的增殖，發揮殺傷 腫瘤細胞的作用。
[0027]為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
[0028] 本發明提供了 一種抗ro-Ll單克隆抗體，其具有：
[0029] (I)、重鏈可變區如SEQIDNo·l、SEQIDNo·2或SEQIDNo·3所示的氨基酸序列； 或
[0030](Π)、輕鏈可變區如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示的氨基酸序 列;或
[0031] (m)、（i)或（π)所述氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的氨 基酸序列，且與（I)或（π)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
[0032] (IV)、與（I)或（Π)所述序列至少有80%同源性的氨基酸序列。
[0033]在本發明的一些具體實施方案中，所述抗PD-L1單克隆抗體的氨基酸序列經取代、 缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列中，所述多個為2個、3個、4個、5個、6個、7 個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個或16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、 23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個或32個。
[0034]在本發明的一些具體實施方案中，所述抗ro-Li單克隆抗體具有：
[0035] (i)氨基酸序列為SEQIDN0:1的重鏈可變區，和氨基酸序列為SEQIDN0:4的輕 鏈可變區；或
[0036] (?)氨基酸序列為SEQIDN0:1的重鏈可變區，和氨基酸序列為SEQIDN0:5的輕 鏈可變區；或
[0037] (m)氨基酸序列為SEQIDNO: 1的重鏈可變區，和氨基酸序列為SEQIDN0:6的輕 鏈可變區；或
[0038] (iv)氨基酸序列為SEQIDN0:2的重鏈可變區，和氨基酸序列為SEQIDN0:4的輕 鏈可變區。
[0039] (V)氨基酸序列為SEQIDN0:2的重鏈可變區，和氨基酸序列為SEQIDN0:5的輕 鏈可變區。
[0040] (VI)氨基酸序列為SEQIDN0:2的重鏈可變區，和氨基酸序列為SEQIDN0:6的輕 鏈可變區。
[0041 ] (W)氨基