人b淋巴細胞刺激因子的單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種單克隆抗體，尤其涉及一種人B淋巴細胞刺激因子的單克隆抗體 及含有該抗體的藥物組合物，屬于基因工程抗體技術領域。
【背景技術】
[0002] Blys (B淋巴細胞刺激因子），又稱BAFF，屬于腫瘤壞死因子超家族成員（TNFSF)， 是1999年發現的一種新的細胞因子。人BAFF基因定位于染色體13q32_q34,由6個外顯 子和5個內含子組成。其全長蛋白分子由285個氨基酸組成，為II型跨膜糖蛋白，單體成楔 形樣的"三明治"結構，缺少N-糖基化位點，跨膜區在47-73位氨基酸，133-285位氨基酸為 其發揮功能的主要區域。可溶型Blys (soluble Blys，s Blys)是由膜型Blys在第132或 133位氨基酸殘基發生酶解脫落而形成，兩者的生物學活性基本一致。Blys以同源三聚體 的形式發揮生物學作用。Blys的受體共有三種，即TACI、BCMA和BR3,通過與受體結合調節 著機體免疫平衡。
[0003] BLyS作為一種B淋巴細胞的共刺激因子，主要由巨噬細胞和中性粒細胞分泌產 生，在活化的T細胞和樹突狀細胞中也有少量表達。Blys在B細胞發育、功能調節和自身 免疫性疾病的發病中發揮重要作用，其缺陷或過量表達均可引起機體免疫失衡，從而誘發 多種疾病，可能與某些自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AD)的發生有關。在系統 性紅斑狼瘡（SLE)、干燥綜合征（Sjsngren syndrome，SS)和類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA)等疾病患者血清中Blys水平明顯升高，進一步證實BAFF過表達參與了這 些疾病的發生和發展。
[0004] 自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AD)是一類機體對自身抗原發生免疫反 應而導致自身組織損害的疾病。常見的全身性自身免疫性疾病有系統性紅斑狼瘡（SLE)、干 燥綜合征（Sjsngren syndrome，SS)和類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA)等。目 前，對AD的治療手段仍處于研究和探索中，主要是依賴免疫抑制劑等藥物治療，但療程較 長，發生藥物不良反應較多見。結合基因工程和蛋白質工程技術的靶向抗體藥物治療正成 為新興的研究領域，有望為AD治療提供新的策略。抗體與其靶點的結合是特異性的，能夠 起到介導免疫效應機制的作用，并且在血清中具有較長的半衰期。這些特性使抗體具有很 強的治療應用。
[0005] 目前，FDA于2011年3月9日批準美國人類基因組公司開發的抗Blys單克隆抗體 Belimumab上市，用于治療SLE，成為50年來首個獲準的用于治療SLE的藥物。Belimumab 只針對BLyS刺激的B細胞，與化療藥物相比，大大降低了治療過程中的副作用，因此為系統 性紅斑狼瘡患者提供了一個安全有效的治療方法。由于獨家生產，病人需要花費高額的費 用，目前一個病人用藥一年的費用約在3萬美元左右。所以，研發新的抗Blys單克隆抗體， 從而減少病人負擔，降低治療費用是一個亟待解決的問題。

【發明內容】

[0006] 本發明針對現有技術的不足，提供一種對Blys抑制活性更高的單克隆抗體。
[0007] 本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種抗Blys抗體的重鏈和輕鏈可變 區，所述重鏈可變區的3個互補決定區氨基酸序列分別為，
[0008] CDR-Hl :TFGMN (SEQ ID NO. 1)；
[0009] cdr-h2 Aisx1Gsstiyyadtvkg (seq id no. 2)；
[0010] CDR-H3 :LGDPLLRPKGNAMD (SEQ ID NO. 3)；
[0011] 所述輕鏈可變區的3個互補決定區氨基酸序列分別為，
[0012] CDR-Ll :LASQTIG X2X3LA (SEQ ID NO. 4)；
[0013] CDR-L2 :AAT X4X5AD (SEQ ID NO. 5)；
[0014] CDR-L3 :QQLYSSPWT (SEQ ID NO. 6)；
[0015] 其中，父丨是S或P ;X 2是T或K ;X 3是W或N ;X 4是S、K或R ;X 5是L、F、K或P。
[0016] X!、X2、X3、X4、X5、分別對應序列表中的 Xaa!、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa50
[0017] 進一步，所述抗Blys抗體的重鏈和輕鏈可變區，還包含如（HC-FRl)-(⑶R-H1)_(H C-FR2) - (CDR-H2) - (HC-FR3) - (CDR-H3) - (HC-FR4)式所示在重鏈的互補決定區之間并置的 可變重鏈框架區 HC-FRl、HC-FR2、HC-FR3,和 HC-FR4 ;以及如（LC-FRl)-(CDR-Ll)-(LC-FR2 )-(CDR-L2) - (LC-FR3) - (CDR-L3) - (LC-FR4)式所示在輕鏈的互補決定區之間并置的可變輕 鏈框架區 LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3,和 LC-FR4。
[0018] 優選的，所述可變重鏈框架區和可變輕鏈框架區來自于人胚系（germline)基因。
[0019] 更優選的，至少一個所述可變重鏈框架區和/或至少一個所述可變輕鏈框架區的 氨基酸序列如下所示：
[0020] HC-FRl ：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO. 7)；
[0021] HC-FR2 ：WVRQAPGKGLEffVS (SEQ ID NO. 8)；
[0022] HC-FR3 ：RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO. 9)；
