專利名稱：聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子的純化方法
技術領域：
本發明涉及利用重組DNA技術生產基因工程藥物的方法，具體涉及聚こニ醇化重組人粒細胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF或PEG-G-CSF)的純化方法，屬于醫藥技術領域。
背景技術：
粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是造血因子之一，由175個氨基酸組成，是ー種水溶性的蛋白，具有疏水性。它的主要作用是刺激中性粒細胞系造血細胞的増殖、分化，増加外周血中性粒細胞數量，活化中性粒細胞功能，在預防和治療多因素引起的中性粒細胞減少癥及其并發癥(如發熱、感染等)方面療效顯著。1991年，Amgen(安姆根)公司的重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)被FDA批準上市用于化療引起的中性粒細胞減少癥的治療。但作為ー種生物大分子藥物，rhG-CSF像大多數生物制品一祥，在臨床應用中存在體內半衰期短，易被酶水解和腎臟清除等問題。在化療過程中，需要長達兩周的持續每日靜脈或 皮下注射，造成病人依從性較差。聚こニ醇(PEG)修飾是實現蛋白質藥物長效的ー種應用較為廣泛的方法，PEG修飾的蛋白質和多肽類藥物半衰期明顯延長，溶解度和穩定性得到改善，免疫原性降低，生物利用度增強，毒副作用減少。PEG修飾的rhG-CSF實現了長效增加外周血中性粒細胞數的目的，2002年，FDA又批準了 Amgen公司的聚こニ醇化粒細胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)上市，商品名Neulasta。PEG-G-CSF是由單甲氧基聚こニ醇丁醛與大腸桿菌表達純化的蛋氨酰化的粒細胞集落刺激因子N-末端賴氨酸氨基共價連接而成，與G-CSF相比其在體內的半衰期明顯延長，因而可以減少治療時的注射次數，減少病人的痛苦。在PEG-G-CSF的純化過程中，需要去除PEG與G-CSF交聯反應液中的交聯劑、ニ交聯的G-CSF及未交聯的G-CSF等。由于交聯產生的多種不同交聯蛋白異構體，除了分子量有所區別外，其他性質如表面電荷、疏水性等差別較小，因此，分離純化交聯蛋白產物，成為聚こニ醇化技術的難點之一。安姆根公司在專利CN1071760C中公開了 N-末端PEG化rh-G-CSF的純化方法,將交聯反應混合物上樣于陽離子交換層析柱Sepharose FF柱，以醋酸鈉緩沖液平衡后進行線性洗脫，收集洗脫液；將洗脫液再進行分子篩層析的方法來純化。雖然，分子篩層析能夠去除分離各種交聯異構體，但是由于分子篩很難在エ業中實現放大，因此國內大多數的純化方法是根據表面電荷的差異，采用離子交換層析進行分離純化，例如CN1663962A公開了 PEG-G-CSF的一步純化方法，采用陽離子交換層析柱SP SepharoseF.F.裝柱后用こ酸-こ酸鈉緩沖液平衡，再用不同pH值的こ酸-こ酸鈉緩沖液洗脫。此純化工藝雖然可以實現エ業上的放大，但由于采用的是作用比較單ー的陽離子交換介質進行吸附-解析來進行分離，其內毒素很難控制，導致終產品中內毒素含量不容易控制，影響了產品的質量。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種聚こニ醇化重組人粒細胞集落刺激因子的純化方法，本發明的發明人對各種層析方法進行了大量的研究，發現利用脫鹽層析、離子交換串聯層析和脫鹽層析順序組合純化，能夠獲得高純度的聚こニ醇化重組人粒細胞集落刺激因子。本發明純化工藝充分利用了目的蛋白在表面電荷和疏水性上的特點，先通過ー個陰離子交換層析柱，有效的去除了內毒素，増加了エ藝的可控性；第二步層析充分利用目的蛋白的強疏水性，實現了串聯層析，將內毒素的去除和蛋白的純化兩個步驟合并為ー個步驟。本エ藝不僅可以有效去除內毒素，并且簡化了操作步驟，節省了生產時間，提高了生產效率，十分適合大規模エ業化放大生產。實施本發明的前期步驟為現有技術可以采用CN1071760C中公開的方法來獲得聚こニ醇化重組人粒細胞集落刺激因子交聯液，將該交聯液作為后續處理的對象。該方法主要步驟在于將經過脫鹽后的聚こニ醇化重組人粒細胞集落刺激因子交聯液順次通過陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱串聯層析系統，利用內毒素與陰離子交換層析柱的高度吸附作用達到去除內毒素的目的；之后采用添加了氯化鈉的緩沖液単獨對多結合型離子交換層析柱進行洗脫，收集洗脫后的目的蛋白液；更進一歩的，本發明的具體處理步驟如下(I)聚こニ醇化重組人粒細胞集落刺激因子交聯液經過葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽，得脫鹽液；(2)脫鹽液順次通過陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱串聯層析系統，使內毒素結合到陰離子交換層析柱上，至上樣完畢；(3)采用添加了氯化鈉的緩沖液単獨對多結合型離子交換層析柱進行洗脫，收集洗脫后的目的蛋白液；(4)洗脫后的目的蛋白液經過葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱脫鹽去除Na+、Cl-,得到高純度的蛋白樣品。