專利名稱：高效表達的豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因及其表達蛋白的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術中基因表達領域，特別涉及一種高效表達的豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因，還涉及其表達蛋白的用途。
背景技術：
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗稱〃豬藍耳病〃，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起,病毒感染后可以導致母豬流產、返情、產死胎或弱仔、仔豬死亡及各種年齡的豬不同程度的呼吸道癥狀，并且能破壞豬的免疫系統，引起混合感染或繼發感染。我國于1995年底爆發此病，并迅速蔓延到全國多個省份。在許多規模化豬場，PRRS陽性率很高，有的可達80%以上。自2006年以來，我國部分地區豬場發生了由PRRSV變異株導致的高致病性藍耳病。該病在臨床上以發病豬高熱、呼吸困難、皮膚發紅為主要特征，具有更高的發病率和死亡率，給我國的養豬業造成了極為嚴重的經濟損失。該病目前有滅活苗使用，但是免疫效果不盡理想。粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)是由活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、內皮細胞、成纖維細胞等在某些抗原和細胞因子刺激下產生，可刺激造血細胞的增殖和分化、促進粒細胞和單核/巨噬細胞形成集落，增強其功能的一類細胞因子。GMCSF具有的生物學活性有:誘導造血前體細胞分化增殖，維持造血前體細胞和成熟血細胞的存活；增強中性粒細胞和巨噬細胞·的吞噬和殺傷功能；誘導樹突狀細胞成熟，并向疫苗注射部位集聚，使其具有明顯的增強疫苗免疫反應的作用。因此它在疾病的治療、預防及作為疫苗佐劑方面具有廣泛的應用前景。Inumaru 和 Takamatsu 在 1995 年首先克隆了 pGMCSF 基因，Inumaru 等在 1998 年用桿狀病毒表達了具有生物學活性的PGMCSF，隨后國內外學者用大腸桿菌原核表達載體、質粒真核表達載體、腺病毒等表達了 PGMCSF，對其生物學活性進行了大量研究。本課題組也曾將pGMCSF克隆入真核表達載體pVAXl°，轉染HEK-293A細胞后pGMCSF的表達量和活性較低。
發明內容
為了解決以上粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)表達量和活性低的問題，本發明提供了一種能夠高效表達的豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因。本發明還提供了所述豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因表達蛋白在高效增強高致病性PRRSV滅活疫苗體液免疫和細胞免疫應答中的用途。本發明是通過以下措施實現的:
一種聞效表達的豬粒細胞巨曬細胞集落刺激因子基因，其核昔酸序列如序列表中序列2所示。
一種序列2的基因通過分子生物學技術克隆至真核表達載體獲得的重組質粒。一種所述的豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因的合成方法，包括以下步驟
1、將真核質粒pVAXf改造為pMVAX廣:
由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882,在上游引入AiI酶切位點和pCMV即刻早期啟動子的一段序列，在下游引入T7啟動子序列和&oRI酶切位點，人工拼接后的核苷酸序列如序列表中序列I所示,將此段基因序列通過5^1/^boRI酶切位點插入pVAXf載體中，轉化感受態細菌，提取質粒經篩選得到SstV雙酶切陽性克隆，命名為PMVAXle ；
所述 pCMV 即刻早期啟動子的一段序列為:5’ -GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3，,
所述 17 啟動子序列為:5’ -AATACGACTCACTATAGGG-3’ ；
