專利名稱：聚乙二醇化重組人干擾素ω偶合物及其制備工藝的制作方法
技術領域：
涉及一種治療對干擾素w敏感的病毒感染的藥物制劑，尤其是一種能夠明顯減少用藥次 數，具有長效作用的聚乙二醇化重組人干擾素偶合物以及其制備工藝。
背景技術：
干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(主要是糖蛋白)，是一種由單核細胞和淋巴 細胞產生的細胞因子。它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長和分化、調節免 疫功能等多種生物活性。根據干擾素蛋白質的氨基酸結構、抗原性和細胞來源，可將其分為 :IFN- a 、 IFN- e 、 IFN- y 。 IFN- w屬于IFN- a家族，其結構和大小與其它IFN- a稍有差異 ，但抗原性有較大的不同。自80年代以來，許多研究顯示，干擾素除具有抗病毒、免疫調節 的作用外，還具有明顯的抗細胞增殖作用。
干擾素(interferon omega， IFN-")是一類同干擾素a在基因序列上有60%同源性 的新的干擾素分子，具有廣譜抗病毒、抗細胞增殖和免疫調節的功能，w干擾素是奧地利科 學家Rudelf Hamptman等于1985年發現的I型干擾素，其與a干擾素功能相近，但抗原性不 同。近年來，研究人員發現人w干擾素具有同a干擾素、y干擾素以及腫瘤壞死因子相似的 ，較強的抗病毒復制、抗細胞增殖等作用，其臨床應用已逐漸展開。如美國Biomedicines公 司重組人w干擾素用于治療丙性肝炎的臨床試驗已經進入II期臨床。
蛋白質藥物已成為當前藥物研究開發的熱點，在臨床治療中的地位日益重要。但蛋白 質藥物最大的問題是存在自身穩定性差、半衰期短及可能存在的免疫原性等限制。而采用聚 乙二醇修飾蛋白質技術，可有效解決蛋白質藥物的此類缺陷。
聚乙二醇(polyethleneglycol， PEG)是一種安全無毒、無活性的聚合物，常用于蛋白 藥物修飾。Davis, Abuchowski及其同事在20世紀70年代最先研究和開發出聚乙二醇化技術 。研究顯示聚乙二醇化能夠改變藥物動力學，進而可以改變治療分子的藥效學。美國FDA目 前批準了幾種聚乙二醇化蛋白質藥物，其中包括聚乙二醇化干擾素a 。大量臨床研究表明它 無論是單用還是與病毒唑合用治療慢性丙型肝炎的療效明顯高于未經結構修飾的IFN- a 。
臨床上，廣泛應用的聚乙二醇化干擾素包括先靈葆雅公司的開發的聚乙二醇化干擾素a -2b (商品名，佩樂能，Peglntron);羅氏公司開發的聚乙二醇化干擾素a-2a (商品名， 派羅欣，Pegasys)，通過與利巴韋林聯合廣泛用于慢性乙型和丙型肝炎的治療。
4本發明針對采用蛋白質藥物自身存在的缺陷，采用聚乙二醇化技術修飾w-干擾素，提 供了一種聚乙二醇分子與重組人干擾素w的N末端結合，且一個重組人干擾素分子結合一個 聚乙二醇分子的聚乙二醇化重組人干擾素w藥物的制備方法。有效提高蛋白質藥物自身穩定 性、延長半衰期短以及降低免疫原性，改變藥動學，從而改變了藥物的藥效學，在臨床作用 方面具有很好的應用前景。

發明內容
本發明所要解決的首要技術課題是提供一種有利于工業化生產、且能明顯減少用藥 次數、用于慢性肝炎臨床治療的聚乙二醇化重組人干擾素藥物。
本發明涉及一種化學修飾的干擾素偶聯物，其結構如I式所示 R-L-M-NH-( rhIFN-w) I
其中，R表示具有cr4烷烴端基的水溶性聚合物，
L表示0、 N、 NH原子， M表示C廣6飽和脂肪烴亞基， NH表示rhIFN- w的N末端氨基， rhIFN- w表示基因重組人干擾素w 。
其中水溶性聚合物包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸、聚合氨基酸、分支聚乙二醇、分 支聚丙二醇、分支聚合氨基酸等，具有在5kDa 100kDa之間的分子量，優選的水溶性聚合物 為聚乙二醇，具有在5kDa 40kDa之間的分子量；優選的聚乙二醇為， 一端為甲基保護的聚乙 二醇；結構式I式中所述L優選擇為O原子或NH原子；其中所述M優選C3 4飽和脂肪烴亞基， 最佳選擇為直鏈亞丙基。