上述過程中，步驟(I)和(2)中的葡聚糖凝膠G-25脫鹽層析柱和陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱串聯層析洗脫在上樣前均采用PH6. 0-8. 5，濃度為IOmmol/L lOOmmol/L的磷酸鹽緩沖液進行平衡；其中優選采用pH7. 0-8. O、濃度為20mmol/L 50mmol/L的磷酸鹽緩沖液進行平衡；步驟(2)中采用的陰離子交換層析柱的層析介質包括瓊脂糖凝膠(S印harose)類、聚苯こ烯(SOURCE)類，配基為季氨基Q或ニこ基氨こ基DEAE ;優選層析介質為瓊脂糖凝膠類，配基為季氨基Q或ニこ基氨こ基DEAE ;最優選的層析介質為瓊脂糖凝膠類，配基為李氨基 Q (Sepharose Q Fast Flow)；步驟(2)中的多結合型離子交換層析柱的層析介質為高流速瓊脂糖凝膠類、聚苯こ烯類或硅顆粒類，配基為帶部分疏水基團的離子交換配基；其中優選配基為N-苯甲基-N-甲基こ醇胺、帶疏水基團的季氨基和帶疏水基團的磺酸基；最優選優選層析介質為高流速瓊脂糖類，配基為N-苯甲基-N-甲基こ醇胺(Captro adhere)；這種多結合型離子交換層析介質相較于単一性質的分離層析介質，同時具有離子 交換功能基團和疏水作用功能基團，可以通過兩種作用方式，將蛋白吸附在層析介質上，從而實現通過多種性質進行目的蛋白的純化、分離。而步驟(2)中所述的脫鹽液可以連續通過陰離子交換層析柱和多結合型離子交換層析柱串聯層析系統；同樣的步驟(2)中所述的脫鹽液也可以首先通過陰離子交換層析柱之后收集，再集中通過多結合型離子交換層析柱。步驟(3)中所述的添加氯化鈉的緩沖液為Tris-HCl或醋酸鈉緩沖液，緩沖液pH為4. O 7. O,緩沖液濃度為10mmol/L 100mmol/L ;優選緩沖液濃度為20mmol/L 50mmol/L,而其中所添加氯化鈉的緩沖液中氯化鈉的濃度為100mmol/L I. Omol/L ;優選氯化鈉的濃度為100mmol/L 600mmol/L。控制氯化鈉的濃度可以使得緩沖液的離子強度發生變化，從而使吸附在陽離子交換層析柱上的目標蛋白解吸，達到了分離的目的。
所述步驟(4)中的葡聚糖凝膠G-25脫鹽層析柱在上樣前，需采用pH4. O的20mM的醋酸鈉緩沖液進行平衡。采用這種技術后，通過采用合適的緩沖體系和層析介質，將兩步層析進行了串聯，簡化了層析步驟，節省了層析時間和エ藝成本，并提高了エ藝的處理量。PEG-G-CSF的等電點為5. O 5. 3左右，如果通過陰離子交換層析采用流穿的方式進行內毒素的去除，傳統エ藝需要將緩沖液的PH值調整為5. O以下，但是那樣會使去除內毒素的效果大大減弱。通過選擇合適的磷酸鹽緩沖液和pH值，將目的蛋白在高pH的條件下，仍能穿過陰離子交換層析，確保了去內毒素效果，減輕了后續純化步驟的負荷，提高了エ藝穩定性；PEG-G-CSF的疏水性較強，采用帶疏水基團的多結合型離子交換層析介質，在低離子強度條件下將目的蛋白吸附在多結合型離子交換層析介質上，并將內毒素去除和蛋白純化兩步層析實現了串聯。同時，通過內毒素去除和蛋白純化的蛋白液，可以再經過最后一歩的脫鹽層析改變串聯層析后所得蛋白液的緩沖體系，之所以這樣設計，主要是由于純化步驟采用了添加了氯化鈉的緩沖液，所得的蛋白液也含有這種緩沖液，為了去除其中的氯化鈉，需再經過脫鹽層祈，可以用適合于制劑生產的緩沖液洗脫，這樣就使緩沖體系改變了，所得目的蛋白液可以不再經過其他處理，純度高達99%以上，可以直接用于制劑生產。綜上所述，本發明采用的純化工藝充分利用了目的蛋白在表面電荷和疏水性上的特點，先通過ー個陰離子交換層析柱，有效的去除了內毒素，増加了エ藝的可控性；第二步層析充分利用目的蛋白的強疏水性，實現了串聯層析，將內毒素的去除和蛋白的純化兩個步驟合并為ー個步驟。本エ藝不僅可以有效去除內毒素，并且簡化了操作步驟，エ藝設計合理，エ藝過程簡單，易于控制，便于操作，重復性好；目的蛋白損失少，蛋白收率和質量有明顯提高；一次性處理蛋白量大，エ藝穩定性強，適合于大規模エ業生產。


圖I為Captro adhere離子交換層析圖譜；圖2為Captro adhere離子交換層析電泳圖譜；圖中 I 為ニ交聯 mPEG-G-CSF，2 為 mPEG-G-CSF，3 為 G-CSF。
具體實施例方式以下通過實施例將進ー步說明本發明，這些實例不應作為本發明的限制。聚こニ醇化重組人粒細胞集落刺激因子交聯液可由現有技術直接獲得，如CN1071760C中公開的方法。
