高活性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的突變體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物藥物領域，具體涉及一種腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體 (TRAIL)的突變體，該突變體與野生型TRAIL相比對腫瘤細胞表面的死亡受體DR5具有更高 的親和力，同時表現出比野生型TRAIL更高的抗腫瘤活性。
【背景技術】
[0002] 腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-relatedapoptosis-inducingligand, TRAIL)又稱為凋亡素2配體(ApoptosisLigand，AP〇-2L)屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族成 員，它與TNF超家族其它成員一樣，屬于Π型跨膜蛋白。由于TRAIL可以特異性誘導腫瘤細胞 凋亡，而對正常細胞幾乎沒有細胞毒性，因此在腫瘤的免疫治療方面具有廣闊的應用前景 (CancerLett2013,332:156-162)〇
[0003] 人TRAIL基因共編碼281個氨基酸，其相對分子量為32.5KD，等電點為7.63，為II型 跨膜蛋白，由胞漿區（14個氨基酸），跨膜區（26個氨基酸)和胞膜外區（241個氨基酸)組成。 TRAIL的細胞內區域(胞漿區）沒有信號肽序列，TRAIL的細胞外部分降解后可形成可溶性 TRAlUsTRAILhsTRAIL缺少跨膜區和胞內區，N末端無信號肽結構，可溶型分子N端氨基酸 的缺失不影響其生物活性。現有技術下最常使用的兩種sTRAIL為TRAIL(95-281)和TRAIL (114-281)，研究表明從95位或114位氨基酸殘基開始構建可溶性TRAIL(sTRAIL)克隆，表達 出的蛋白均有活性，并能與特異性受體結合。膜結合型TRAIL(全長TRAIL)和可溶性胞外區 TRAIL即TRAIL(95-281)或TRAIL(114-281)均可與腫瘤細胞表面的特異性受體結合，選擇性 地誘導腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞幾乎沒有毒性。
[0004] TRAIL的受體分為三類，一類為死亡受體（deathreceptor，DR)，包括TRAIL-R1 (DR4)和TRAIL-R2(DR5)，它們含有胞內死亡結構域和依賴Caspase途徑的凋亡信號的識別 結構域。TRAIL與DR結合后將TRAIL的死亡信息傳遞到細胞內，從而激活Caspase系統，最終 引起細胞凋亡。另一類為誘騙受體(decoyreceptor，DcR)，包括TRAIL-R3(DcRl)和TRAIL-R4(DcR2)，它們由于缺乏胞內功能死亡域而不能介導TRAIL誘導的凋亡，故稱為誘騙受體。 誘騙受體可競爭性抑制TRAIL與DR4和DR5的結合，起促凋亡拮抗作用。第三類為可溶性受體 OPG(osteoprotegrin)，它雖然可與TRAIL結合并抑制其活性，但正常生理條件下與TRAIL結 合力很低（CurrOpinPharmacol2008,8:433-439)。
[0005] TRAIL與腫瘤細胞膜表面的死亡受體DIM和DR5結合可誘導腫瘤細胞調亡，但同時 TRAIL也可與誘騙受體DcRl，DcR2及0PG結合，而這種結合卻不能誘導腫瘤細胞凋亡。因此， 設計和構建對死亡受體DR具有更高親和力的TRAIL突變體，可以減少與誘騙受體DcR及0PG 的結合，同時提高其誘導腫瘤細胞凋亡的活性。
[0006] 本發明構建了對腫瘤細胞表面死亡受體DR5具有更高親合力的TRAIL突變體，該突 變體顯示出比野生型TRAIL更高的抗腫瘤活性。

【發明內容】

[0007] 由于TRAIL的可溶性胞外區即TRAIL( 114-281)或TRAIL(95-281)與全長TRAIL具有 相同的誘導腫瘤細胞凋亡的活性，本發明的目的在于構建對死亡受體DR5具有更高親和力 的TRAIL可溶性胞外區的突變體，以提高其抗腫瘤活性。
[0008] 本發明具體技術方案如下： 一種人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的突變體，含有E263G突變，即以人TRAIL全長 氨基酸序列定位，發生突變的位點位于人TRAIL全長氨基酸序列的第263位，氨基酸由Glu突 變為Gly。由于TRAIL的可溶性胞外區與全長TRAIL具有相同的誘導腫瘤細胞凋亡的活性，因 此本發明中所述突變體可以為野生型、衍生型或重組的膜結合型的TRAIL(全長)或含有可 溶性胞外區的TRAIL活性片段。
[0009] 上述含有可溶性胞外區的TRAIL活性片段，優選TRAIL(114-281 )-E263G，氨基酸序 列如SEQIDNo:l所示。或者優選TRAIL(95-281)-E263G，氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。
[0010] 本發明的另一目的在于提供上述突變體在制備治療或預防細胞凋亡相關疾病藥 物中的用途。所述突變體通過與DR5結合后將TRAIL的死亡信息傳遞到細胞內，從而激活 Caspase系統，最終引起細胞凋亡。所述突變體增強了與DR5的結合力，并提高了其激活 Caspase系統和誘導細胞凋亡的能力。
