專利名稱：重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法
技術領域：
本發明涉及藥用蛋白物質的制備，尤其涉及利用基因重組工程菌進行目的蛋白制備的方法，特別涉及重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法。
背景技術：
1985年Welte.K成功地從人膀胱癌細胞株5637的培養上清液中純化并精制出人粒細胞集落刺激因子(以下簡稱hG-CSF)，然后Welte.K與美國的AMGEN公司的Souza.L.M又進一步確定這種hG-CSF的N段氨基酸排列順序，將來源于5637細胞株的hG-CSF基因克隆化，采用基因工程技術將該基因插入大腸桿菌成功地制得hG-CSF而開發出重組人粒細胞集落刺激因子(以下簡稱rhG-CSF)，商品名為Filgratin(惠爾血)。該藥1991年美國FDA批準上市。hG-CSF由CHO細胞(中華倉鼠卵巢細胞)產生的rhG-CSF來源于人口腔底細胞的基因Granocyte(格拉諾塞特)是一種含有174個氨基酸的糖蛋白，其氨基酸序列和糖鏈組分與人體G-CSF相同。
內毒素、TNF-α和IFN-γ可活化單核細胞和巨噬細胞產生G-CSF。此外，成纖維細胞、內皮細胞、星狀細胞和骨髓基質細胞等在LPS、IL-1或TNF-α刺激活化后也可分泌G-CSF。某些白血病細胞以及CHu-2人口腔癌細胞、5637人膀胱癌細胞、MIAPa Ca-2胰腺癌細胞可組成性地表達G-CSF。
1986年G-CSF cDNA克隆成功，G-CSF基因全長2.5kb，包括5個外顯子和4個內含子。人類有兩種不同的G-CSF cDNA，分別編碼含207和204氨基酸的前體蛋白，均有30個氨基酸的先導序列，成熟蛋白分子分別為177和174個氨基酸，前者除了在成熟分子N端35位處插入了3個氨基酸外，其余的序列與174氨基酸分子相同。人G-CSF分子量為19.6kDa，PI6.1，O-糖基化，對酸堿(pH2～10)、熱以及變性劑等相對較穩定。G-CSF有5個半胱氨酸，Cys 36與Cys42，Cys74與Cys64之間形成兩對二硫健，Cys17為不配對半胱氨酸，二硫鍵對于維持G-CSF生物學功能是必須的因素。
G-CSF主要作用于中性粒細胞系(lineage)造血細胞的增殖、分化和活化。在體外G-CSF刺激骨髓造血祖細胞中中性粒細胞集落的形成，延長成熟中性粒細胞的存活時間，活化中性粒細胞，促進其ADCC，超氧陰離子的產生和堿性磷酸酶的合成。最近研究表明，單獨G-CSF或與SCF協同可促進多能造血干細胞的增殖、干細胞母細胞集落形成以及體內CFU-S的形成。G-CSF還具有對人粒細胞、單核細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞以及成肌纖維細胞的趨化作用。腫瘤患者注射G-CSF后可提高血循環中中性粒細胞的水平，這種作用可能與縮短某些骨髓細胞進入S期的時間以及增加生成粒細胞的祖細胞數量有關。
申請人深圳新鵬生物工程有限公司生產的rhG-CSF，商品名為瑞血新，采用工程菌DH5α-PBV220-hGCSF制備而成，含有175個氨基酸，分子量為18.8kDa，等電點6.2±0.4，除了第一個氨基酸外，其他174個氨基酸排列順序與天然人體的G-CSF序列完全相同，在中國獲得批準上市，可適用于癌癥放、化療等原因引起的白細胞減少癥，是腫瘤放、化療過程中重要的輔助用藥。
目前，國內外生產的各種rhG-CSF商品都已經應用到臨床，并取得了很好的效果。人們也在尋求簡化rhG-CSF制備工藝，增加制品的活性，降低成本的各種各樣的方法。這些方法可以分化為三類第一種方法是從能夠分泌rhG-CSF的重組基因工程菌菌株入手，以期獲得獲得產量高的、便于后期提取處理的菌種，如中國專利ZL98103011.4和中國專利申請01800753.8各公開了一種分泌rhG-CSF的大腸桿菌菌株；第二種方法是能夠從對重組基因工程菌菌株進行高密度、快速培育入手，雖然大量文獻提到菌株的培養，但大多是輕描淡寫，沒有對該種方法予以深入研究和分析，換句話來說，就是在該領域一直以來沒有好的突破；第三種方法則是從rhG-CSF的提取、純化入手，如中國專利ZL96106418.8中公開了一種采用外壓式中空纖維超濾透析復性，以離子交換柱層析、疏水柱層析和分子篩柱層析順序組合純化以制備高純度藥用rhG-CSF蛋白方法。
現有技術如何解決rhG-CSF的制備上始終存在包涵體復性率偏低、活性偏低以及成本偏高等問題方面，一直以來沒有好的解決方案。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于克服現有技術的不足，從對重組基因工程菌菌株進行高密度、快速培育入手，來解決rhG-CSF的制備上存在的表達率偏低、菌體產量偏低、包涵體復性率偏低、活性偏低以及成本偏高等問題。