本發明專利所提及的偶聯物的制備方法為，控制緩沖體系的鹽濃度范圍在 1(Tl00mmol/L之間，優選5(T80mmol/L之間；pH值范圍在4. 0 9. 0之間，優選4. 5 6. 5之間； 加入重組人干擾素w與聚乙二醇醛基衍生物反應，控制兩反應物的摩爾質量比范圍在 0. 25 20之間，優選1.(T10之間；反應時間范圍在1 48小時之間，優選8 24小時之間；反 應溫度范圍在4。C 37。C之間，優選4TT25。C之間；并加入催化量的NaCNBH3作為催化劑，反 應產物經過分于篩色譜、離子交換色譜、疏水層析分離純化，收集一個聚乙二醇分子連接一 個重組人干擾素w分子的聚乙二醇化重組人干擾素w經過過濾除菌，冷凍干燥后即得。同時 要求一種可用于臨床治療的藥物組合物，其中含有有效量的I式偶聯物，和藥用稀釋劑、佐 劑或載體。本發明所要解決的再一個技術課題是提供一種上述聚乙二醇化重組人干擾素藥物的生產 工藝。
結構式I所示偶聯物的合成方法是本領域所熟知的，在氰基硼氫化鈉存在下，帶醛基的 PEG會和伯胺發生還原氨化反應。醛基和其它的親電活性基團不同，它只和胺基反應。雖然 醛基的反應活性比NHS活性酯低，但是它具有反應條件溫和，易于使PEG和蛋白質或其它材料 的表面連接。因此，在較低的pH下，mPEG-醛會對蛋白質的N端進行選擇性反應。該反應條件 在pH值4.0-6. 5之間，50-100mmol/L鹽濃度的緩沖體系下；溫度在4-25'C之間，反應時間為 8-24小時之間；反應摩爾比PEG:rhlFN-w在l:l-10:1之間， 一般情況下，選擇低溫、低pH值 、反應時間適宜條件下可得到N-末端修飾產物，且反應轉化率較高。
修飾后的偶聯物可以采用陽離子交換色譜純化。例如，混合物上柱后，用P^4.0 20mM 的醋酸鈉淋洗；再用0-lM氯化鈉梯度洗脫，pH值可以控制在3-5.5之間，最佳為pH4. 0。收集 到的組分，可以使用質譜、SDS-PAGE等方法通過檢測分子量來確認。
影響PEG化反應的因素主要有1) pH值；2)溫度；3)反應時間；4)蛋白與PEG試劑摩爾 比；5)蛋白濃度。通過控制一個或多個反應因素，我們可以得到所期望的修飾樣品
反應條件
聚合物分子量可以是任意大小，結構的聚乙二醇分子，所選分子量可以是lkDa到大約 lOOkDa(術語大約意指聚乙二醇制品中， 一些分子大于所述分子量，另一些小于所述分子量 )。PEG分子量的選取，取決于所需的治療方案(例如所需的緩釋時間、活性、處理的方便性 、抗原性大小或缺乏以及其它一些PEG對治療性蛋白質及其類似物的已知效應)。 一般來說 ，聚合物的分子量越大，結合到蛋白質上的聚合物分子數越少。聚合物分子量越高(分枝越 多)，聚合物對蛋白質的比例應越高。
反應投料比聚乙二醇分子對蛋白質分子的比例與它們在反應混合物中的濃度一樣，可 以改變， 一般來說，聚乙二醇對蛋白質分子的最佳比例(指反應效率而言，即反應混合物中 沒有多余未反應的蛋白質及聚合物分子)將根據所選聚乙二醇分子量進行測定。
pH會影響到所有的聚合物分子與蛋白質分子的比例， 一般來說，如果反應液pH低于pK， 聚合物分子比例應大大超過蛋白質分子為好；如果pH高于pK，則聚合物對蛋白質分子的比例 不必要太大。反應體系pH值的不同將導致聚合物與蛋白質的結合位點有明顯差別。對于 PEG-醛要選擇性的修飾蛋白質N-末端氨基酸，就要使反應體系中的pH值高于a氨基的pK值而 低于e氨基的pK值，才能達到理想的修飾效果。
反應時間反應程度隨時間的延長而增加，與反應溫度相關。通常溫度越高，反應時間越短， 一般選擇半小時至24小時不等。
反應溫度通常聚合物與蛋白質反應溫度為4度或者25度室溫，反應在低溫狀態下進行很 慢，但有利于蛋白質結構的穩定，得到相同的修飾產物需要時間較長，而高溫則有利于反應 的進行，相應可縮短反應時間。也可以選用4度-25度室溫之間的某一溫度條件。
分離純化凝膠過濾色譜按照分子量大小來分離組分，修飾后的蛋白質由于分子量增大 ，因此可以用凝膠過濾色譜將修飾和未修飾的蛋白有效分離。陽離子層析技術根據電荷差別 可作為有效的分離方法來分離修飾混合物。例如，陽離子裝柱好后，用20mM醋酸鈉(pH4.0 )沖洗，然后用含有0-1M氯化鈉的緩沖液進行線形洗脫，緩沖液的pH可以在3-3.5之間，優 選pb4.0。由陽離子層析得到的層析組分可用傳統的方法鑒別其分子量，如質譜、 SDS-PAGE電泳，或其它已知鑒定化合物分子量的方法。
