腫瘤相關基因tp53表位多肽單克隆抗體及其應用
【專利說明】
[0001 ] 技術領域:
本發明涉及雜交瘤細胞系及其產生的單克隆抗體與應用，特別是涉及針對TP53基因的高度保守蛋白序列為靶蛋白，設計合成表位多肽，與載體蛋白偶聯作為免疫原，通過所述免疫原制備獲得的單克隆抗體和分泌該抗體的雜交瘤細胞系以及該抗體的應用。
[0002]技術背景:
TP53是由TP53基因編碼的一種細胞周期抑制蛋白質，由393個編碼氨基酸組成。TP53蛋白包含多個功能結構域，是TP53基因執行功能的重要結構。TP53基因位于人類染色體17pl3.1，全長16kb，分子量為53KD，共有10個內含子和12個外顯子，其中第1個外顯子不編碼。TP53基因是正常細胞增殖和分化的負向調節因子，也是目前研究的最重要的抑癌基因，基因的突變和失調與人類多種腫瘤發生密切相關。TP53基因分為野生型和突變型兩種。正常功能的TP53基因又被稱為野生型TP53基因，對細胞的生長起負調節作用，參與細胞周期調控，修復DNA損傷，誘發細胞程序性死亡，防止細胞惡性增殖。正常情況下野生型TP53蛋白不穩定，半衰期短，用常規免疫組化方法檢測到的TP53蛋白多數為穩定性的突變型TP53表達產物。突變型TP53基因失去調節控制細胞增殖和誘導細胞凋亡的能力而促進腫瘤生長。
[0003]TP53失去正常功能的機理主要表現為兩方面，最主要的方式是基因突變，另一個主要方式是TP53與蛋白質相互作用而失活。在大約50%以上的人類腫瘤中，可以發現TP53基因突變導致的功能失調，突變區域主要集中在高度保守區內，使突變體的特異性位點的結合能力和結構域發生改變。在乳腺癌、肺癌、結腸癌、肝癌等腫瘤中，TP53基因缺失率高，功能明顯失調。
[0004]
【發明內容】
:
本發明的目的是提供能與TP53專一結合的單克隆抗體以及產生該抗體的雜交瘤細胞系Ο
[0005]本發明提供的單克隆抗體，其是以ΤΡ53基因的高度保守蛋白序列為靶蛋白，設計合成表位多肽，與載體蛋白偶聯作為免疫原，通過所述免疫原制備獲得。
[0006]具體地說是使用可以誘發機體產生免疫反應并生成具有中和效應抗體的表位多肽，偶聯至KLH作為免疫原免疫小鼠，采用雜交瘤技術經過細胞融合并篩選得到能持續、穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，由該細胞株分泌得到單克隆抗體。
[0007]優選地，上述多肽序列選自:
ΤΡ53:PGTRVRQSQHMTELIRVEC
由這個多肽序列與載體蛋白偶聯作為免疫原制備獲得的單克隆抗體能夠特異性地識別該序列，將這個單克隆抗體分別稱之為clone 3Dlodone 3D1具有良好的特異性，間接ELISA表明這個抗體具有較高的效價，因此可用于TP53及上述表位多肽的檢測。
[0008]本發明還提供產生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞。
[0009]本發明提供的單克隆抗體與設計合成表位多肽，可用于檢測人血或組織TP53抗體的定量表達，具有高特異性、高敏感性的優點，在臨床檢測和實驗研究中將會得到廣泛應用。
【附圖說明】
[0010]圖1是抗體的SDS-PAGE電泳圖，其中Μ是蛋白分子量標準(kDa)，3D1分別為本發明獲得的單克隆抗體；
圖2是兩個克隆的亞型鑒定圖，其中clone 3D1顯示IgGl信號最強，明中結果判定標準，clone 3D1 的亞型為IgGl。
[0011]圖3所示的是ELISA法靈敏度實驗的擬合曲線。
【具體實施方式】
[0012]以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0013]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0014]實施例1、雜交瘤細胞系的建立一、實驗材料
1、免疫原:本例以TP53基因的高度保守蛋白序列為靶蛋白，設計合成表位多肽，TP53表位多肽:PGTRVRQSQHMTELIRVEC，采用化學合成的方式制備這表位多肽，純度要求大于95%。表位多肽分別與KLH偶聯制備成免疫原。