2、構建表達pGMCSF的重組真核質粒pMVAXl°-pGMCSF:
2.1設計一對擴增pGMCSF蛋白的基因序列的特異性引物，引物序列如下: pGMCSF-Fwd:5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGCTCCCACCCGCCCA-3’， pGMCSF-Rev:5’ -GAGCTCGAGAAGCTTACTTTTTGACTGGCCCC-3’，
在上游引物pGMCSF-Fwd的5’端引入&oRI限制性內切酶位點和Kozak序列，在下游引物pGMCSF-Rev的5’端引入通ol限制性內切酶位點；
2.2從豬的脾淋巴細胞提取RNA，經反轉錄后得到cDNA，采用RT-PCR技術擴增出pGMCSF蛋白基因的PCR產物；
2.3用feoRI/ZAoI雙酶切pMVAXl°，膠回收得包含序列I的載體基因片段1，pGMCSF蛋白基因的PCR產物經feoRI/ZAoI雙酶切并膠回收得到編碼pGMCSF蛋白的基因片段2，將載體基因片段I和基因片段2連接，轉化感受態細菌，培養，挑取菌落于卡那霉素抗性的培養基中培養，提取質粒，進行雙酶切鑒定，篩選出陽性克隆，得pMVAXl°-pGMCSF，在真核質粒pVAXl°中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示，插入過程示意圖如圖1所示。步驟2.2 中 PCR 反應體系為 25μ ，含 cDNA lPL，Mg2+ 1.5mmol/L,dNTP 200Mmol/L,IOXLA PCR Buffer 2.5μ ，pGMCSF-Fwd和 pGMCSF-Rev 濃度均為 400nmol/L，TaKaRa LA Taq2U;反應條件為:預變性95° C 5min，然后進行35個循環，循環條件為95° C45s，60° C45s, 72° C 45s ;然后72° C延伸lOmin，取出產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。一 種所述的豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因的表達蛋白在增強高致病性PRRSV滅活疫苗體液免疫和細胞免疫應答中的應用。本發明的有益效果是:
(1)含有序列表中序列2的真核質粒pMVAXl°-pGMCSF表達pGMCSF蛋白基因，突破了通過pVAXl°載體表達pGMCSF過程中遇到的表達量較低和活性較差的局限性，表達量提高了6.6 倍;
(2)豬體試驗證明，序列表中序列2基因的表達蛋白pGMCSF表達活性很高，能夠顯著增強高致病性PRRSV滅活疫苗的體液免疫和細胞免疫應答，專用于對高致病性PRRSV引起的疾病的預防及減少豬場的經濟損失。
圖1為本發明將真核質粒pVAXl°改造為pMVAXl°及克隆pGMCSF蛋白基因入pMVAXl°的不意 圖2為本發明重組質粒pMVAXfAiIzfe0RI雙酶切鑒定圖譜，其中 M 為 DL2, OOO DNA Marker,
I為重組陽性質粒ρΜνΑΧΓ的5^1/^boRI雙酶切結果；
圖3為本發明重組質粒pMVAXl°-pGMCSF的&0RI/ZA0I雙酶切鑒定圖譜，其中 M 為 DL2, 000 DNA Marker,
I和2為兩個不同重組陽性質粒pMVAXr-pGMCSF的&0RI/ZA0I雙酶切結果；
圖4為本發明重組質粒pMVAXf-pGMCSF表達的pGMCSF的Western_blot檢測，其中 泳道I為空載體質粒PVAXf轉染HEK-293A后Western-blot檢測條帶，
泳道2為改造的空載體質粒pMVAXf轉染HEK-293A后Western-blot檢測條帶，
泳道 3 為 pVAXf-pGMCSF 轉染 HEK-293A 后 Western-blot 檢測條帶，
泳道 4 為 pMVAXf-pGMCSF 轉染 HEK-293A 后 Western-blot 檢測條帶；
圖5為通過骨髓細胞增殖試驗測定的重組質粒pMVAXl°-pGMCSF表達的pGMCSF生物學活性；
圖6為重組質粒pMVAXl°-pGMCSF表達的pGMCSF對PRRSV滅活疫苗中和抗體的增強作
用；