實施例II、采用ρΗ8· 5的IOOmM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G_25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯液上樣完畢，收集脫鹽液。2、先將陰離子交換層析柱和多結合型離子交換層析柱進行串聯，陰離子交換層析柱的層析介質為瓊脂糖凝膠(sepharose Q Fast Flow),多結合型離子交換層析柱的層析介質為高流速瓊脂糖凝膠(Captro adhere)。3、用pH8. 5的IOOmM磷酸鹽緩沖液平衡對串聯層析柱進行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH8. 5的IOOmM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱分開，用pH7. O的IOOmM Tris-HCl緩沖液平衡Captro adhere離子交換層析柱，然后用含O. I I. Omol/L氯化鈉的pH7. O的IOOmM Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，收集目的蛋白液，用醋酸將其PH調整至4. 5左右。
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4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級層流罩下進行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進行SDS-PAGE檢測純度平均可達97%以上，串聯柱收率可達68%以上。實施例2I、采用ρΗ6· O的IOmM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯液上樣完畢，收集脫鹽液。2、先將陰離子交換層析柱和多結合型離子交換層析柱進行串聯，陰離子交換層析柱的層析介質為瓊脂糖凝膠(sepharose Q Fast Flow),多結合型離子交換層析柱的層析介質為高流速瓊脂糖凝膠(Captro MMC)。3、用pH6. O的IOmM磷酸鹽緩沖液平衡對串聯層析柱進行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH6. O的IOmM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱分開，用pH4. O的IOOmM醋酸鈉緩沖液平衡Captro MMC離子交換層析柱，然后用含0. lmol/L I. 0mol/L氯化鈉的pH4. O的20mM醋酸鈉緩沖液進行梯度洗脫，收集目的蛋白液。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級層流罩下進行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進行SDS-PAGE檢測純度平均可達97%以上，串聯柱收率可達70%以上。實施例3I、采用ρΗ8· O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G_25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯液上樣完畢，收集脫鹽液。2、先將陰離子交換層析柱和多結合型離子交換層析柱進行串聯，陰離子交換層析柱的層析介質為瓊脂糖凝膠(sepharose DEAE Fast Flow),多結合型離子交換層析柱的層析介質為高流速瓊脂糖凝膠(Captro adhere)。3、用pH8. O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡對串聯層析柱進行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH8. O的20mM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱分開，用pH6. O的20mM Tris-HCl緩沖液平衡Captro adhere離子交換層析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化鈉的pH7. O的20mM Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，收集目的蛋白液，用醋酸將其PH調整至4. 5左右。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級層流罩下進行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進行SDS-PAGE檢測純度平均可達99%以上，串聯柱收率可達75%以上。