專利名稱：粒細胞集落形成刺激因子(g-csf)的突變體及其化學綴合多肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及癌癥治療中作為佐劑的人粒細胞集落形成刺激因子(G- CSF)的突變體及其化學綴合物，其用于通過當施用抗癌癥藥物時刺激從骨髓細胞形成嗜中性粒細胞集落和誘導骨髓細胞向最終階段分化來抑制白細胞減少，本發明更具體地，涉及通過G-CSF 上的特異性位點處的氨基酸取代或插入而修飾的人粒細胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突變體，以及其與非蛋白質聚合物，如聚乙二醇(PEG)的化學綴合物。
背景技術：
人造血活動主要在骨髓中進行，并通過多種復雜的途徑產生多種血細胞。造血活動由特異性糖蛋白控制，通常稱所述糖蛋白為集落形成刺激因子(CSFs)。已經按照它們的活性確定并識別了 CSFs。就是說，在半固體培養基中培養血細胞時，作為生長因子的CSFs 刺激單核細胞、粒細胞或其它造血細胞的克隆形成。例如，粒細胞-CSF(G-CSF)和巨噬細胞-CSF(M-CSF)分別刺激嗜中性粒細胞和巨噬細胞集落的體外形成，而多-CSF，也稱為白介素-3 (IL-3)，刺激多種類型的血液和組織細胞，如粒細胞、巨噬細胞、巨核細胞、紅細胞， 等的克隆增殖。特別地，已知G-CSF通過刺激嗜中性先祖細胞的分化和/或增殖和激活成熟嗜中性粒細胞來促進嗜中性粒細胞的吞噬活性，并且促進趨化因子的反應性，其中所述 G-CSF是指導髓間干細胞和骨髓外白細胞的分裂和分化的細胞因子((Metcalf，Blood(血液))67 257(1986) ； (Yan 等，Blood(血液))84(3) :795_799 (1994) ； (Bensinger 等， BloocK 血液))81(11) 3158-3163(1993) ； (Roberts 等，Expt ‘ 1 Hematology)22 1156-1163(1994) ； (Neben 等，Blood (血液))81 (7) 1960-1967 (1993))。通常通過放射療法和/或化學療法進行惡性腫瘤的治療，其不合需要地導致白血胞的急劇減少，且伴隨白細胞減少而發生免疫性的減弱，因此當放射療法和/或化學療法的治療方法進行一段延長的時期時，導致明顯的缺陷。最初將G-CSFs報告為能夠通過激活患者的免疫能力有效治療癌癥的佐劑(Lopez等，J. Immunol.(免疫學雜志)131 (6) 2983-2988,1983 ；Platzer 等，J. Exp. Med. 162 :1788_1801，1985)，并且目前用于有效地治療多種癌癥和難以治療的白血病。G-CSFs的研究最初開始于發現粒細胞-CSF物質出現在人癌CHU-2細胞系(Nomura 等，EMBO J. 8 (5) =871-876,1986)或人膀胱癌細胞系 5637(ffelte 等，Proc. Narl. Acad. Sci. USA(美國國家科學院會刊)82 1526-1530，1985 ；Strige 等，Blood(血液)69(5) =1508-1523,1987)的培養基中，并且純化具有粒細胞_集落刺激活性且具有 18-19kDa 的分子量的蛋白質(Nomura 等，EMBO J. 5 (5) :871_876，1986)。G-CSFs的cDNA首次由L. M. Souza等從人膀胱癌細胞系5673分離而來 (Science (科學)，232 :61_65 (1986)(見韓國專利公開號1998-77885)， 并且然后從鱗狀癌細胞系和外周血巨噬細胞的cDNA文庫進行克隆(S. Nagata等，Nature (自然)，319: 415-417(1986) ；S. Nagata 等，EMBO J. ,5:575-581 (1986) ；Y. Komatsu 等，Jpn. J. Cancer Res.(日本癌癥研究綜述雜志)，78 1179-1181 (1987))。隨著基因重組技術的出現，揭示出G-CSFs是在由大腸桿菌(Escherichia coli) 表達大量G-CSF期間作為不可溶性內含體產生的，并通過重折疊轉化為活性G-CSFs。由大腸桿菌產生的重組G-CSF(rG-CSF)包括SEQ ID NO :2確定的蛋白質(175個氨基酸)，即SEQ ID NO 1確定的天然G-CSF (174個氨基酸)和N-末端的甲硫氨酸，并且具有約為19kDa的