rhIFN- w與PEG醛的偶聯可采用如下方法進行
1) 提供pH 4. 0 9. 0、 10 100mmol/L的鹽濃度的緩沖體系；
2) 重組人干擾素與聚乙二醇活性酯在步驟1)提供的體系中反應1 48小時，溫 度控制在4 37°C，比例控制在1 10之間；
3) 經步驟2)反應得到的產物經離子交換層析后或分子篩色譜層析后，收集主要 含一個聚乙二醇分子的聚乙二醇化重組人干擾素洗脫峰，用于純度和活性檢測。
本發明涉及一種用PEG定點修飾的rhIFN-"，其偶聯物結構是在已有技術中沒有的。本 發明偶聯物可以顯著增加rhIFN-"的半衰期，增加rhIFN-"的治療效果。
與現有技術相比，本發明所具備的突出的實質性特點和顯著的技術進步。 主要表現在以下3個方面
本發明所提供的聚乙二醇化重組人干擾素-w藥物的優點是提供在體內更長時間的血液
水平，具有明顯的長效性，減少注射次數而使患者容易接受；
本發明所述的重組人干擾素-w是采用基因工程的方法，使用本研究室的專利載體，用
畢赤酵母表達，經發酵、純化后獲得，純度大于98%，且保持較高的生物活性；
本發明采用對重組人干擾素-w的N末端選擇性高的修飾方法，即聚乙二醇活性醛和重 組人干擾素w的N末端通過共價鍵方式連接，使產物的均一性得到大大提高，容易純化，純 化產物的活性能夠較好地保留。


圖l rhlFN-w與20K mPEG丙醛不同摩爾比例修飾反應結果的SDS-PAGE圖其中泳道M、 I、 A、 B、 C分別為 M. Marker I. rhIFN-w
A. rhIFN-oj : mPEG丙醛二 1:1
B. rhIFN-mPEG丙醛二 1:3
C. rhIFN-mPEG丙醛二 1:5
圖2 rhIFN-w與20K mPEG丁醛不同摩爾比例修飾反應結果的SDS-PAGE圖 其中泳道M、 I、 A、 B、 C分別為 M. Marker I. rhIFN-w
A. rhIFN- w : mPEG丁醛二 1:1
B. rhIFN- w : mPEG丁醛二 1:3
C. rhIFN- w : mPEG丁醛二 1:5
圖3 20K mPEG丙醛與rhIFN-w反應物凝膠色譜圖 圖4 20K mPEG丙醛與rhIFN-w反應物離子交換色譜圖 圖5離子交換色譜各組分峰SDS-PAGE圖
其中P1為雙PEG修飾rhlFN-oj ; P2為單PEG修飾rhlFN-w ; P3為rhlFN-w; I為rhlFN-w ;P為mPEG丙醛修飾rhIFN-w反應混合物；M為Marker具體實施方式
實施例l
在本實施例中使用的重組人干擾素^的純度大于98%，且保持有較高的生物活性；將 重組人干擾素溶于100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)中，按重組人干擾素w與聚乙二醇 丙醛摩爾比l:l的比例加入單甲氧基聚乙二醇縮丙醛(mPEG-propionaldehyde， mPEG-ALD) ，攪拌溶解，再加入NaCNBH3，室溫反應48小時。 實施例2
在本實施例中使用的重組人干擾素^的純度大于98%，且保持有較高的生物活性；將重 組人干擾素溶于100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)中，按重組人干擾素w與聚乙二醇丙 醛摩爾比1:3的比例加入單甲氧基聚乙二醇縮丙醛(mPEG-propionaldehyde, mPEG-ALD)， 攪拌溶解，再加入NaCNBH3，室溫反應24小時。
實施例3
8在本實施例中使用的重組人干擾素^的純度大于98%，且保持有較高的生物活性；將重
組人干擾素溶于100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)中，按重組人干擾素w與聚乙二醇丙 醛摩爾比1:5的比例加入單甲氧基聚乙二醇縮丙醛(mPEG-propionaldehyde， mPEG-ALD)， 攪拌溶解，再加入NaCNBH3，室溫反應12小時。 實施例4
在本實施例中使用的重組人干擾素^的純度大于98%，且保持有較高的生物活性；將 重組人干擾素溶于100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)中，按重組人干擾素w與聚乙二醇 丁醛摩爾比l:l的比例加入單甲氧基聚乙二醇縮丁醛，攪拌溶解，再加入NaCNBH3，室溫反應 48小時。