實施例4I、采用ρΗ7· O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯液上樣完畢，收集脫鹽液。 2、先將陰離子交換層析柱和多結合型離子交換層析柱進行串聯，陰離子交換層析柱的層析介質為瓊脂糖凝膠(sepharose DEAE Fast Flow),多結合型離子交換層析柱的層析介質為高流速瓊脂糖凝膠(Captro MMC)。3、用pH7. O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡對串聯層析柱進行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH7. O的20mM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱分開，用pH5. O的20mM醋酸鈉緩沖液平衡Captro MMC離子交換層析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化鈉的pH5. O的20mM醋酸鈉緩沖液進行梯度洗脫，收集目的蛋白液。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級層流罩下進行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進行SDS-PAGE檢測純度平均可達99%以上，串聯柱收率可達75%以上。實施例5I、采用ρΗ7· 5的30mM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯液上樣完畢，收集脫鹽液。2.先將陰離子交換層析柱和多結合型離子交換層析柱進行串聯，陰離子交換層析柱的層析介質為瓊脂糖凝膠(sepharose Q Fast Flow),多結合型離子交換層析柱的層析介質為高流速瓊脂糖凝膠(Captro adhere)。3、用pH7. 5的30mM磷酸鹽緩沖液平衡對串聯層析柱進行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH7. 5的30mM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱分開，用pH6. O的20mM Tris-HCl緩沖液平衡Captro adhere離子交換層析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化鈉的pH6. O的20mM Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，收集目的蛋白液，用醋酸將其PH調整至4. 5左右。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級層流罩下進行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進行SDS-PAGE檢測純度平均可達99%以上，串聯柱收率可達80%以上。實施例6I、采用ρΗ6· 5的50mM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G_25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯液上樣完畢，收集脫鹽液。
2、先將陰離子交換層析柱和多結合型離子交換層析柱進行串聯，陰離子交換層析柱的層析介質為瓊脂糖凝膠(sepharose Q Fast Flow),多結合型離子交換層析柱的層析介質為高流速瓊脂糖凝膠(Captro MMC)。3、用pH6. 5的50mM磷酸鹽緩沖液平衡對串聯層析柱進行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH6. 5的50mM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱分開，用pH5. O的30mM醋酸鈉緩沖液平衡Captro MMC離子交換層析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化鈉的pH5. O的30mM醋酸鈉緩沖液進行梯度洗脫，收集目的蛋白液。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級層流罩下進行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進行SDS-PAGE檢測純度平均可達99%以上，串聯柱收率可達80%以上。