分子量。另外，天然G-CSF在位置第133處的氨基酸蘇氨酸(Thr)中具有0_糖基化位點， 而源自大腸桿菌的r G-CSF不具糖基化位點。然而，已知糖基化位點和/或N-末端甲硫氨酸的存在或缺乏對生物活性幾乎無影響(Souza等=Science (科學)232，1986，61)。生物蛋白治療劑，如G-CSF，具有有利地高選擇性和低毒性，但它們體內停留時間短并且不穩定。為了克服這些缺點，開發了一種將生物適合性聚合物與生物蛋白(多肽) 綴合的方法，其中所述生物適合聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮，所述生物蛋白(多肽)例如G-CSF或干擾素。此PEG綴合通過有效地抑制蛋白酶而阻止生物蛋白的降解，通過阻止生物蛋白治療劑從腎臟的快速排泄而增加生物蛋白治療劑的穩定性和半衰期，并降低其免疫原性(Sada等，J. Fermentation Bioengineering(發酵生物工程雜志)71 137-139 (1991))。特別地，PEG化的蛋白治療劑的實例包括一種腺苷脫氨酶的PEG化制劑，其被開發為組合的免疫缺陷的治療劑；一種干擾素的PEG化制劑，其被開發為肝炎的治療劑；以及葡糖腦苷脂酶和血紅蛋白的PEG化制劑，等。除PEG外，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3- 二氧戊環，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/馬來酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或隨機共聚物)通常在化學偶聯所述蛋白質治療劑中使用。由于作為具有通式HO- (-CH2CH2O-) n_H的聚合化合物的PEG是高親水性的，所述它與蛋白質結合，以用于醫藥應用，從而增加其溶解性。與所述蛋白質結合的PEG具有范圍在約1，000_約100,000內的分子量。如果PEG的分子量超過1，000，則PEG具有顯著低毒性。 具有約1，000-約6，000范圍內分子量的PEG系統性地存在并通過腎臟代謝。特別地，具有分子量約40，000的分支PEG存在于諸如血液、肝等器官中，并通過腎臟代謝。美國專利號4，179，337公開一種具有生理活性的非免疫原性的水溶性多肽組合物，其具有與聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)偶聯的多肽，并具有500-20，000道爾頓的分子量。為了將PEG與多肽偶聯，通常使用活化的PEG。通過將PEG的一個末端的羥基轉化為甲醚基，另一個末端的羥基轉化為親電子基團來制備活化的PEG，由此使PEG通過該親電子基團與多肽偶聯。然而，由于這樣的化學偶聯反應是非特異性的，所以對蛋白質，即多肽活性位點的PEG化不合需要地降低該蛋白質的活性，這種情形的實例見于由Roche和 Schering開發的PEG化(PEGylated)的干擾素-α中。由Roche和Schering開發的干擾素-α的PEG綴合物是這樣的綴合物，其中PEG分子與干擾素-α分子組合。盡管PEG綴合增加PEG化的干擾素-α的體內半衰期，但PEG與干擾素-α的多種位點偶聯，由此顯著地降低其生物活性。

普遍使用的活化的PEG的實例包括(a)PEG 二氯三嗪，(b)PEG三氟乙基磺酸酯(tresylate), (c)PEG碳酸琥珀酰亞胺酯，(d)PEG苯并三唑碳酸酯，(e)PEG對硝基苯基碳酸酯，(f) PEG三氯苯基碳酸酯，(h) PEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯，等(M. J.Roberts， Μ. D. Bentley, J. Μ. Harris, Chemistry for peptide and protein PEG conjugation (妝和蛋白質PEG綴合的化學)，Advanced Drug Delivery Reviews (高級藥物遞送綜述)54 (2002) 459-476)。由于所述化學偶聯反應是非特異性的，所以可以生成多聚體或異構體，其中所述多聚體具有多個與之鍵合的PEG，所述異構體具有與其不同位點鍵合的PEG。 所述多聚體和異構體降低PEG化產物的生物活性，難以進行精確的PEG綴合的藥物動力學測量和純化過程。為了克服這些問題，美國專利號5，766,897和WO 00/42175公開了一種利用 PEG-馬來酰亞胺選擇性地使PEG與蛋白質的半胱氨酸(Cys)殘基偶聯的方法。與二硫鍵無關的游離半胱氨酸對通過半胱氨酸特異性PEG綴合將PEG偶聯于所述蛋白質是必要的。在含有5個半胱氨酸的G-CSF中，在位置36和42 (基于天然G-CSF)處的半胱氨酸之間和在位置64和74 (基于天然G-CSF)處的半胱氨酸之間形成二硫鍵，而在位置17處的半胱氨酸是游離的半胱氨酸。位置36處的半胱氨酸與位置42處的半胱氨酸之間，和位置64處的半胱氨酸與位置74處的半胱氨酸之間兩個二硫鍵的形成，在構建天然G-CSF和維持G-CSF的生物活性中是至關重要的。