本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是，提出一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，包括步驟a.選用工程菌DH5α-PBV220-hGCSF做菌株進行發酵培養；b.對發酵培養所得菌體進行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；c.對精制包涵體進行變性處理，得到變性所得物；d.對變性所得物進行第一次復性處理，得到第一次復性所得物；e.對第一次復性所得物進行超濾處理，得到超濾所得物；f.對超濾所得物進行第二次復性處理，得到第二次復性所得物；g.對第二次復性所得物進行層析處理，得到重組人粒細胞集落刺激因子。
同現有技術相比較，采用本發明的重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，為解決rhG-CSF的制備上存在的包涵體復性率偏低、活性偏低以及成本偏高等問題提供了可能。
具體實施例方式
以下對本發明予以進一步詳盡說明。
本發明的重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，包括步驟a.選用工程菌DH5α-PBV220-hGCSF菌株進行發酵培養；b.對發酵培養所得菌體進行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；c.對精制包涵體進行變性處理，得到變性所得物；d.對變性所得物進行第一次復性處理，得到第一次復性所得物；e.對第一次復性所得物進行超濾處理，得到超濾所得物；f.對超濾所得物進行第二次復性處理，得到第二次復性所得物；g.對第二次復性所得物進行層析處理，得到重組人粒細胞集落刺激因子。
選用工程菌DH5α-PBV220-hGCSF做菌株的好處是其rhG-CSF蛋白占菌體總蛋白的40％以上。
其中，步驟a又包括步驟種子液培養和分批補料發酵，所述種子液培養包括以下子步驟①.菌種的篩選從菌種保存庫中取出所述工程菌，劃LB平板30℃培養過夜，挑取單菌落接種于含100μg/ml氨芐青霉素的5ml LB試管中培養，至OD600值為0.4-0.6，再于42℃培養4小時，離心收集菌體，SDS-PAGE分析，用重組人粒細胞集落刺激因子表達量最高的克隆作為發酵用種子，分裝甘油保存，每批發酵取用一支；②.一級種子液培養將種子按2％的體積比接種到含2YT種子培養基的50ml三角瓶中，30℃，200r/min搖床培養，至OD600值為0.6-1.0；③.二級種子液培養將一級種子液以1％的體積比接種到含200ml 2YT種子培養基的500ml三角瓶中，30℃，250r/min，搖床培養12-16小時，至OD600值為3.5-6.5，鏡檢無雜菌，菌種形態正常，即為發酵用種子；所述分批補料發酵包括以下子步驟①.發酵前的準備采用NBS 20L發酵罐，將pH電極、溶氧電極校正和安裝好；將8L發酵培養基接入發酵罐，設定滅菌溫度115℃，30min，發酵罐自動在線滅菌；②.基本發酵滅菌后，待培養基溫度降到30℃時，按接種量10％體積比接入二級種子液，30℃，培養8小時，開始誘導表達；③.誘導發酵誘導溫度為42℃，誘導4小時，結束發酵；上述分批補料發酵子步驟②和③中，通過補加4mol/L NaOH(氫氧化鈉)控制pH為7.0-7.1，通過調節發酵罐的空氣流速和轉速，控制溶氧值為50％；并且當OD600值為2時，開始補料，補料方式為每小時補加補料I和II各100ml。
所述LB的配方為蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，加純化水定容至1L。
所述2YT培養基的配方為蛋白胨16g，酵母粉10g，氯化鈉5g，加純化水定容至1L。
上述經4小時誘導發酵后，經離心收集，平均濕菌收率可達80-100g/L。
本發明發酵過程的難點在于根據所選用工程菌的生長特性，而提供相應的發酵條件，具體包括溫度、PH值控制，溶氧量控制，比如本發明之所以溶氧量控制采用50％，而不是采用一般發酵工藝中的30％左右，就是經過反復分析、實驗得出的優選數據。
本發明發酵過程的難點還在于適合工程菌的生長特性的培養基配方的選擇，以及分時分批補料時補料本身配方的選擇。
本發明選用的發酵培養基配方為蛋白胨20g，酵母粉120g，甘油40ml，硫酸銨50g，葡萄糖100g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀100g，磷酸二氫鉀20g，加純化水定容至8L。
本發明選用的補料I的配方為葡萄糖300g，硫酸銨50g，加純化水定容至1L。
本發明選用的補料II的配方為酵母粉300g，酪蛋白水解物20g，維生素B10.1g，加純化水定容至1L。
采用本發明發酵方法，可以從對重組基因工程菌菌株進行高密度、快速培育入手，解決rhG-CSF的制備上存在的表達率偏低、菌體產量偏低、活性偏低以及成本偏高等問題。
收集到的發酵過程后菌體可以在-20℃的冷藏設備中進行保藏、轉運，也可以立即進行包涵體的分離與洗滌、復性、超濾和層析等提取、純化工藝過程以制備高純度藥用rhG-CSF蛋白。
本發明所述步驟b包括將所述工程菌菌體按1∶5的g/ml比，加入菌體破碎緩沖液中，超聲破碎至菌體破碎率為98％以上，10000r/min，離心40min，保留沉淀；將沉淀用洗滌液洗滌三次；第3次添加1％的去氧膽酸鈉，再用去離子水洗滌2次，10000r/min，離心40min，收集沉淀，即為精制包涵體；其中所述破碎緩沖液的配方為1mmol/L EDTANa2(乙二胺四乙酸二鈉)，80mmol/L NaCl(氯化鈉)，50mmol/L Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸)，pH8.0；所述洗滌液的配方為5mmol/L EDTANa2，80mmol/L NaCl，3mmol/L Urea，50mmol/LTris-HCl，pH8.0。