[0023] HC-FR4 ：YffGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 10)；
[0024] LC-FRl ：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO. 11)；
[0025] LC-FR2 ：WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO. 12)；
[0026] LC-FR3 ：GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO. 13)；
[0027] LC-FR4 ：FGGGTKVEIK (SEQ ID NO. 14)。
[0028] 本發明第二方面公開了一種抗Blys抗體，包含重鏈和輕鏈可變區，其重鏈可變區 和輕鏈可變區分別與前述重鏈和輕鏈可變區具有至少90%的整體序列同一性。
[0029] 優選的，所述至少90 %的整體序列同一性是指序列同一性為91 %，92 %，93 %， 94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%。
[0030] 進一步，所述抗體的重鏈可變區的3個互補決定區⑶R-Hl、⑶R-H2、⑶R-H3 其氨基酸序列分別與 TFGMN(SEQ ID NO. I)、YISSGSSTIYYADTVKG(SEQ ID NO. 15)和 LGDPLLRPKGNAMD(SEQ ID NO. 3)具有至少90%的整體序列同一性；所述輕鏈可變區的3個 互補決定區 CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3 其氨基酸序列分別與 LASQTIGTWLA(SEQ ID NO. 16)、 AATRKAD(SEQ ID NO. 17)和 QQLYSSPWT(SEQ ID NO. 6)具有至少 90%的整體序列同一性。
[0031] 優選的，所述抗Blys抗體包含如下氨基酸序列所示的重鏈和輕鏈可變區片段：
[0032] 重鏈可變區：
[0033] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTFGMNWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADTVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGDPLLRPKGNAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 18);輕鏈可變區：
[0034] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAATRKADGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSSPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO. 19)。
[0035] 進一步，所述抗Blys抗體還包括免疫球蛋白的恒定區。
[0036] 更優選的，所述抗Blys抗體，包含（a) -條重鏈，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 20 所示；(b) -條輕鏈，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 21所示。
[0037] 進一步，所述抗BLYS抗體為單克隆抗體。
[0038] 進一步，所述抗BLYS抗體為IgG。
[0039] 優選的，所述抗BLYS抗體為人IgG。
[0040] 更優選的，所述抗BLYS抗體為IgGl。
[0041] 本發明第三方面公開了前述抗Blys抗體的重鏈和輕鏈，以及前述抗Blys抗體在 制備治療Blys相關性疾病的藥物中的用途。
[0042] 進一步，所述Blys相關性疾病為自身免疫性疾病（例如全身性自身免疫性疾病有 人類系統性紅斑狼瘡SLE、干燥綜合征SS和類風濕關節炎RA)，感染性疾病（例如AIDS)，或 增殖性疾病（例如白血病，癌癥和淋巴瘤）。
[0043] 本發明抗Blys抗體的重鏈和輕鏈，以及抗Blys抗體還可以用于與Blys相關的科 學研究，如發育生物學、細胞生物學、代謝、結構生物學、功能基因組學等多個領域的科學研 究、或腫瘤、全身性自身免疫性疾病有SLE、類風濕關節炎等醫學和藥學的應用研究。
[0044] 本發明最后一方面公開了一種藥用組合物，含有有效量的前述抗Blys抗體。
[0045] 本發明所述抗Blys抗體可以為單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及 前述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結合結構域的任何 多肽。
[0046] 進一步，所述藥物組合物中還含有藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。
[0047] 本發明還可以是一種試劑、試劑盒或芯片，包含前述的抗Blys單克隆抗體。
[0048] 本發明還公開了采用抗Blys抗體來抑制Blys活性的方法，以及該抗體用于治療 Blys相關性疾病或使用含有該抗體的試劑盒進行Blys相關診斷與檢測。
[0049] 本發明的抗體可用基因工程技術制得，因為編碼本發明人源化抗體的DNA序列可 用本領域技術人員熟知的常規手段，如根據本發明公開的氨基酸序列人工合成或用PCR法 擴增得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領域熟知的各種方法將該序列連入合適的表 達載體中。
[0050] -旦制得本發明的抗體分子，就可以通過本領域已知的純化免疫球蛋白分子的任 何方法對其進行純化，例如，通過色譜法（例如，離子交換色譜，親和色譜，特別是通過蛋白 A親和色譜和其它柱色譜）、離