由于用絲氨酸取代位置17處的半胱氨酸不嚴重影響G-CSF的生物活性，所以天然G-CSF的構型和G-CSF的生物活性不歸因于用絲氨酸取代位置17處的半胱氨酸(Winfield等Biochem. J.(生物化學雜志)256，1988，213)。然而，Piget等報告了位置17處的半胱氨酸可以按照反應條件形成分子間的二硫鍵或分子內的二硫鍵，由此阻礙重折疊并降低G-CSF的生物活性和穩定性(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.(美國國家科學院會刊)，83，1986，7643)。其間，還報告了用絲氨酸取代G-CSF位置17處的半胱氨酸幾乎不導致G-CSF中生物活性的變化(見韓國專利注冊號10-0114369)，其中所述半胱氨酸是G-CSF中僅存的游離半胱氨酸(Kyowa Hakko,東京，日本)。一種利用突變G-CSF開發的示范治療劑是由日本東京的Kyowa Hakko制造的 Neu-up (成分名稱納妥格拉斯丁(Nartograstim))。據說，該突變G-CSF表現出與天然 G-CSF相比明顯的高活性和更長的體內半衰期。然而，還沒有報告指出該突變G-CSF的臨床益處。可從Amgen，Inc. (Neulasta ,pegFilgrastim)商購 G-CSF 和 PEG 間的 N-末端特異性綴合的PEG化產物，其稱為PEG-G-CSF。Maxygen Inc.已經提議了開發突變G-CSF，以用于化學綴合(PCT/ DK2001/00011)。然而，按照被提議的公開物，沒有詳細描述突變G-CSF和由其生成的PEG-G-CSF的特征。所述突變體可以通過多種方式制備。就是說，按照突變位置的選擇，突變類型(插入，取代，缺失)，突變程度(1-2個殘基 片段)，及其組合，存在著幾千到幾萬種可能的突變體，并且對于各自情形，它們的生物性質和物化性質將會不同。顯然地，由該突變體所產生的化學綴合物將會不同。通常，制備用于形成化學鍵的突變體是基于它們結構的知識而設計的。按照 Osslund等(美國專利號5，581，476)，以可接近的殘基為基礎選擇結合位點，不受來自該化學結合干涉的結合位點選自這樣的結構，其中G-CSF分子與G-CSF受體連接，以限制目標突變體的數量，由此選擇實際上形成化學鍵的突變體。然而，本領域中的技術人員應該容易設想以所述方式中的結構知識選擇突變位置。在與突變有關的添加和插入的過程中，被添加和插入的殘基數量和突變的特征 (即，突變的殘基的類型)顯著地影響該突變體的生物活性。疏水性殘基和親水性殘基的互換，或大量殘基和少量殘基的互換，對該突變體的結構具有重要影響。本領域技術人員可以容易地推測該結構作用將導致G-CSF的生物活性和穩定性的顯著變化。特別地， 如Freeman ML等所設想的，將游離半胱氨酸誘導到G-CSF對蛋白質的穩定性發揮顯著白勺 乍用(Destabilization and denaturation of cellular protein by glutathione depletion (由谷胱甘肽缺失所引起的細胞蛋白的去穩定作用和變性)，Cell Stress Chaperones. 1997 Sep ；2 (3) 191-8)。發明公開內容技術問題 為了解決上述問題，本發明的目的是提供半胱氨酸誘導的人粒細胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突變體及其生物適合的綴合多肽，所述突變體通過將半胱氨酸誘導到 G-CSF的特異性位點，促進與生物適合的聚合物，如聚乙二醇(PEG)的特異性綴合，并由于與所述生物適合的聚合物的綴合，在不降低體內生物活性的同時增加其體內停留時間，從而最終提高其體內生物活性。技術方案現將更詳細描述按照本發明的G-CSF的突變體和其化學綴合物。在本發明中，由SEQ ID NO 1表示天然存在的G-CSF，由SEQ ID NO :2表示重組G-CSF(rG-CSF)。除非另外特別指出，用于本發明的術語G-CSF包括天然G-CSF和重組 G-CSF。為了實現本發明的目的，提供了人粒細胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突變體， 所述突變體包括SEQ ID NO :3中所確定的氨基酸序列，其中在包括SEQ ID NO :1中所確定的氨基酸序列的G-CSF的位置133處，蘇氨酸(Thr)殘基被半胱氨酸(Cys)殘基取代。另外，本發明提供G-CSF的突變體，其中G-CSF的位置133處的蘇氨酸(Thr)殘基被半胱氨酸(Cys)殘基取代，并且將非蛋白化學化合物修飾以適合該取代的Cys殘基，其中所述G-CSF包括SEQ ID NO=I中所確定的氨基酸序列。