一種重組g-csf（15-75）多肽畢赤酵母菌的發酵方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及重組畢赤酵母的發酵，尤其設及制備重組人粒細胞刺激因子多膚 G-CSF(15-75)的畢赤酵母菌的發酵方法
【背景技術】
[0002] 人粒細胞刺激因子化umangranuloc}ftecolony-stimulatingfactors,hG-CSFO 是一種特異的作用于粒系祖細胞，促進其向成熟中性粒細胞增殖、分化并維持其功能、存活 所必須的糖蛋白造血生長因子。1986年，由化gata等從人鱗狀細胞癌細胞系CHU-II中分 離了hG-CSF基因，首次確定了其核巧酸序列并在COS細胞中表達（化gataSetal，化化re， 1986,319 :415-418)。人類有兩種不同的G-CSF的cDNA，分別編碼含207和204個氨基酸 的前體蛋白，均有30個氨基酸的信號膚，成熟蛋白分子為177和174個氨基酸，前者除了在 成熟分子N端35位處插了 3個氨基酸外，其余的序列與174氨基酸分子相同。 陽00引人G-CSF分子量19.6kD，PI為6. 1,0-糖基化，對酸堿（P肥~10)、熱W及變性劑等 相對較穩定。hG-CSF有5個半脫氨酸殘基，其中4個半脫氨酸殘基在切s36與切s42,切s74 與切s64之間形成兩對二硫鍵；切sl7為不配對半脫氨酸，二硫鍵的形成對于維持G-CSF生 物學功能非常重要。G-CSF在臨床應用上具有重要意義，骨髓移植時可促進中性白細胞的恢 復；改善再生障礙性貧血伴隨的中性白細胞缺乏癥；明顯改善癌癥化療時引起的嚴重的中 性粒細胞缺乏，加大腫瘤治療的力度，增強治療效果；廣泛應用于其他伴有中性粒細胞減少 的疾病及抗感染等的治療。
[0004] G-CSF于1991年被美國FDA批準投放市場，用于治療放療后中性粒細胞減少癥，長 效的陽G化的G-CSF也獲得抑A的批準，國內開發的G-CSF二聚體F-627也已完成II期臨 床，并取得較好的效果。John.F.Rei化aar-Olson研究發現G-CSF的Leul5、Glul9、Gln25、 Leu31、Lys34、Lys40、Leu47、Val48、Leu49、Leu54對蛋白活性起重要作用，二硫鍵對于受體 的二聚化，激活下游信號傳導起重要作用。目前，國內生產的G-CSF大多數為大腸桿菌表達 產物，在生產過程中，大腸桿菌表達蛋白的純化工藝繁瑣，周期長，回收率低的特點限制了 其在大規模生產中的應用。畢赤酵母表達外源蛋白技術已經成熟，且分泌表達外源蛋白時 更易于純化，關于G-SCF的發酵，國內也有報道。 陽0化]中國發明專利CN98103011. 4公開了粒細胞集落刺激因子的制備的技術方案，該 技術方案利用工程菌部分蛋白酶基因被突變、外膜易破裂的特點，通過控制較低的發酵溫 度，提高了發酵產量，使分泌速度減慢，降低了蛋白被降解的機率，利用該發明得到的蛋白 經純化后獲得的蛋白純度為99%，產品活性及穩定性達到天然G-CSF的水平。
[0006] 中國發明專利CN1313612C公開了重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法，通過 該技術方案中公開的發酵方法，誘導結束后雖說表達量達50%，但仍采用42°C熱誘導。
[0007] 中國發明專利CN10215489A公開了一種riiG-CSF重組工程菌的發酵培養方法，使 用大腸桿菌發酵，但是表達量均在60%W下。
[0008] 針對現有技術中采用了大腸桿菌和酵母菌進行發酵表達產生完成片段的G-CSF， 但利用大腸桿菌難W解決復性問題，且要求的技術較高，由于表達的片段是完成的G-CSF， 因此表達量可能會有所降低，在進行表達載體的轉化過程中，帶來一定的困難。

【發明內容】

[0009] 鑒于W上技術的缺陷，本發明提供一種表達重組G-CSF(15-75)多膚的畢赤酵母 的發酵方法，得到了一種表達量高，活性好的重組G-CSF(15-75)。
[0010] 根據G-CSF的cDNA然后用畢赤酵母偏愛密碼子對所選氨基酸序列對應的 G-CSF(15-75)基因進行優化，并在其5'端加EcoRI位點和kex2酶切位點，3'端加TAA 終止密碼子和NotI位點。進一步的，將優化的G-CSF(15-75)基因克隆入PPIC9K表達載 體中，制備成PPIC9K-G-CSF(15-75)表達載體，將上述重組表達載體轉化到整合到畢赤酵 母GS115基因組中，保存菌種并標記為CSF(15-75)的己斯德畢赤酵母菌。