圖7為通過外周血淋巴細 胞增殖試驗測定的重組質粒pMVAXf-pGMCSF表達的pGMCSF對PRRSV滅活疫苗細胞免疫的增強作用。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明的豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因進行進一步說明。.將真核質粒ρνΑΧΓ改造為PMVAXle 1.1插入基因的人工合成
參考GenBank公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列(GenBank No: V00882),在上游引入AiI酶切位點和pCMV即刻早期啟動子的一段序列，在下游引入Τ7啟動子序列和&0RI酶切位點，將這段基因序列拼接在一起交由TaKaRa公司人工合成，具體編碼的包含Rabbit β -Globin Intron II基因的核苷酸序列見序列表中序列I,并克隆入T載體。所述pCMV 即刻早期啟動子的一段序列為 5’ -GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3，,
所述 Π 啟動子序列為 5’ -AATACGACTCACTATAGGG-3’ ；
1.2 pMVAXf的構建及鑒定
從T載體上5^1/^boRI雙酶切目的基因并膠回收，與同樣經過5^1/^boRI雙酶切的真核質粒pVAXl°并膠回收的載體片段在16° C過夜連接，轉化DH5a感受態細菌，37° C過夜培養16h。挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培養基中37° C過夜振蕩培養，第二天提取質粒，進行5^1/^boRI雙酶切鑒定，鑒定為陽性的質粒命名為pMVAXf，見圖2，交由TaKaRa公司測序，插入的基因片段序列與序列表中序列I相吻合。.pGMCSF蛋白的基因克隆入PMVAXle2.1引物的設計及合成
根據GenBank公布的pGMCSF的基因序列(GenBank n0.NM_213861),設計一對擴增pGMCSF蛋白的基因序列的特異性引物，在上游引物pGMCSF-Fwd的5’端引入&0RI限制性內切酶位點和Kozak序列，在下游引物pGMCSF-Rev的5’端引入通ol限制性內切酶位點，引物序列如下:
pGMCSF-Fwd:5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGCTCCCACCCGCCCA-3’，pGMCSF-Rev:5’ -GAGCTCGAGAAGCTTACTTTTTGACTGGCCCC-3’，
兩條引物pGMCSF-Fwd和pGMCSF-Rev橫跨pGMCSF蛋白編碼區，預計擴增片段長度為418bp,引物由TaKaRa公司合成。2.2豬脾淋巴細胞的分離培養、誘導及總RNA的提取
無菌采集約克豬的脾，用淋巴細胞分離液分離脾淋巴細胞，用10%胎牛血清的1640液在37° C、含CO2 5v%的培養箱中培養lh，然后加入50(^g/mL的植物血凝素(PHA)刺激12h后，用TRIzoI試劑提取總RNA，作為RT-PCR的模板。2.3 RT-PCR 擴增
以RNA經反轉錄酶01 igo d (T)反轉錄得到的cDNA為模板，pGMCSF-Fwd和pGMCSF-Rev為引物進行 PCR擴增，PCR 反應體系為 25μ ，含 cDNA lPL，Mg2+ 1.5mmol/L,dNTP 200Mmol/L,IOXLA PCR Buffer 2.5μ , pGMCSF-Fwd 和 pGMCSF-Rev 的濃度均為 400nmol/L，TaKaRa LATaq 2U。反應條件為:預變性95° C 5min ;然后進行35個循環，循環條件為95° C 45s,60° C 45s, 72° C 45s;然后72° C延伸lOmin，取出產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收獲得PGMCSF蛋白基因的PCR產物。2.4重組真核表達質粒的構建及鑒定