本發明還提供G-CSF綴合突變體，其包括SEQ ID NO :4中所確定的氨基酸序列，其中SEQ ID NO 4具有這樣的氨基酸序列，即在SEQ ID NO=I中所確定的G-CSF的位置133 處的蘇氨酸(Thr)殘基被半胱氨酸(Cys)殘基取代，且SEQ ID NO=I中位置17處的半胱氨酸(Cys)殘基被絲氨酸(Ser)取代，并且將非蛋白化學化合物進行修飾以適合在位置133處的取代的半胱氨酸殘基。所述非蛋白化學化合物是活化的生物適合的聚合物，其用于與位置133處的半胱氨酸的硫醇基化學綴合并且優選地，所述非蛋白化學化合物是選自由下列各項組成的組的一種的化合物聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸和聚乙烯吡咯烷酮，其與選自由下列各項組成的組的一種結合馬來酰亞胺，乙烯砜，碘乙酰胺(iodacetamide)和鄰吡啶基二硫化物(orthopyridyl disulfide)。更優選地，所述非蛋白化學化合物是PEG-馬來酰亞胺的生物適合聚合物。

另外，所述非蛋白化學化合物優選地具有在約2-約IOOkDa范圍內的分子量，更優選地，在約5-約IOOkDa范圍內的分子量。另一方面，提供人粒細胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突變體，所述突變體包括 SEQ ID NO :5中確定的氨基酸序列，其中在具有SEQ ID NO :1確定的氨基酸序列的G-CSF 的位置135處的甘氨酸(Gly)殘基和位置136處的丙氨酸(Ala)殘基之間插入半胱氨酸 (Cys)殘基。本發明還提供G-CSF的綴合突變體，其包括SEQ ID NO 5中確定的氨基酸序列，其中在具有SEQ ID NO 1中確定的氨基酸序列的G-CSF的位置135處的甘氨酸(Gly)殘基和位置136處的丙氨酸(Ala)殘基之間插入半胱氨酸(Cys)殘基，并且將非蛋白化學化合物進行修飾以適合所述插入的半胱氨酸殘基。本發明還提供G-CSF的綴合突變體，其包括SEQ ID NO 6中確定的氨基酸序列，其中在包含SEQ ID NO 1中確定的氨基酸序列的G-CSF的位置135處的甘氨酸(Gly)殘基和位置136處的丙氨酸(Ala)殘基之間插入半胱氨酸(Cys)殘基，并且位置17處的半胱氨酸殘基被絲氨酸(Ser)殘基取代，并且將非蛋白化學化合物進行修飾以適合在位置136處的插入的半胱氨酸(Cys)殘基。所述非蛋白化學化合物是活化的生物適合的聚合物，其用于與位置133處的半胱氨酸的硫醇基化學綴合，且優選地是選自由下列各項組成的組的一種的化合物聚乙二醇 (PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸和聚乙烯吡咯烷酮，其與選自由下列各項組成的組的一種結合馬來酰亞胺，乙烯砜，碘乙酰胺和鄰吡啶基二硫化物。更優選地，所述非蛋白化學化合物是PEG-馬來酰亞胺的生物適合聚合物。另外，所述非蛋白化學化合物優選地具有在約2-約IOOkDa范圍內的分子量，更優選地，在約5-約60kDa范圍內的分子量。用于本發明實踐的G-CSF突變體可以是從哺乳動物生物分離而來的形式，或備選地，是化學合成過程的產物，或通過基因組或cDNA克隆或通過DNA合成獲得的外源DNA序列的原核或真核宿主表達的產物。適合的原核生物宿主包括各種細菌(例如，大腸桿菌)； 適合的真核生物宿主包括酵母(例如，釀酒酵母(S. cerevisiae))和哺乳動物細胞(例如， 中國倉鼠卵巢細胞，猴子細胞)。取決于所使用的宿主，G-CSF表達產物可以是糖基化或非糖基化的。G-CSF表達產物還可以包括初始甲硫氨酸氨基酸殘基。G-CSF的突變體可以是從轉基因哺乳動物生物獲得的產物并可從母牛、綿羊、豬、兔、山羊及不同物種的哺乳動物的乳汁、血液或尿液中獲得。 為了使PEG連接于誘導的游離半胱氨酸，必須制備G-CSF的突變體，其在易于進行 PEG化并且甚至在PEG連接后仍維持其生物活性的位置具有誘導的游離半胱氨酸。為了實現這個目的，本發明的發明人通過取代或插入將游離半胱氨酸誘導到結構上柔性的CD環區域，并且使PEG綴合于該誘導的游離半胱氨酸，從而產生突變G-CSF。然后，他們篩選了在 PEG化 期間維持其生物活性和結構穩定性的PEG-G-CSF綴合物的突變體。在G_CSF(PDB ID, lbgc)的X_射線衍射結構中，認為所述⑶環區域是具有相當大柔性的，并且對G-CSF的總體結構不發揮嚴重影響。因此，本發明人制備了突變體，其在由 SEQ ID NO 2確定的rG-CSF的CD環(Gly126-Ser143)處具有誘導的半胱氨酸。