實施例7I、采用ρΗ8· O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G_25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯液上樣完畢，收集脫鹽液。2、先將陰離子交換層析柱和多結合型離子交換層析柱進行串聯，陰離子交換層析柱的層析介質為瓊脂糖凝膠(sepharose DEAE Fast Flow),多結合型離子交換層析柱的層析介質為高流速瓊脂糖凝膠(QMA Spherosil LS)。3、用pH8. O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡對串聯層析柱進行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH8. O的20mM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱分開，用PH6. O的20mM Tris-HCl緩沖液平衡QMA Spherosil LS離子交換層析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化鈉的pH7. O的20mM Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，收集目的蛋白液，用醋酸將其PH調整至4. 5左右。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級層流罩下進行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進行SDS-PAGE檢測純度平均可達99%以上，串聯柱收率可達75%以上。實施例8I、采用ρΗ8· O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex G-25)脫鹽層析柱，將PEG-G-CSF交聯液上樣完畢，收集脫鹽液。2、先將陰離子交換層析柱和多結合型離子交換層析柱進行串聯，陰離子交換層析柱的層析介質為瓊脂糖凝膠(sepharose Q Fast Flow),多結合型離子交換層析柱的層析介質為高流速瓊脂糖凝膠(QMA Spherosil LS)。3、用pH8. O的20mM磷酸鹽緩沖液平衡對串聯層析柱進行平衡，將收集的脫鹽液上樣，完畢后，再用PH8. O的20mM磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。然后將陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱分開，用PH6. O的20mM Tris-HCl緩沖液平衡QMA Spherosil LS離子交換層析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化鈉的pH7. O的20mM Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，收集目的蛋白液，用醋酸將其PH調整至4. 5左右。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸鈉緩沖液平衡葡聚糖凝膠G_25 (Sephadex G-25)脫鹽柱，將目的蛋白液上樣，用平衡緩沖液繼續洗脫，收集蛋白峰得到高純度蛋白樣品。5、在百級層流罩下進行除菌過濾，即為PEG-G-CSF原液，取樣進行SDS-PAGE檢測純度平均可達99%以上，串聯柱收率可達75%以上。試驗例I聚こニ醇化重組人粒細胞集落刺激因子的藥效學研究PEG-G-CSF主要通過PEG的末端醛基與G-CSF的氨基酸殘基反應而成的，與G-CSF相比，分子量的増加 ，降低了 PEG-G-CSF在腎小球的濾過率，提高了藥物的穩定性。因為PEG-G-CSF在清除過程中存在著自我調節過程，在中性粒細胞水平恢復以前，血清中PEG-G-CSF的水平要高于同等劑量G-CSF的血清水平，從而使半衰期得以延長，由原來的
3.5小時延長到33小吋。藥效學研究可知，PEG-G-CSF可減少化療期間IV度中性粒細胞減少的發生率，升高中性粒細胞最低值，60、100或200 μ g/kg每個化療周期給藥I次能較好地預防中性粒細胞減少癥。G-CSF的半衰期較短，需要毎日注射，每個化療周期至少連續注射2周；而PEG-G-CSF每療程只需注射I次，且在安全性和療效方面與每日注射G-CSF相仿。這樣以來PEG-G-CSF相對于G-CSF就具有低給藥頻率和提高病人順應性的優勢。比較例I采用實施例5所述的方法對聚こニ醇化重組人粒細胞集落刺激因子進行純化，同時采用現有技術CN1663962A公開的純化方法進行對比，對比結果如下表現有技術與本發明技術參數對比
技術參規模原液收率原液純度生產周
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現有技批次量5g40-53% 含有少量聚體，95. 7% 38小時