用feoRI/ZAoI雙酶切pMVAXl°，膠回收得到包含序列I的載體基因片段1，pGMCSF的蛋白基因的PCR產物經feoRI/ZAoI雙酶切并膠回收得到編碼pGMCSF蛋白的基因片段2，將載體基因片段I和基因片段2連接，轉化DH5a感受態細菌，37° C過夜培養16h。挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培養基中37° C過夜振蕩培養，第二天提取質粒，進行feoRI/ZAoI雙酶切鑒定。鑒定為陽性的質粒pMVAXl°-pGMCSF交由TaKaRa公司測序，酶切鑒定結果如圖3所示。構建過程示意圖如圖1所示。用Vector NTI和DNAStar軟件分析所插入的基因序列和推導氨基酸序列，相比較于真核質粒pVAXl°，pMVAXl°-pGMCSF中插入的核苷酸序列如序列表中序列2所示，推導氨基酸序列如序列表中序列3所示。 重組真核質粒pMVAXl°-pGMCSF的表達鑒定
3.1重組質粒pMVAXf-pGMCSF轉染人胚腎上皮細胞HEK-293A
實驗組:具體操作按Lipofectamine 2000 (Invitrogen)說明書進行。轉染在6孔細胞板上進行，在轉染的前一天，消化HEK-293A細胞，用10%的胎牛血清DMEM(不含抗生素)稀釋細胞，使其密度達到2.5 X IO5個細胞/mL，在6孔細胞板上每孔接種2.5mL,于37° C、含C025v%的培養箱中培養。在滅菌的1.5mL的離心管中先加入500μ 37° C預熱的OPT1-MEM無血清培養基，然后加入1.θμδ的重組質粒pMVAXf-pGMCSF，輕輕混勻；在另一個滅菌的
1.5mL的離心管中先加入500μ 37° C預熱的OPT1-MEM無血清培養基，然后加入2.5μ Lipofectamine 2000轉染試劑,輕輕混勻,在 室溫放置5min ;然后將兩個1.5mL的離心管中的液體混勻在一起，室溫放置20min ;從CO2培養箱中取出細胞板，棄去上清，把液體混合物輕輕加入到細胞面上，然后立即把細胞板放入CO2培養箱中；溫育6h后，吸掉上清，輕輕加入2.0mL 37° C預熱的10%的胎牛血清DMEM，放入CO2培養箱繼續培養24h，然后反復凍融細胞轉染物2次，12000rpm離心5min，得到凍融裂解上清，待檢。對照組1:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為空載體質粒pVAXl°，其余方法同實驗組一致，作為對照。對照組2:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為改造的空載體質粒pMVAXl°，其余方法同實驗組一致，作為對照。對照組3:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為pVAXl°-pGMCSF，其余方法同實驗組一致，作為對照。所述pVAXl°-pGMCSF為在真核質粒載體pVAXl°中只插入pGMCSF基因，而不插入Rabbit β -Globin Intron II 基因。3.2 重組質粒 pMVAXf-pGMCSF 表達的 pGMCSF 的 Western-blot 檢測
參照Bio-Rad公司半干轉印儀操作說明進行電轉印，然后進行免疫檢測。將麗春紅染色后的NC膜轉移至封閉液中，室溫輕搖Ih后4° C封閉過夜；傾去封閉液，用洗滌液TBST洗膜5次,每次5 min,然后加入pGMCSF單克隆抗體(R&D Systems公司),室溫下振蕩Ih ;再用TBST洗膜5次，每次5min，然后加入以封閉液1:5000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP，室溫振蕩Ih ;再用TBST洗膜5次,每次5min,最后用化學發光顯色試劑盒(Supersignal WestPico Trial Kit)進行顯色，在X膠片上曝光、顯影和定影觀察。試驗同時設立β-actin對照，一抗為β-actin單克隆抗體(Santa Cruz公司)，二抗為1:5000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP。
經檢測，pGMCSF得到了正確的表達，分子量約25kD。pMVAXf-pGMCSF表達的 pGMCSF 明顯高于 pVAXf-pGMCSF。經過 Bio-Rad ChemiDoc XRS System 分析，pMVAXl°-pGMCSF 表達的 pGMCSF 的量是 pVAXl°-pGMCSF 的 7.6 倍(提高了 6.6 倍)。對照組 I和對照組2均無表達。如圖4所示。3.3重組質粒pMVAXf-pGMCSF表達的pGMCSF生物學活性檢測
參考Maliszewski等方法，采用骨髓細胞增殖試驗測定GMCSF的活性。步驟如下:
無菌取出豬股骨，將其用高壓滅菌的手術骨鉗橫斷，用滅菌鑷子從橫斷面插入，使之形成較大空隙，然后將滅菌的PBS (雙蒸水配制)加入空隙中，反復吹打，使骨髓細胞均勻分布在PBS中；將骨髓細胞懸液置于IOmL的滅菌離心管中，1500 2000rpm離心5 IOmin ;吸去上清液，沉淀經PBS重懸后，用紅細胞裂解液裂解15 30min，以1500 2000rpm離心5 lOmin，沉淀即得所需的骨髓細胞；
細胞計數，用DMEM完全培養基調節細胞密度至7.5 X IO5個/mL ;鋪板，將細胞懸液加到96孔細胞板中，IOOPL/孔；加入10倍比稀釋的ΗΕΚ-293Α細胞凍融裂解上清，100 /孔，每個稀釋度重復3個孔；37° C下培養7d,然后用MTT法測定細胞的增殖程度，測定OD57tol的值，計算刺激指數SI = HEK-293A細胞凍融裂解上清的刺激孔的OD值/只含DMEM完全培養基的未刺激孔的OD值。使用上述步驟3.1中得到的上清稀釋后分別進行檢測，結果見圖5。從圖中可以看出pMVAXl°-pGMCSF表達的pGMCSF具有很高的生物學活性，1:25稀釋時濃度太高具有副作用，1:200稀釋時活性最高，隨著稀釋度的提高呈劑量依賴性，刺激骨髓細胞增殖的最小劑量為1:1600稀釋；而pVAXl°-pGMCSF表達的pGMCSF刺激骨髓細胞增殖的最小劑量為1:200稀釋。 重組真核質粒表達的pGMCSF對高致病性PRRSV滅活疫苗免疫應答的增強作用
4.1豬體實驗分組
選取3周齡的健康仔豬(豬藍耳病病毒、豬圓環病毒2型、豬細小病毒、豬偽狂犬病毒和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌等均為抗原陰性和抗體陰性)50頭，每組5頭。實驗組:將pMVAXf-pGMCSF 500ug/頭與高致病性PRRSV滅活疫苗(SD-JN株，由本實驗室自行制備，制備方法同高致病性豬藍耳病滅活苗NVDC-JXAl株)I頭份合用免疫3周齡的健康仔豬，頸部肌肉注射。一免后28天，以相同的劑量方法加強免疫一次。于一免后28天(二免前)、一免后42、56天分別采血測定中和抗體；一免后42、56天分別采集肝素抗凝血，用PRRSV SD-J N株濃縮抗原進行刺激，MTT法測定外周血淋巴細胞增殖活性。對照組1:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為pVAXl°-pGMCSF，其余方法同實驗組—致。對照組2:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為PBS，其余方法同實驗組一致。對照組3:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為空載體質粒pVAXl°，其余方法同實驗
組一致。對照組4:將實驗組的pMVAXl°-pGMCSF替換為改造的空載體質粒pMVAXl°，其余方
法同實驗組一致。對照組5:僅注射PBS，不注射滅活苗。對照組6:僅按照500ug/頭的劑量注射空載體質粒pVAXl°，不注射滅活苗。對照組7:僅按照500ug/頭的劑量注射空載體質粒pMVAXl°，不注射滅活苗。對照組8:僅按照500ug/頭的劑量注射pVAXl°-pGMCSF，不注射滅活苗。對照組9:僅按照500ug/頭的劑量注射pMVAXl°-pGMCSF，不注射滅活苗。4.2體液免疫反應檢測
如圖6，經檢測，一免后42、56天實驗組的中和抗體顯著高于對照組1，平均中和抗體在一免后42天實驗組為1:16，對照組I為1:9 ;在一免后56天實驗組為1:26，對照組I為1:13 ;對照組2-4產生的中和抗體很低，為滅活疫苗產生的中和抗體，一免后42天為1:4，一免后56天為1:8，對照組5-9無中和抗體產生。4.3細胞免疫反應檢測
如圖7，經檢測，一免后42、56天實驗組的PRRSV特異性的外周血淋巴細胞增殖活性顯著高于對照組1，而對照組I也顯著高于對照組2-9。
權利要求
1.一種聞效表達的豬粒細胞巨曬細胞集落刺激因子基因，其核昔酸序列如序列表中序列2所示。
2.—種權利要求1所述序列2的基因通過分子生物學技術克隆至真核表達載體獲得的重組質粒。