如從數個X 射線晶體結構(PDB ID, lbgc)中所看到的，認為該CD環區域是結構上不清楚的柔性區域， 因此可以減弱(dampen)由PEG化所引起的結構改變。另外，本發明人可以預見CD環區域應該是聚合材料易于接近的區域，原因在于其具有充足的用于化學修飾的外部位點。此外， CD環區域具有無與受體重疊區域的受體結合結構，這有利于形成化學鍵。在所述方式中，本發明的發明人制備了突變體，其具有誘導到CD環區域(126-Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser-143 :SEQ ID N0:2)的半胱氨酸，然后在PEG化的過程中篩選PEG-G-CSF綴合物的突變體。由此得到的半胱氨酸誘導的突變體按照誘導位置表現出穩定性和PEG綴合表現中的顯著不同。一些突變體表現出在表達和純化效率上的高穩定性和高水平，但展現出較差的PEG綴合表現，這表示在周圍發生突變的微環境下不易于進行PEG綴合，其原因在于位阻現象或鄰近殘基的作用。另外，一些具有不穩定性的突變體非常難于表達和純化，從而導致在純化步驟中形成沉淀物。由半胱氨酸誘導的突變G-CSF的PEG綴合所預期的一個優點是PEG綴合的精確性。PEG與蛋白質的賴氨酸或N末端胺的綴合通過下列各項進行(a)PEG 二氯三嗪，(b)PEG 三氟乙基磺酸酯，(C)PEG碳酸琥珀酰亞胺酯，(d) PEG苯并三唑碳酸酯，(e) PEG對硝基苯基碳酸酯，(f)PEG三氯苯基碳酸酯，(g)PEG羰基咪唑，和(h)PEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯。上述 PEG綴合是非特異性的，且雙或更多等價物PEG與所述蛋白質的賴氨酸或N末端胺綴合。即使綴合相同的等價PEG，仍產生區域性異構體，其綴合于隨機的位置。然后，這些過程增加去除所生成的綴合物的時間和成本(M. J. Roberts等，Chemistry for peptide and protein PEG conjugation(多肽和蛋白質PEG綴合的化學)，Advanced Drug Delivery Reviews(高級藥物遞送綜述)54(2002)，459-476)。PEG綴合的另一個優點是隨意地選擇PEG連接位點。 PEG連接位點是廣泛的，其包括賴氨酸、天冬氨酸(Aspatate)、谷氨酸、α胺、羧基，等。因此，如果PEG連接位點在結構上是影響所述活性的重要部分，則PEG綴合可以顯著地降低所述活性。由這個觀點，通過半胱氨酸誘導的特異性PEG化應該有利地用于開發用于維持所述生物活性的PEG綴合物。由于游離的硫醇基是高反應性的，所以易于對其進行氧化(Rigo A等， Interaction of copper with cysteine :stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation ( f同與半φ^Μ 的t百互作用在厭氧條件下的硫醇氧化中的亞銅復合物的穩定性和二價銅離子的催化作用)， J Inorg Biochem. 2004，98 (9) ,1495-501)。然而，在一些情形中，游離硫醇殘基可以形成二硫鍵。為了引起化學修飾，誘導到蛋白質表面的游離硫醇基可以形成分子間的二硫鍵， 其導致二次沉淀或氧化，從而抑制化學修飾(Crow MK等，Protein aggregation mediated by cysteine oxidation during the stacking phase of discontinuous bufferSDS-PAGE(在不連續緩沖液SDS-PAGE的濃縮部分中，由半胱氨酸氧化介導的蛋白質的聚集)，Biotechniques (生物技術)2001，30 (2)，311-6)。當誘導的半胱氨酸殘基的位點向外暴露時，該不合需要的現象變得嚴重。因此，僅基于其結構知識對特異性化學修飾選擇半胱氨酸誘導位點會遇到嚴重的問題，例如由于游離半胱氨酸所導致的蛋白質的不穩定性 (Grzegorz Bulaj, Formation of disulfide bonds in proteins and peptides (在蛋白質和肽中形成二硫鍵)，Biotechnology Advances (生物技術進展)23 (2005) 87-92)。本發明中所制備的大多數半胱氨酸誘導的突變G-CSF顯示出低表達和純化效率。 為了解決具有游離半胱氨酸殘基的蛋白質的不穩定性問題，COX G. N.等使用了特別設計用于克服制備半胱氨酸誘導的突變體的不穩定性問題的方法，如WO 00/42175中所述。盡管這些嘗試的方法非常適合于減輕游離半胱氨酸誘導的突變體固有的不穩定性，但是它們非常難以應用于實際生產過程中。例如，如WO 00/42175中所述，蛋白質的細胞內表達有利于獲得半胱氨酸誘導的突變體的穩定性，然而，為了純化半胱氨酸誘導的突變體，應該將所述半胱氨酸誘導的突變體分泌到細胞外空間中。