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本發明批次量IOg57-68%98. 2%34小時可見，采用本發明所述的純化方法，簡化了操作步驟，縮短處理所需的時間，エ藝設計合理，エ藝過程簡單，易于控制，便于操作，重復性好；目的蛋白損失少，蛋白收率和質量有明顯提高；一次性處理蛋白量大，エ藝穩定性強，適合于大規模エ業生產。
權利要求
1.一種聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子的純化方法，其特征在于將經過脫鹽后的聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子交聯液順次通過陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱串聯層析系統，使內毒素結合到陰離子交換層析柱上； 之后采用添加了氯化鈉的緩沖液單獨對多結合型離子交換層析柱進行洗脫，收集洗脫后的目的蛋白液； 其中所述的步驟(2)中采用的陰離子交換層析柱的層析介質為瓊脂糖凝膠類或聚苯乙烯類，配基為季氨基Q或二乙基氨乙基DEAE ； 所述的多結合型離子交換層析柱的層析介質為高流速瓊脂糖凝膠類或聚苯乙烯類或硅顆粒類，其配基為帶部分疏水基團的離子交換配基； 所述的添加了氯化鈉的緩沖液為Tris-HCl或醋酸鈉緩沖液，緩沖液pH為4. O 7. O，緩沖液濃度為10mmol/L 100mmol/L ;其中氯化鈉濃度為O. lmol/L I. Omol/L。
2.根據權利要求I所述的聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子的純化方法，其特征在于具體步驟如下 (1)聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子交聯液經過葡聚糖凝膠G-25(SephadexG-25)脫鹽，得脫鹽液； (2)脫鹽液順次通過陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱串聯層析系統，使內毒素結合到陰離子交換層析柱上，至上樣完畢； (3)采用添加了氯化鈉的緩沖液單獨對多結合型離子交換層析柱進行洗脫，收集洗脫后的目的蛋白液； (4)洗脫后的目的蛋白液經過葡聚糖凝膠G-25(S印hadexG-25)脫鹽柱脫鹽去除Na+、Cl-，得到高純度的蛋白樣品。
3.根據權利要求2所述的聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子的純化方法，其特征在于所述步驟(I)中的葡聚糖凝膠G-25脫鹽層析柱和步驟(2)中的陰離子交換層析柱與多結合型離子交換層析柱串聯層析洗脫在上樣前，均采用PH6. 0-8. 5、濃度為lOmmol/L IOOmmoI/L的磷酸鹽緩沖液進行平衡。
4.根據權利要求2所述的聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子的純化方法，其特征在于所述步驟(4)中的葡聚糖凝膠G-25脫鹽層析柱在上樣前需采用pH4. O的20mM的醋酸鈉緩沖液進行平衡。
5.根據權利要求I或2所述的聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子的純化方法，其特征在于所述的添加了氯化鈉的緩沖液為Tris-HCl或醋酸鈉緩沖液，緩沖液濃度為20mmol/L SOmmoI /I,;其中氣化納濃度為 O. lmol/L O. Bmmol /I,η
6.根據權利要求I或2所述的聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子的純化方法，其特征在于所述步驟(2)中的陰離子交換層析柱的層析介質層析介質為瓊脂糖類，配基為季氨基Q或二乙基氨乙基DEAE ； 多結合型離子交換層析柱的層析介質為高流速瓊脂糖類，配基為N-苯甲基-N-甲基乙醇胺。
全文摘要
本發明提供一種聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子的純化方法，本發明的發明人對各種層析方法進行了大量的研究，發現利用脫鹽層析、離子交換串聯層析和脫鹽層析順序組合純化，能夠獲得高純度的聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子。本發明純化工藝充分利用了目的蛋白在表面電荷和疏水性上的特點，先通過一個陰離子交換層析柱，有效的去除了內毒素，增加了工藝的可控性；第二步層析充分利用目的蛋白的強疏水性，實現了串聯層析，將內毒素的去除和蛋白的純化兩個步驟合并為一個步驟。本工藝不僅可以有效去除內毒素，并且簡化了操作步驟，節省了生產時間，提高了生產效率，十分適合大規模工業化放大生產。
文檔編號C07K1/18GK102850450SQ201110184390
公開日2013年1月2日 申請日期2011年7月1日 優先權日2011年7月1日
發明者王晶翼, 孫麗霞, 王克波, 艾現偉, 董婷, 王希菊, 張樂, 王樂 申請人:齊魯制藥有限公司