[0015]2、培養基:DMEM培養基購于Hyclone公司；HAT、HT選擇培養基、降植烷購于sigma公司。
[0016]3、實驗動物:Balb/c小鼠，8_12周齡，雌性，SPF級動物培養。
[00Π] 4、其他材料:福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑購于Sigma公司；PEG4000購于Fluka公司;HRP-山羊抗小鼠IgG抗體購于Jacksonlmmune公司；其余試劑均為國產分析純產品。
[0018]二、雜交瘤細胞系的建立
1、動物免疫
1)基礎免疫:將抗原與福氏完全佐劑等體積混合并充分乳化，分點皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量為lOOyg。
[0019]2)加強免疫:加強免疫采用抗原與福氏不完全佐劑的乳化液。在進行細胞融合前3天，經腹腔注射含150ug抗原的生理鹽水溶液。
[0020]2、雜交瘤細胞的制備
按常規方法收集小鼠的脾細胞與SP2/0細胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000進行融合。用HAT培養液選擇培養，融合后10?15天，取上清采用間接ELISA法篩選分泌抗表位多肽抗原的雜交瘤細胞株。對所得陽性克隆株采用有限稀釋法進行亞克隆。間接ELISA法的操作步驟如下:用200μ1的表位多肽包板，用免疫小鼠血清1: 2000作為陽性對照，無克隆生長的培養基上清和正常小鼠血清作為陰性對照，每孔加1:2000 HRP-山羊抗小鼠IgG 100μ1，最后測定450nm 0D值。凡0D450值大于陰性對照2倍以上者，即可初步判定為陽性克隆。
[0021]3、雜交瘤細胞系的建立
重復步驟2，進行2次細胞融合，經過4次亞克隆和間接ELISA篩選，得到5株分別針對表位多肽，穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
[0022]4、應用上述雜交瘤細胞系所得單抗的效價檢測
1)細胞培養液上清效價測定:間接ELISA法檢測上述雜交瘤細胞培養上清效價為:1:50000-1:100000ο
[0023]2)小鼠腹水效價測定:間接ELISA法檢測上述雜交瘤細胞制備的腹水效價為:1:500000-1:1000000。
[0024]5、雜交瘤細胞系的傳代培養
將上述雜交瘤細胞系在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中繼續進行培養、傳代，培養到10代后，雜交瘤細胞系仍然能夠生長良好、穩定傳代，培養液上清效價仍然可以達到1:10000以上。
[0025]以上結果表明，所得雜交瘤細胞系能夠穩定傳代，可以持續、穩定分泌抗TP53表位多肽的單克隆抗體。
[0026]獲得產生所需的單克隆抗體的雜交瘤細胞后，必須將一部分雜交瘤細胞保存，否則在連續傳代的過程中，可能產生突變或染色體的漂移以至喪失固有特性或丟失產生抗體的特性。另外在長期的培養過程中，難免不發生污染以至于毀滅。所以必須冷藏保存一部分。保存方法如下:
1.材料
(1)細胞:取對數生長期的細胞。
[0027](2) 10% 二甲基亞砜保護液(二甲基亞砜能損壞濾器，而又被高壓所破壞，所以不能過濾或高壓消毒。其本身就是毒品，無菌):含10%二甲基亞砜、20%滅活胎牛血清，70%RPMI—1640液。
[0028](3) 20%FCS —1640培養液:含青霉素 100U/ml，鏈霉素 100yg/ml。
[0029](4)滅菌的2ml安瓶等
2.操作方法
(1)去掉細胞培養瓶中的舊的培養液，加入10 %FCS—1640液，使細胞懸浮。
[0030](3) 1 000r/min離心lOmin，去上清。細胞沉淀用10% 二甲基亞砜保護液制成懸液，使成1.0X107細胞/ml。
[0031 ] (3)取樣，臺盼蘭染色，計數活細胞，應在95%以上。
[0032](4)用注射器將細胞分裝安瓶，每瓶0.5ml?1.0ml，熔封安瓶。