WO 00/42175中所述的發明的原理存在于通過保持氧化還原電勢水平常數來維持細胞外穩定性，其中所述氧化還原電勢水平常數的保持是通過利用氧化還原偶聯試劑等實現的。然而，很難在一段延長的時間內，特別是在純化步驟過程中，將氧化還原電勢保持在恒定的水平。然而，在本發明中，選擇性地制備了與常規的折疊和純化步驟相適合的半胱氨酸誘導的突變體，從而證實了按照本發明的半胱氨酸誘導的突變體即使具有游離的半胱氨酸殘基，仍維持其結構的穩定性。本發明所選擇的半胱氨酸誘導的突變G-CSF在大腸桿菌中作為內含體表達，并通過常規的重折疊技術轉化為有活性的突變G-CSF。常規重折疊技術是通過在尿素或胍(gimnidium)鹽中增溶內含體并通過稀釋或去除來移除該尿素或胍鹽，以提供生物活性來完成的。按照蛋白質中存在或缺乏二硫鍵，可將氧化還原偶聯試劑(谷胱甘肽(glutatione)或半胱氨酸的氧化或還原形式)加入到所述重折疊步驟中(Ronald W等，Disulphide bond formation in food protein aggregation and gelati0n( 二硫鍵在食物蛋白聚集和凝膠化中的形成)， Biotechnology Advances (生物技術發展)23 (2005) 75-80)。在本發明中，以下列方式進行了重折疊。即，半胱氨酸誘導的突變G-CSF的內含體在谷胱甘肽存在下，優選地溶解于6-8M 的尿素中，并稀釋在2-4M的尿素中，從而重折疊它們。用于綴合的PEG聚合物對分子量沒有特殊的限制，但是優選地具有在約 2kDa-100kDa范圍內的分子量，更優選地，在約10kDa-60kDa范圍中的分子量。本發明使用一種將PEG-馬來酰亞胺作為生物適合聚合物偶聯于半胱氨酸誘導的G-CSF的被誘導半胱氨酸_硫醇殘基的方法。就是說，G-CSF與20kDa或30kDa的PEG-馬來酰亞胺反應，從而制備20kDa或30kDa的PEG-G-CSF綴合物。在生物適合聚合物與半胱氨酸誘導的G-CSF的硫醇殘基的PEG綴合反應中，PEG 與G-CSF的摩爾比優選地在2 1-200 1的比率內，且反應溫度優選地在約0-約60°C的范圍內。該反應優選地在PH值約5. 0-約7. 7的范圍內進行 ，且反應時間優選地在約5分鐘-約24小時的范圍內。在進行了本發明所述方法中的PEG化后，利用SDS-PAGE分析確定PEG和突變 G-CSF間的綴合。為了從綴合反應物獲得單-PEG-G-CSF綴合物，利用陽離子交換層析分離單-PEG-G-CSF衍生物。對利用陽離子交換層析分離的衍生物進一步進行大小排阻層析，從而僅分離去除了微量未反應的G-CSF的單-PEG-G-CSF綴合物。 為了測量本發明的單-PEG-G-CSF衍生物的生物活性，使用了在多種文獻 (Baldwin 等，Acta Endocrinologica.，119 :326，1988 ；Clark 等，J. Biol. Chem.(生物化學雜志)，271 (36) :21969，1996 ；和 Bozzola 等，J. endocrinol. Invest.(內分泌學研究雜志)，21 :768，1998)中所描述的已知方法。這些測量結果顯示按照本發明的PEG-G-CSF綴合物在維持高水平的生物活性的同時具有增加的體內停留時間。據說N末端單PEG化的非格司亭具有非格司亭體外生物活性的68% (美國專利號 5，824，784)。相反地，每種按照本發明的PEG-G-CSF綴合物具有非格司亭體外生物活性的約2. 1-約3. 5倍(即，250 300% )。另外，每種按照本發明的PEG-G-CSF綴合物的體內半衰期是非格司亭的至少約5倍。此外，其在嗜中性粒細胞活化生物活性方面，優越于非格司亭。上述內容的原因推測如下。即，G-CSF的生物活性和穩定性不受選擇的被誘導的半胱氨酸的位置影響，且該選擇的位置是其中可以靈活減弱由于G-CSF的PEG化所引起的結構的改變的位置。有利作用如上所述，本發明可以提供半胱氨酸誘導的粒細胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突變體及其生物適合的綴合多肽，其中所述突變體通過將半胱氨酸誘導到G-CSF的特異性位點而促進與生物適合聚合物，如聚乙二醇(PEG)的特異性綴合，并由于與所述生物適合的聚合物的綴合，在不降低體內生物活性的同時增加其體內停留時間，從而最終提高其體內生物活性。另外，由于在考慮藥物動力學分布圖時，按照本發明的PEG-G-CSF綴合物具有比非格司亭更高的血漿穩定性，4. 2-5. 1倍更長的體內半衰期，由此維持了其活性并提高了治療作用。此外，所述嗜中性粒細胞在藥效學中的活化作用優越于非格司亭。附圖簡述

