一種kpv肽及其類似物的多肽的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種多肽的制備方法，尤其涉及一種KPV肽及其類似物的多肽的制備 方法。
【背景技術】
[0002] 黑色素細胞激素（英文名melanocyte-stimulatinghormone，縮寫MSH)中的a-MSH 的一段多肽SYSMEHFRWGKPV-NH2,被發現具有多種生物用途。在過去幾十年，有許多研究報 道，a-MSH用于皮膚消炎和其他炎癥疾病。此多肽序列中，四肽HFRW以及其同系物序列，包括 非多肽類似物，已經被許多制藥公司和研究所合成并用于生物醫療領域。人們還發現，這條 多肽序列的C端，$負氨酸-脯氨酸-繳氨酸（英文名Lysine-Proline-Valine，縮寫KPV)，已經 在多項研究中被證明具有預防和皮膚炎癥的功效。其類似結構的多肽序列:MEHFRWGKPV、 HFRWGKPV、OSSYSMEHFRWGKPV，與三肽KPV有著相同或者相似的功效，可以預防和治療一系列 復雜的皮膚適應癥，包括皮膚炎癥，水腫，紅斑，機會性感染和瘙癢，以及牛皮癬等。 MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、OSSYSMEHFRWGKPV比KPV更加穩定，藥物半衰期時間更長，藥物藥效 持續效果更久(W02002080858A2)。表1為氨基酸的縮寫對照表。
[0003] 目前，合成KPV肽的方法有液相法和固相法兩種（專利US20100120699A1)。液相制 備法合成時間長，副產物多，產率低，專利報道中為33%，溶劑消耗量大。
[0004] 現有的固相制備法，以N，N'_二環己基碳二亞胺（縮寫：DCC)和羥基苯并三唑（縮 寫:HOBt)作為多肽連接的反應物質，以N-乙酰基咪唑（英文名:N-acetylimidazole)將N端 羧基化，再通過氫氟酸將多肽從固相樹脂上切割。該方法雖然可以將產率提高到56%，但仍 然相對繁瑣，合成成本高，反應物化合物的使用比較危險。