[0011] 本發明中所用的工程菌保藏號為CGMCCNO: 10713,分類命名為己斯德畢赤酵母 Pichiapastoris，并于2015年4月13日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 屯、保藏（CGMCC)，保藏單位地址為北京朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究 所。
[0012] 本發明的一個目的在于提供一種重組G-CSF(15-75)多膚畢赤酵母的種子培養方 法。重組G-CSF(15-75)多膚畢赤酵母的種子培養方法為： 陽01引 ①、挑取畢赤酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115單菌落接種至含0. 5mg/ml G418的10mlYro培養基中，26-32°C，250巧m培養10-25小時，得到一級種子液。
[0014] ②、將一級種子液按照2 %的體積接種到200mlBMGY培養基中，26-32°C，250巧m 培養10-25小時，得到二級種子液。
[0015]所述的步驟①的培養條件優選為30°C，250rpm培養18小時；所述的步驟②的培養 條件優選為30°C，250rpm培養18小時，對比實驗發現，合適的溫度及培養時間能夠使畢赤 酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在30°C時，0D600為5,菌種的特性比較穩定，同時確 保了轉入G-CSF(15-75)基因的穩定性。
[0016] 重組G-CSF(15-75)多膚畢赤酵母的發酵培養方法為：
[0017] (1)甘油培養：
[0018] ①、3化發酵罐中加入1化含有4%甘油的BMS培養基，12rC，30min滅菌；
[0019] ②、待培養基冷卻至30°C，調整攬拌速度40化pm，通氣量0. 6m/h，用pH調節劑調節 抑至 4. 5-6. 0 ;
[0020] ③、培養基中添加適量的PTM1微量元素溶液，按照初始體積6-12%的接種量接 種，開始發酵，發酵液中的溶氧量50~80 %時培養18~24小時后，溶氧量值為95 %~ 100%，細胞的濕重為160~180邑/1;
[0021] (2)甘油補料培養：
[0022] 每升甘油中含有12ml的PTM1微量元素溶液，進行甘油補料時，按重量比計算，甘 油的濃度在1~3%，細胞濕重為240~280g/L。 陽02引 做甲醇誘導：
[0024] 調整發酵罐溫度至26-32°C，開始流加甲醇，其中每升甲醇中含有12ml的PTM1微 量元素溶液，誘導55-65小時之后檢測細胞濕重。 陽0巧]所述的甘油培養步驟①的BMS培養基的配方為：85%憐酸25ml/L、硫酸鋼0. 4.g/ ^硫酸巧0. 48g/l、硫酸鐘20. 13g/L、氨氧化鋼4g/L、硫酸儀14. 9g/l、甘油45g/L。 陽0%] 對培養基進行優化，畢赤酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115生長狀況良好。
[0027] 所述的甘油培養步驟②抑調節劑為氨氧化鋼、氨水、二乙胺、S乙胺中的一種或 兩種，優選為氨水，抑值優選為5.0,為了下一步的甲醇誘導做準備。
[0028] 所述的甘油培養步驟③中接種量優選為為初始體積的8% ;所述的PTM1的用量為 41. 5-43. 5mU更好的接種量W及PTM1的用量有助于發酵菌種的生長W及性狀的穩定，DO值接近100%充分說明發酵罐中甘油完全消耗完畢，應該進行下一步的補料培養階段。 W29] 所述甘油補料培養中補料時的轉速為45化pm，補料速度為0-2小時流速為 24. 35ml/ (LA)，2-4 小時為 18. 55ml/OVh)，4-5 小時為 14. 25ml/OVh)，完畢之后將轉速調 整為520巧m。
[0030] 補加過程中的轉速適當提高，可W充分使甘油混合完全，不加完畢之后的低轉速 有利于菌種對甘油的利用且不破壞菌種，采用不同流速進行加入甘油有利于避免發酵過 程中出現氣泡，同時也能控制最終的甘油濃度在1~3%內，優選為1%。檢測細胞濕重 240-280g/l，優選為 280g/L。 W31] 所述的甲醇誘導中的轉速為52化pm-直發酵結束，流加的速度為：0-3小 時1. 0ml/化A)，3-6小時2. 0ml/化A)，6-8小時6. 35~6. 65ml/化A)，8小時至結束 9. 5-10. 8ml/化A)，甲醇誘導過程的溶氧維持在50%~80%之間，抑為4. 9