圖1是PEG-G-CSF綴合反應的示意圖；圖2顯示按照本發明的純化的G-CSF突變體和PEG綴合物的SDSPAGE (十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳)的結果；圖3顯示按照本發明的G-CSF-PEG綴合反應物的SDS PAGE分析結果；圖4顯示按照本發明的G-CSF-PEG綴合物的體內藥物動力學測量結果；和圖5是舉例說明藥物動力學測量結果的圖解表示，其用于比較G-CSF-PEG綴合物之間的嗜中性粒細胞活化作用的體內活性。實施本發明的最佳方式以下，本發明將參考下列實施例進行更詳細地描述。提供下列實施例進行舉例說明，而不限制本發明。「實施例 1-111 通過 SEQ ID NO 2 確定的 G-CSF 的 CD 環(Gly126-Ser143)中的氨基酸的半胱氨酸取代來制備綴合的突變G-CSFA.制備重組 G-CSF (rG~CSF)利用在本發明申請人的韓國專利號230579中所述的菌株(KFCC-10961)表達本發明使用的重組G-CSF(rG-CSF)。由此制備的，像非格司亭一樣來自大腸桿菌的重組G-CSF， 具有SEQ ID NO 2中確定的氨基酸序列。在這些實施例中，基于使用重組G-CSF作為G-CSF的事實，在SEQ ID NO :2中確定的氨基酸序列的基礎上，給所述制備的重組G-CSF指定氨基酸序列號。Β. M^mMm^mmm G-CSF 的突奪體 從韓國專利號230579中所述的G-CSF表達菌株(KFCC-10961)制備半胱氨酸誘導的突變G-CSF。在LB培養基中攪拌培養所述G-CSF表達菌株12小時，然后利用由Quiagen， Inc制造的質粒制備試劑盒分離G-CSF表達載體(pGW2)。利用含有列于表1中的半胱氨酸誘導的基因的互補突變引物(具有長度為30-40堿基對的互補多核苷酸雙鏈)，對作為模板的分離的G-CSF表達載體(pGW2)，進行聚合酶鏈式反應(PCR)。然后用DPm酶處理由用PCR克隆生成的G-CSF表達載體，以去除模板，然后將其轉化到銣處理的MC1061大腸桿菌中。在氨芐青霉素培養基中培養該轉化宿主，從而篩選轉化體菌株。按照使用指導， 分別利用pfuTurbo DNA聚合酶和DPm酶進行了用于去除突變和模板的PCR酶處理，所述 PfuTurbo DNA聚合酶和DPm酶可以由位點定向誘變試劑盒(QuikChang位點定向誘變試劑盒，Stratagen，Inc.)獲得。通過利用引物(5' -GCGGATCCTGCCTGA-3‘)的 PCR 的堿基測序的分析證實了突變。C.半胱氨酸誘導的突變G-CSF的表汰在各自補充了 5 μ g/ml氨芐青霉素的5ml LB培養基中培養半胱氨酸誘導的突變 G-CSF 12小時，然后轉移到補充了 5 μ g/ml氨芐青霉素的500ml LB培養基中攪拌培養。當所述菌株的光密度(OD)達到0. 5時，將最終濃度為(w/v)的阿拉伯糖加入到各個培養基中，并攪拌培養約7小時，從而過表達該半胱氨酸誘導的突變G-CSF。P.半胱氨酸誘導的突變G-CSF的重折疊對過表達半胱氨酸誘導的突變G-CSF的菌株進行離心，從而使其懸浮于20mM的 Tris和150mM的NaCl中，并利用超聲波儀破裂所述懸浮的菌株。離心該破裂的菌株，并用 2% (w/v)脫氧膽酸鈉洗滌，從而回收內含體。將半胱氨酸誘導的突變體的內含體溶解于7M 的尿素，20mM 的 Tris, ^P IOOmM 的 NaCl，pH8. 8 中，并在 3. 3M 的尿素，5mM 的 Tris, 2mM 的還原的谷胱甘肽和0. 2M的氧化的谷胱甘肽，pH8. 8中稀釋10倍。在4°C，隨著攪拌進行重折疊步驟18小時。E-1.制備PEG化的半胱氨酸誘導的突變G-CSF用HCl滴定作為重折疊樣品的半胱氨酸誘導的突變G-CSF達到pH4. 5后，利用離心移除由此生成的沉淀。為了純化具有活性的半胱氨酸誘導的突變G-CSFJf 20mM磷酸鈉注射到在PH4. 0平衡的SP-瓊脂糖凝膠快流柱中，用平衡緩沖液進行洗滌，用鹽濃度梯度 100 5000mM的NaCl進行洗脫。調節該洗脫的半胱氨酸誘導的突變G-CSF樣品的pH值為6. 8，并將具有平均分子量約20kDa或約30kDa的甲氧基-PEG-馬來酰亞胺(Shearwater，Inc, U. S. Α)加入到由此產生的溶液中，由此，半胱氨酸誘導的突變G-CSF 甲氧基-PEG-馬來酰亞胺的摩爾比為 1 2。然后，在4°C，隨著緩慢攪拌，容許反應發生約18小時。E-2.制備乙烯砜-PEG化的半胱氨酸誘導的突變G-CSF在將用如E-I部分中所述相同方法分離的半胱氨酸誘導的突變G-CSF的SP-瓊脂糖凝膠流出液樣品的PH值調節為7. 5后，將具有平均分子量約20kDa的甲氧基-PEG-乙烯砜加入到產生的溶液中，由此，半胱氨酸誘導的突變G-CSF 甲氧基-PEG-馬來酰亞胺的摩爾比為1 5。然后，在4°C，隨著緩慢攪拌，容許反應發生約18小時。