[0007] 表1氨基酸的縮寫對照表

【發明內容】

[0008] 為了獲得更高的產率，提高反應速率，反應更安全，本發明提供一種KPV肽及其類 似物的多肽制備方法，以全固相合成法合成，包括以下步驟：
[0009] 步驟一、使用聚合物鍵合型聚氧乙烯-RAM樹脂作為合成的固相基質并對其進行預 處理；
[00?0]步驟二、向樹脂中加入N-荷甲氧羰基-ΑΑ-0Η、多肽連接試齊丨」進行氨基酸合成，清洗 樹脂，脫去N-芴甲氧羰基保護，再次清洗樹脂；
[0011]步驟三、將步驟二中得到的肽鏈以醋酸、二氯甲烷進行羧基化反應得到羧基化的 肽鏈；
[0012] 步驟四、以三氟乙酸、三異丙基硅烷、水混合溶液，或者氫氟酸、三異丙基硅烷、水 混合溶液，將步驟三得到的羧基化的肽鏈進行切割，切割后得到的多肽溶液用甲基第三丁 基醚清洗，離心沉淀，干燥沉淀物，以制備型HPLC純化得到KPV肽或者其類似物的多肽；
[0013]N-芴甲氧羰基-AA-OH中的AA表示氨基酸，步驟二至少重復三次再進入步驟三，N-芴甲氧羰基-AA-OH至少要以N-芴甲氧羰基-Val-OH、N-芴甲氧羰基-Pro-OH和N-芴甲氧羰 基-Lys-OH形式分別出現一次；
[0014]多肽連接試劑包括2-肟氰乙酸乙酯、N，N'_二異丙基碳二亞胺、N，N'_二環己基碳 二亞胺、羥基苯并三唑、〇-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯 烷基六氟磷酸鹽、6-氯-1H-苯并三唑、N，N-二異丙基乙基胺、2-(7-偶氮苯并三氮唑）-N，N， Ν'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯中的一種或者多種。
[0015]進一步地，多肽連接試劑包括2-肟氰乙酸乙酯、N，N'_二異丙基碳二亞胺。
[0016]進一步地，多肽連接試劑包括N，N-二異丙基乙基胺、2-( 7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，Ν'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯。
[0017] 進一步地，多肽連接試劑包括1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽、N，N'_ 二異丙基碳二亞胺。
[0018] 進一步地，多肽連接試劑包括N，N二環己基碳二亞胺和羥基苯并三唑，或者0-苯 并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N，N'_二異丙基碳二亞胺，或者6-氯-1H-苯并三唑和N， Ν'-二異丙基碳二亞胺。
[0019] 進一步地，步驟一中的預處理是指：以哌啶、二甲基甲酰胺脫去聚合物鍵合型聚氧 乙烯-RAM樹脂的Ν-芴甲氧羰基基團保護，以二甲基甲酰胺或者Ν-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯 甲烷清洗樹脂。
[0020] 進一步地，步驟二中的清洗樹脂，脫去N-芴甲氧羰基保護，再清洗樹脂具體是指： 以二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷清洗樹脂，以哌啶、二甲基甲酰胺脫 去N-芴甲氧羰基基團保護，再以二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷清洗樹 脂。
[0021] 進一步地，脫去N-芴甲氧羰基基團保護是在加熱到70°C_90°C條件下進行的。
[0022] 進一步地，加熱是指用微波、水浴或者油浴加熱。
[0023 ]進一步地，脫保護的反應時間是2分鐘。
[0024]進一步地，步驟二中的氨基酸合成是在加熱到70°C_90°C條件下進行的，反應時間 是5分鐘，加熱方式是微波加熱。
[0025]進一步地，還包括步驟五、將步驟四得到的得到KPV肽或者其類似物的多肽冷凍干 燥，于-20°C保存。
[0026] 進一步地，步驟四中HPLC的流動相為水和乙腈。
[0027] 進一步地，其類似物的多肽包括MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、SYSMEHFRWGKPV。
[0028] 進一步地，步驟二中的氨基酸合成是在加熱到70°C_90°C條件下進行的，反應時間 是5分鐘，加熱方式是微波加熱;還包括步驟五、將步驟四得到的得到KPV肽或者其類似物的 多肽冷凍干燥，于_20°C保存；步驟四中HPLC的流動相為水和乙腈；其類似物的多肽包括 MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、SYSMEHFRWGKPV;
[0029]多肽連接試劑包括2-肟氰乙酸乙酯和N，N'_二異丙基碳二亞胺，或者N，N_二異丙 基乙基胺和2-(7-偶氮苯并三氮唑）-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯，或者lH-苯并三唑- l-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽和N，N'-二異丙基碳二亞胺；
[0030] N-芴甲氧羰基-AA-0H中的AA表示氨基酸，氨基酸包括纈氨酸、脯氨酸、賴氨酸；
[0031] 步驟一和步驟二中清洗樹脂用的二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯 甲烷的用量為3~5mL/次。
[0032]進一步地，N-芴甲氧羰基-ΑΑ-0Η中的AA表示氨基酸，氨基酸包括3-氯-D-苯丙氨 酸。
[0033] 本文中，聚合物鍵合型聚氧乙烯-RAM的英文名是GentaGelSRAM;N-芴甲氧羰基 的英文縮寫是Fmoc;N-芴甲氧羰基-ΑΑ-0Η的英文縮寫是Fmoc-AA-〇H;N-芴甲氧羰基-Val-〇H的英文縮寫是Fmoc-Val-〇H;N-芴甲氧羰基-Pr〇-0H的英文縮寫是Fmoc-Pr〇-0H;N-芴甲氧羰 基-Lys-ΟΗ的英文縮寫是Fmoc-Lys-ΟΗ;二甲基甲酰胺的英文名是dimethylformamide，縮寫 是DMF;N_乙酰基咪唑的英文名是N-acetylimidazole;三異丙基硅烷的英文名是 triisopropylsilane; 2_ 月虧氛乙酉愛乙酯的英文名是ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate;N， Ν'-二異丙基碳二亞胺的英文名是N，N' -diisopropylcarbodiimide，縮寫是DIEA;N，N'_二 環己基碳二亞胺的英文名是(1；[05^'130(1；[；[111丨(16，縮寫是0(^ ;羥基苯并三唑的英文 名是l-hydroxybenzotriazole，縮寫是H0Bt;0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯的英文名 ^0(7Azabenzotriazollyl)NNN'N，tetramethyluroniumhexafluophosphate，縮寫是 冊1!];1!1-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽的英文名是&61^〇^丨 &2〇1-111-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate，縮寫是PyBOP; 6-氯-1H-苯并三挫 的縮寫是PyClock;2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯的英文名是0_ (7-Aza-lH-benzotriazol_l-yl)-N，N，N'，Ν'-tetramethyluronium hexafluorophosphate，縮寫是HATU;叔丁氧羰基的英文名是tert-Butyloxycarbonyl，縮寫 B0C〇
[0034] 有益效果是：
[0035] (1)本方法相對于液相合成法具有更高的產率，總產率可比液相制備法提高近2 倍，達65%。副產物無論從種類還是質量都更少，只需要一步分離即可將純度達到90%以 上。
[0036] (2)在脫保護反應中，由于常溫法需要20分鐘，微波法需要2分鐘;在連接氨基酸反 應中，常溫法需要1小時，微波法需要5分鐘。因此微波法可以將普通固相反應速率提高10倍 以上。
[0037] (3)由于微波法副產物非常少，不需要大量溶劑清洗，比如常溫