3.—種權利要求1所述的豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因的合成方法，其特征是包括以下步驟: (1)將真核質粒pVAXf改造為pMVAX廣:由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882,在上游引入AiI酶切位點和pCMV即刻早期啟動子的一段序列，在下游引入T7啟動子序列和&oRI酶切位點，人工拼接后的核苷酸序列如序列表中序列I所示,將此段基因序列通過5^1/^boRI酶切位點插入pVAXf載體中，轉化感受態細菌，提取質粒經篩選得到SstV雙酶切陽性克隆，命名為PMVAXle ； 所述 pCMV 即刻早期啟動子的一段序列為:5’ -GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3，, 所述 17 啟動子序列為:5’ -AATACGACTCACTATAGGG-3’ ； (2)構建表達pGMCSF的重組真核質粒pMVAXl°-pGMCSF: ①設計一對擴增PGMCSF基因 序列的特異性引物，引物序列如下:pGMCSF-Fwd:5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGCTCCCACCCGCCCA-3’，pGMCSF-Rev:5’ -GAGCTCGAGAAGCTTACTTTTTGACTGGCCCC-3’， 在上游引物pGMCSF-Fwd的5’端引入&oRI限制性內切酶位點和Kozak序列，在下游引物pGMCSF-Rev的5’端引入通ol限制性內切酶位點； ②從豬的脾臟提取RNA，經反轉錄后得到cDNA，采用RT-PCR技術擴增出pGMCSF基因的PCR產物； ③用feoRI/ZAoI雙酶切pMVAXl°，膠回收得包含序列I的載體基因片段l，pGMCSF基因的PCR產物經feoRI/ZAoI雙酶切并膠回收得到編碼pGMCSF蛋白的基因片段2，將載體基因片段I和基因片段2連接，轉化感受態細菌，培養，挑取菌落于卡那霉素抗性的培養基中培養，提取質粒，進行/ZAoI雙酶切鑒定，篩選出陽性克隆，得pMVAXl°-pGMCSF，真核質粒PVAXl0中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。
4.根據權利要求3所述的合成方法，其特征在于步驟②中PCR反應體系為25μ ，含cDNA μ , Mg2+ 1.5mmol/L, dNTP 200Mmol/L，10X LA PCR Buffer 2.5μ ，pGMCSF-Fwd和pGMCSF-Rev 濃度均為 400nmoI/L，TaKaRa LA Taq 2U ;反應條件為:預變性 95。C 5min，然后進行35個循環，循環條件為95° C 45s，60° C 45s, 72° C 45s;然后72° C延伸lOmin，取出產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。
5.一種權利要求1所述的豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因的表達蛋白在增強高致病性PRRSV滅活疫苗體液免疫和細胞免疫應答中的應用。
全文摘要
本發明涉及生物技術中基因表達領域，特別涉及一種高效表達的豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因，如序列表中序列2所示，還涉及豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因表達蛋白在增強高致病性PRRSV滅活疫苗體液免疫和細胞免疫應答中的應用。含有序列表中序列2的真核質粒pMVAX1 表達pGMCSF蛋白基因，突破了通過pVAX1 載體表達pGMCSF過程中遇到的表達量較低和活性較差的局限性，表達量提高了6.6倍；豬體試驗證明，序列表中序列2基因的表達蛋白pGMCSF表達活性很高，能夠顯著增強高致病性PRRSV滅活疫苗的體液免疫和細胞免疫應答，專用于對高致病性PRRSV引起的疾病的預防及減少豬場的經濟損失。
文檔編號A61P31/14GK103194455SQ20131011903
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月8日 優先權日2013年4月8日
發明者杜以軍, 齊靜, 王金寶, 吳家強, 黃保華, 郭立輝, 陳蕾, 叢曉燕, 孫文博, 任素芳, 李俊, 時建立, 呂偉 申請人:山東省農業科學院畜牧獸醫研究所