E-3.制各碘乙酰胺-PEG化的半胱氡酸i秀導的突奪G_CSF在將用與E-I部分中所述相同方法分離的半胱氨酸誘導的突變G-CSF的SP-瓊脂糖凝膠流出物樣品的PH值調節為7. 0后，將具有平均分子量約20kDa的甲氧基-PEG-碘乙酰胺加入到產生的溶液中，由此，半胱氨酸誘導的突變G-CSF 甲氧基-PEG-碘乙酰胺的摩爾比為1 2。然后，在4°C，在暗室中，隨著緩慢攪拌，容許反應發生約48小時。 F.分離單-PEG-G-CSF衍牛物融合體在將制備的PEG化的半胱氨酸誘導的突變G-CSF的pH值調節為4. 0后，在緩沖溶液(20mM Na2HPO4 —價堿，pH 4.8)中將由此產生的產物稀釋3倍，并將其注射到利用與所述緩沖液相同的平衡緩沖液，即含有20mMNa2HP04 —價堿的pH4. 8的平衡緩沖液，平衡的 SP-瓊脂糖凝膠快流柱中。然后用緩沖溶液(20mM Na2HPO4 —價堿，50mM NaCl, pH 4.8)洗滌由此產生的產物，并再用鹽濃度梯度50-500mM的NaCl進行洗脫。為了從半胱氨酸誘導的突變G-CSF中移除未反應的G-CSF，對PEG化的半胱氨酸誘導的突變G-CSF進行了大小排阻層析，其中所述PEG化的半胱氨酸誘導的突變G-CSF是從SP-瓊脂糖凝膠柱中洗脫出來的。濃縮SP-瓊脂糖凝膠流出物，并將其注射到經過緩沖溶液(20mM Na2HPO4 —價堿，IOOmM NaCl (pH4. 0))平衡的 Superdex 200(2.5 X 50cm, Pharmacia)中，并用相同的緩沖溶液以 lml/min的洗脫速率進行洗脫。利用SDS-PAGE分析確定該分離的PEG化半胱氨酸誘導的突變G-CSF的純度。表1顯示實施例1-11中所制備的每種PEG化的半胱氨酸誘導的突變體的回收率和綴合表現，以百分位數(％ )表示表 權利要求
1.人粒細胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突變體，所述突變體包括SEQID NO :5中包括的氨基酸序列，其中半胱氨酸(Cys)殘基被插入到包含于SEQ ID NO 1的G-CSF的位置 135處的甘氨酸(Gly)殘基和位置136處的丙氨酸(Ala)殘基之間。
2.人粒細胞集落形成刺激因子(G-CSF)的綴合突變體，所述突變體包括SEQID NO 5 中包括的氨基酸序列，其中半胱氨酸(Cys)殘基被插入到包含在SEQ ID NO=I中包含的氨基酸序列的G-CSF的位置135處的甘氨酸(Gly)殘基和位置136處的丙氨酸(Ala)殘基之間，且將非蛋白化學化合物連接于所插入的半胱氨酸殘基。
3.權利要求2的綴合突變體，其中所述突變體是蛋白質，其包括SEQIDNO :6中包括的氨基酸序列，所述氨基酸序列的位置17處的半胱氨酸殘基被絲氨酸(kr)殘基取代。
4.權利要求2或3的綴合突變體，其中所述非蛋白化學化合物是選自包括下列各項的組中的一種的化合物聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸和聚乙烯吡咯烷酮，其與選自包括下列各項的組的一種結合馬來酰亞胺，乙烯砜，碘乙酰胺和鄰吡啶基二硫化物。
5.權利要求2或3的綴合突變體，其中所述非蛋白化學化合物具有在約2-約IOOkDa 范圍內的分子量。
6.權利要求4的綴合突變體，其中所述PEG具有在約5-約IOOkDa范圍內的分子量。
全文摘要
本發明提供設計用于特異性化學綴合的人粒細胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突變體及其化學綴合物，其作為佐劑在癌癥治療中使用。本發明提供G-CSF的突變體，其中G-CSF位置133處的蘇氨酸(Thr)殘基被半胱氨酸(Cys)殘基取代，其中所述G-CSF包括SEQ ID NO1中所確定的氨基酸序列。另外，本發明提供G-CSF的突變體，其中半胱氨酸(Cys)殘基被插入到G-CSF的位置135處的甘氨酸(Gly)殘基和位置136處的丙氨酸(Ala)殘基之間。進一步，本發明提供化學綴合的突變G-CSF，在其半胱氨酸殘基處連接了生物適合聚合物，如聚乙二醇(PEG)，所述半胱氨酸殘基是通過取代或插入突變引入的，其由于與生物適合聚合物的綴合，在不降低體內生物活性的同時增加其體內停留時間，從而最終提高其體內生物活性。
文檔編號C07K14/535GK102153643SQ20101060591
公開日2011年8月17日 申請日期2006年7月19日 優先權日2005年7月20日
發明者康官燁, 洪晶云 申請人:牧巖生命工學研究所