本發明所述步驟c包括以1∶20的g/ml比，將精制包涵體用變性液混勻，攪拌2小時以上，即為變性所得物；所述變性液的配方為1mmol/L EDTANa2，10mmol/L DTT(二巰基蘇糖醇)，8mol/L Urea(尿素)，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0。
本發明所述步驟d包括將變性所得物以13000r/min離心40min，棄去沉淀，將上清緩慢倒入復性液中，控制蛋白濃度在0.05mg/ml，攪拌20小時以上，即為第一次復性所得物；所述復性液的配方為1mol/L Urea，0.1mmol/L GSH(還原型谷胱甘肽)，0.01mmol/L GSSG(氧化型谷胱甘肽)，30mmol/L Tris-HCl，pH8.5。
本發明所述步驟e包括用Millipore超濾儀，超濾膜截留分子量10KDa，使用前先用純化水和蒸餾水充分清洗系統，將第一次復性所得物超濾濃縮，終體積為原體積的1/15，即為超濾所得物。
本發明所述步驟f包括將超濾所得物放置于2-8℃環境，繼續復性96小時以上，復性率達到92％以上，即為第二次復性所得物。
本發明所述步驟g包括用10％的冰醋酸調節第二次復性所得物pH為5.4，離心10000r/min，30min，保留上清液；將SP Sepharose High Performance層析柱用pH為5.4的30mmol/mol NaAC(醋酸鈉)平衡，將上清液上柱，用pH為5.4的含120mmol/L NaCl的30mmol/LNaAC洗脫，收集SP Sepharose High Performance層析柱的主峰物質；將Sephadex G25柱以pH為4.0的10mmol/L NaAC平衡，將收集到的SP Sepharose High Performance層析柱的主峰物質上SephadexG25柱，收集主峰，即為重組人粒細胞集落刺激因子。
采用本發明的重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法的一個具體實施結果就是瑞血新，其經SDS-PAGE電泳掃描，純度達到99％以上，HPLC顯示單峰，rhG-CSF比活性不低于4.0×108IU/mg。
權利要求
1.一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，包括步驟a.選用工程菌DH5α-PBV220-hGCSF菌株進行發酵培養；b.對發酵培養所得菌體進行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；c.對精制包涵體進行變性處理，得到變性所得物；d.對變性所得物進行第一次復性處理，得到第一次復性所得物；e.對第一次復性所得物進行超濾處理，得到超濾所得物；f.對超濾所得物進行第二次復性處理，得到第二次復性所得物；g.對第二次復性所得物進行層析處理，得到重組人粒細胞集落刺激因子。
2.如權利要求1所述的重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于所述步驟a包括種子液培養和分批補料發酵，所述種子液培養包括以下子步驟①.菌種的篩選從菌種保存庫中取出所述工程菌，劃LB平板30℃培養過夜，挑取單菌落接種于含100μg/ml氨芐青霉素的5ml LB試管中培養，至OD600值為0.4-0.6，再于42℃培養4小時，離心收集菌體，SDS-PAGE分析，用重組人粒細胞集落刺激因子表達量最高的克隆作為發酵用種子，分裝甘油保存，每批發酵取用一支；②.一級種子液培養將種子按2％的體積比接種到含2YT種子培養基的50ml三角瓶中，30℃，200r/min搖床培養，至OD500值為0.6-1.0；③.二級種子液培養將一級種子液以1％的體積比接種到含200ml 2YT種子培養基的500ml三角瓶中，30℃，250r/min，搖床培養12-16小時，至OD600值為3.5-6.5，鏡檢無雜菌，菌種形態正常，即為發酵用種子；所述分批補料發酵包括以下子步驟①.發酵前的準備將8L發酵培養基接入20L的發酵罐中，115℃滅菌30分鐘；②.基本發酵滅菌后，待培養基溫度降到30℃時，按接種量10％體積比接入二級種子液，30℃，培養8小時，開始誘導表達；③.誘導發酵誘導溫度為42℃，誘導4小時，結束發酵；所述分批補料發酵子步驟②和③中，通過補加4mol/L氫氧化鈉控制pH為7.0-7.1，通過調節發酵罐的空氣流速和轉速，控制溶氧值為50％；并且當OD600值為2時，開始補料，補料方式為每小時補加補料I和II各100ml；所述發酵培養基的配方為蛋白胨20g，酵母粉120g，甘油40ml，硫酸銨50g，葡萄糖100g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀100g，磷酸二氫鉀20g，加純化水定容至8L；所述補料I的配方為葡萄糖300g，硫酸銨50g，加純化水定容至1L；所述補料II的配方為酵母粉300g，酪蛋白水解物20g，維生素B1 0.1g，加純化水定容至1L。