[0011]進一步的，所述藥物可以說是抗腫瘤藥物。所述藥物含有本發明所述突變體作為 藥物活性成分以及藥學上可接受的載體。
[0012] 進一步的，所述藥物還含有其它抗腫瘤藥物和/或抗腫瘤藥物增敏劑。
[0013] 本發明所述的突變體可以通過人工合成或基因克隆的方法制備所述突變體的編 碼基因，并在相應的宿主細胞中進行表達得到。所述的宿主細胞包括大腸桿菌，酵母，昆蟲 細胞或哺乳動物細胞。
[0014] 在本發明的一個實施例中，利用計算機輔助藥物設計及活性篩選方法獲得了對死 亡受體DR5具有更高親和力的突變體TRAIL( 114-281 )-E263G(即原第263位Glu突變成Gly)， 該突變體顯示出更高的抗腫瘤活性。
[0015] 通過分子克隆的方法，構建出TRAIL(114-281)-E263G突變體的編碼基因，并克隆 到含有Tac啟動子的原核表達載體pTASH(ProteinExprPurif2002,25:430-436)的EcoRI 和Hindm酶切位點之間，然后將重組質粒轉化至宿主菌E.coliJM109中進行胞內表達。工 程菌發酵培養后離心收集菌泥，破壁后離心上清經陽離子交換樹脂SP-SepharoseFast Flow柱層析分離純化，得到純度達95%以上的樣品，經SEC-HPLC分析表明，表達產物以三聚 體形式存在。
[0016] 生物大分子相互作用儀分析顯示，突變體TRAIL(114-281 )-E263G與死亡受體DR5 的親和力(& = 7.73±0.5110-91〇是野生型丁1^幾（114-281)與死亡受體01?5的親和力(& = 1.96±0.2叉10-8]\〇的2.54倍。
[0017] MTT抗腫瘤活性分析顯示，對結腸癌細胞C0L0 205，突變體TRAIL( 114-281 )-E263G (IC5Q = 0 · 44nM)的抗腫瘤活性是野生型TRAIL( 114-281) (IC5Q = 2 · 4nM)的5 · 5倍。
[0018]流式細胞儀分析表明，在相同摩爾濃度條件下，突變體TRAIL(114-281)-E263G促 結腸癌細胞C0L0 205的凋亡率顯著高于野生型TRAIL( 114-281)。
【附圖說明】
[0019] 圖1:突變體了1^11^(114-281)12636原核表達載體口了厶-了1^11^12636示意圖。 (Ptac:Tac啟動子;AP:氨芐抗性基因；TRAIL-E263G:TRAIL( 114-281 )-E263G編碼基因；Ori: pUC質粒復制起始點;rrnBTlT2:轉錄終止子）。
[0020] 圖2:突變體TRAIL(114-281)-E263G蛋白表達情況。（箭頭所指為目的蛋白所在位 置。M:低分子量蛋白Marker;Lane1:野生型TRAIL(114-281)菌體總蛋白；Lane2:TRAIL (114-281)-E263G菌體總蛋白；Lane3:TRAIL(114-281)菌體破碎上清；Lane4:TRAIL(114-281 )-E263G菌體破碎上清；Lane5 :TRAIL( 114-281)菌體破碎沉淀；Lane6:TRAIL( 114-281 )-E263G菌體破碎沉淀）。
[0021] 圖3:10%非還原SDS-PAGE電泳分析突變體TRAIL(114-281)-E263G純化產物。（M: 低分子量蛋白Marker;Lane1:純化的野生型TRAIL(114-281);Lane2:純化的TRAIL(114-281)-E263G)〇
[0022] 圖4:SEC-HPLC色譜分析四種標準蛋白。（色譜柱：ShodexPROTEINKW-802.5， SHOWADENK0Κ·Κ·Japan)分析四種標準蛋白：BSA(Mff=67kDa)、雞卵清蛋白（Mff=43kDa)、 胰凝乳蛋白酶原(MW= 2 5kDa)和溶菌酶(MW= 14.4kDa)。它們的保留時間分別是11.1miη， 11 ·9min，13· 2min，14.lmin，所對應的保留體積分別為7·8ml，8· 3ml，9· 2ml，9·9ml。
[0023] 圖5:SEC-HPLC色譜分析純化的野生型TRAIL( 114-281)。（色譜柱：ShodexPROTEIN KW-802 · 5，SH0WADENK0K·K·，Japan)分析純化的野生型TRAIL( 114-281)，保留時間為 11 · 618，保留體積為8 ·lml，純度為96 · 53% )。
[0024] 圖6:SEC-HPLC分析純化的TRAIL(114-281)-E263G突變體。（色譜柱：Shodex PROTEINKW-802.5，SH0WADENK0Κ·Κ·Japan)分析純化的TRAIL(114-281)-E263G突變體， 保留時間為11.619，保留體積為8.lml，純度為95.91 %。
[0025] 圖7 :MTT法分析野生型TRAIL( 114-281)與TRAIL(114-281 )-E263G突變體對人結腸 癌細胞C0L0 205的促凋亡活性。（野生型TRAIL( 114-281)的IC5Q = 2.4nM;突變體TRAIL( 114-281)-E263G的IC5〇 = 0.44nM)。
[0026] 圖8:人結腸癌細胞C0L0 205在不同濃度的野生型TRAIL(114-281)與TRAIL(114-281 )-E263G突變體作用4h后的凋亡率差異。（0.5nM突變體TRAIL(114-281 )-E263G給藥組 vs· 0 · 5野生型TRAIL( 114-281)給藥組，*P〈0 · 05;InM突變體TRAIL( 114-281 )-E263G給藥組 vs·InM野生型TRAIL( 114-281)給藥組，#P〈0 · 01