[0033](5)放4°C 2ho
[0034](6)放液氮罐氣態部分(_70°C)15h。
[0035](7)轉入液氮部分。
[0036]實施例2抗TP53表位多肽的單克隆抗體的制備一抗體制備
選擇成年BALB/c小鼠，腹腔接種降植烷，每只小鼠0.5!111。7-10天后腹腔接種第16代雜交瘤細胞，每只小鼠IX 106-2X106個。間隔5天后，待腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可用9號針頭采集腹水。
[0037]將腹水離心(13000r/min30分鐘)，除去細胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用Protein G?Sepharose CL-4B進行純化，上柱液為20mM的PBS緩沖液，柱層析洗脫液為:pH2.7，20mM的甘氨酸緩沖液，得到TP53表位多肽的單克隆抗體(將由表位多肽序列產生的單克隆抗體稱之為clone 3D1。
[0038]二抗體的鑒定
1、抗體純度鑒定:
SDS-PAGE電泳鑒定，純度在95%以上。
[0039]2、抗體類及亞類鑒定:
采用間接ELI SA法，使用抗小鼠各種I g亞型的抗體鑒定上述雜交瘤細胞產生的抗體的Ig亞型，結果顯示，TP53表位多肽的的5個單克隆抗體均為(IgGl)(圖2)。
[0040]3、抗體免疫印跡檢測:
常規Western Blot檢測方法檢測該抗體的特異性，使用SDS-PAGE電泳，濕轉法轉至PVDF膜上，使用純化的抗體進行Western B1 ot雜交檢測。結果顯示，上述方法制得的單克隆抗體均能特異性識別TP53表位多肽。
[0041 ] 4、克隆3D1的可變區序列測定
將克隆細胞株提取mRNA，反轉錄為cDNA，使用可變區通用引物進行高保真PCR擴增，將PCR產物片段插入到T載體內進行DNA序列測定，并將獲得的序列翻譯成蛋白質的氨基酸序列。clone 3D1抗體的可變區氨基酸序列:clone 3D1的氨基酸序列為:輕鏈如SEQ ID N0.l所示，重鏈如SEQ ID N0.2所示。
【主權項】
1.一種單克隆抗體，其是以TP53基因的高度保守蛋白序列為靶蛋白，設計合成表位多肽，與載體蛋白偶聯作為免疫原，通過所述免疫原制備獲得，所述多肽序列選自: TP53 表位多肽:PGTRVRQSQHMTELIRVEC ； 所述載體蛋白為KLH; 所述單克隆抗體特異性地識別TP53蛋白PGTRVRQSQHM TELIRVEC表位序列； 所述單克隆抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。2.產生權利要求1所述單克隆抗體的表位多肽序列及雜交瘤細胞。3.含有權利要求1所述單克隆抗體的檢測試劑盒。4.如權利要求3所述的檢測試劑盒，其為ELISA檢測試劑盒，其以特異性地識別TP53蛋白PGTRVRQSQHMTELIRVEC表位序列的單克隆抗體為包被抗體，以酶標記的異性地識別TP53蛋白PGTRVRQSQHMTELIRVEC表位序列的單克隆抗體作為檢測抗體。5.權利要求1所述的單克隆抗體在檢測TP53蛋白中的應用。6.權利要求3或4所述的檢測試劑盒在檢測TP53蛋白中的應用。
【專利摘要】本發明提供了TP53基因的一種單克隆抗體，其是以TP53基因的高度保守蛋白序列為靶蛋白，設計合成表位多肽，與載體蛋白偶聯作為免疫原，通過所述免疫原制備獲得。本發明提供的單克隆抗體與設計合成表位多肽，可用于檢測人血或組織TP53抗體的定量表達，具有高特異性、高敏感性的優點，在臨床檢測和實驗研究中將會得到廣泛應用。
【IPC分類】C07K14/47, C12R1/91, C12N5/20, C07K16/18, G01N33/68, G01N33/577
【公開號】CN105461807
【申請號】CN201610024192
【發明人】張連波, 孫世龍, 劉穎
【申請人】吉林大學
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2016年1月15日