實施例5
在本實施例中使用的重組人干擾素^的純度大于98%，且保持有較高的生物活性；將重 組人干擾素溶于100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)中，按重組人干擾素w與聚乙二醇丁 醛摩爾比1:3的比例加入單甲氧基聚乙二醇縮丁醛，攪拌溶解，再加入NaCNBH3，室溫反應 24小時。
實施例6
在本實施例中使用的重組人干擾素^的純度大于98%，且保持有較高的生物活性；將重 組人干擾素溶于100mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)中，按重組人干擾素w與聚乙二醇丁 醛摩爾比1:5的比例加入單甲氧基聚乙二醇縮丁醛，攪拌溶解，再加入NaCNBH3，室溫反應 12小時。
實施例7
將上述重組人干擾素與聚乙二醇反應得到的產物經Superdex 200凝膠過濾色譜(流動相 為含O. 15M NaCl磷酸鹽緩沖液p^7.0，流速lml/min)分離純化，收集各組分峰，經脫鹽濃縮 后用于活性和純度的檢測。
實施例8
將重組人干擾素與聚乙二醇反應得到的產物經過陽離子交換色譜SP-FF分離純化，以緩 沖液A(20mM醋酸鈉，pH=4. 0;流速lml/min)平衡上樣，緩沖液B(20mM醋酸鈉+lM氯化鈉 pH二4)線性洗脫，收集各組分峰，經脫鹽濃縮后用于活性和純度的檢測。
權利要求
1.一種化學修飾的干擾素偶聯物，其結構如I式所示R-L-M-NH-(rhIFN-ω)I其中，R表示具有C1~4烷烴端基的水溶性聚合物，L表示O、N、NH原子，M表示C1~6飽和脂肪烴亞基，NH表示rhIFN-ω的N末端氨基，rhIFN-ω表示基因重組人干擾素ω。
2.根據權利要求l所述偶聯物，其中所述水溶性聚合物包括聚乙二醇 、聚丙二醇、聚乳酸、聚合氨基酸、分支聚乙二醇、分支聚丙二醇、分支聚合氨基酸等。
3.根據權利要求2所述偶聯物，其中所述水溶性聚合物為聚乙二醇， 具有在5kDa 100kDa之間的分子量。
4.根據權利要求r3所述任一偶聯物，其中所述水溶性聚合物的端基為甲基。
5.根據權利要求4所述偶聯物，其中所述L表示O或NH。
6.根據權利要求5所述偶聯物，其中所述M表示C3 4飽和脂肪烴亞基。
7.根據權利要求5所述偶聯物，其中所述M表示直鏈亞丙基。
8.根據權利要求5 7所述任一偶聯物的制備方法為，(1) 提供pH4. 0 9. 0、 1(Tl00mmol/L的鹽濃度的緩沖體系；(2) 重組人干擾素w與聚乙二醇醛基衍生物反應的摩爾比例為O. 25 20;(3 )聚乙二醇醛基衍生物與重組人干擾素w在(1)步驟提供的體系中反應1 48小時， 溫度控制在4TT37'C;(4)經步驟(3)反應得到的產物經過分子篩層析、離子交換層析、疏水層析分離純化 ，收集偶聯一個聚乙二醇分子的重組人干擾素"分子(rhIFN-w)，經過過濾除菌，冷凍干 燥后即得。
9.根據權利要求8所述偶聯物的制備方法，其中反應條件為(1) pH值在4. 5 6. 5之間，5(T80mmol/L的鹽濃度的緩沖體系；(2) 重組人干擾素w與聚乙二醇醛基衍生物反應的摩爾比例控制在rio之間；(3) 溫度控制在4TT25。C;(4) 反應時間為8 24小時。
10.根據權利要求8或9所述的聚乙二醇化重組人干擾素w (rhIFN-w )藥物的生產工藝，其特征在于聚乙二醇與重組人干擾素"(rhIFN-w)發生共價結合反 應需要用氰基硼氫化鈉作為催化劑。
11.一種可用于臨床治療的藥物組合物，含有有效量的選自權利要求rio中任一偶聯物，和藥用稀釋劑、佐劑或載體。
全文摘要
本發明公開了聚乙二醇化重組人干擾素ω偶聯物及其制備工藝，相比未修飾的干擾素ω，在人體內具有更長的半衰期，能夠明顯減少用藥次數，降低毒副作用，特別適合于治療對干擾素ω敏感的慢性病毒感染，臨床上具有廣泛的應用前景。
文檔編號A61K47/48GK101491682SQ20081030140
公開日2009年7月29日 申請日期2008年4月30日 優先權日2008年4月30日
發明者嚴玖鳳, 佳 劉, 李晉峰, 王玉民, 申曉陽, 娜 邢, 婷 陳 申請人:北京凱正生物工程發展有限責任公司