3.如權利要求1所述的重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，所述步驟b包括將所述工程菌菌體按1∶5的g/ml比例，加入菌體破碎緩沖液中，超聲破碎至菌體破碎率為98％以上，10000r/min，離心40min，保留沉淀；將沉淀用洗滌液洗滌三次；第3次添加1％的去氧膽酸鈉，再用去離子水洗滌2次，10000r/min，離心40min，收集沉淀，即為精制包涵體；其中所述破碎緩沖液的配方為1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，80mmol/L氯化鈉，50mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH8.0；所述洗滌液的配方為5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，80mmol/L氯化鈉，3mmol/L尿素，50mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH8.0。
4.如權利要求1所述的重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，所述步驟c包括以1∶20的g/ml比例，將精制包涵體用變性液混勻，攪拌2小時以上，即為變性所得物。
5.如權利要求4所述的重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，所述變性液的配方為1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，10mmol/L二巰基蘇糖醇，8mol/L尿素，50mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH8.0。
6.如權利要求1所述的重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，所述步驟d包括將變性所得物以13000r/min離心40min，棄去沉淀，將上清緩慢倒入復性液中，控制蛋白濃度在0.05mg/ml，攪拌20小時以上，即為第一次復性所得物。
7.如權利要求6所述的重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，所述復性液的配方為1mol/L尿素，0.1mmol/L還原型谷胱甘肽，0.01mmol/L氧化型谷胱甘肽，30mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH8.5。
8.如權利要求1所述的重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，所述步驟e包括選擇超濾膜截留分子量10KDa，超濾儀使用前先用水充分清洗，將第一次復性所得物超濾濃縮，終體積為原體積的1/15，即為超濾所得物。
9.如權利要求1所述的重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，所述步驟f包括將超濾所得物放置于2-8℃環境，96小時以上，即為第二次復性所得物。
10.如權利要求1所述的重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，所述步驟g包括用10％的冰醋酸調節第二次復性所得物pH為5.4，離心10000r/min，30min，保留上清液；將SP Sepharose High Performance層析柱用pH為5.4的30mmol/mol醋酸鈉平衡，將上清液上柱，用pH為5.4的含120mmol/L氯化鈉的30mmol/L醋酸鈉洗脫，收集SP Sepharose High Performance層析柱的主峰物質；將Sephadex G25柱以pH為4.0的10mmol/L醋酸鈉平衡，將收集到的SP Sepharose High Performance層析柱的主峰物質上Sephadex G25柱，收集主峰，即為重組人粒細胞集落刺激因子。
全文摘要
一種重組人粒細胞集落刺激因子的制備方法，包括步驟a.選用工程菌DH5α－PBV220－hGCSF菌株進行發酵培養；b.對發酵培養所得菌體進行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；c.對精制包涵體進行變性處理，得到變性所得物；d.對變性所得物進行第一次復性處理，得到第一次復性所得物；e.對第一次復性所得物進行超濾處理，得到超濾所得物；f.對超濾所得物進行進行第二次復性處理，得到第二次復性所得物；g.對第二次復性所得物進行層析處理，得到重組人粒細胞集落刺激因子，其純度達到98％以上、比活性不低于4.0×10
文檔編號C07K14/435GK1718739SQ20041002794
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月7日 優先權日2004年7月7日
發明者李政海, 胡家華, 李繼東 申請人:深圳新鵬生物工程有限公司