專利名稱：重組人g-csf二聚體及其在治療神經系統疾病中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物學和醫學技術領域，特別地，本發明涉及一種新的人G-CSF 二聚體及其在治療伴隨神經損傷的疾病中的用途。
背景技術：
人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是一種含有204個氨基酸和30個氨基酸信號肽的糖蛋白。成熟的G-CSF蛋白分子量為18-20kDa，由174個氨基酸構成，不含信號肽，并被分泌到細胞外。主要負責這類分泌的人類細胞為單核細胞、成纖維細胞、和內皮細胞。G-CSF主要具有三大生物學功能，即I.作用于骨髓前體細胞和干細胞，從而驅動嗜中性粒細胞的分化、發育和成熟；2.激活成熟的嗜中性粒細胞，參與免疫反應；和3.作用于其他造血生長因子，如干細胞因子、Flt-3配體、和GM-CSF，從而動員造血干細胞。G-CSF受體(G-CSFR)已證實存在于骨髓造血干細胞Sca+LirTThllm、前體細胞0)34+、以及定向分化的嗜中性粒前體細胞(committed granulocyteprecursor)、和成熟的嗜中性粒細胞。G-CSFR是一種對G-CSF有高親合力的特異性受體，具有812個氨基酸。Tamada等人獲得了 G-CSF: G-CSFR復合物的晶體結構，2. 8埃衍射分析(PNAS，2008,Vol. 103:3135-3140)顯示G-CSF:G_CSFR復合物是以2 2比例存在。換言之，每個復合物中，每一個G-CSF結合于一個受體鏈，從而形成G-CSF-受體復合物，當兩個G-CSF-受體復合物相互靠近，相互作用形成2:2 二聚體。在這種情況下，G-CSF受體的羧基端才能激活下游的信號分子JAK2 (Janus tyrosinekinase，主要是JAK2)。因此，JAK2激活STAT3，從而啟動對嗜中性粒細胞分化、增殖和激活至關重要的基因的轉錄。2003年，Schabitz W. R等報道，重組人G-CSF (rhG-CSF)對神經細胞在缺血性動物模型中具有保護功能(Stroke，2003, 34:745-751)。2006年后期，Shyu等報道，連續5天每天給病人施用重組人G-CSF，表明，rhG-CSF在急性中風病人的治療中具有臨床效果(CMAJ，2006,174:927-933)。皮下給藥，鼠G-CSF在體內的半衰期約2小時，而人G-CSF的皮下給藥半衰期只有3. 5小時，因此，需要給需要的病人每天施用，或靜脈注射藥物，這會影響病人的生活質量。

發明內容
鑒于前述背景，本發明的目的是提供一種用于更有效治療伴隨神經損傷的疾病的替代藥物及其制法。因此，在本發明的第一方面，提供了一種式I所示的G-CSF 二聚體(I) M1-L-M2其中，Ml是G-C SF的第一單體；M2是G-CSF的第二單體山是連接所述第一單體和第二單體的接頭(linker),并位于所述第一單體和第二單體之間。并且，所述的G-CSF 二聚體保持G-CSF單體的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一或第二單體的2倍以上。在本發明的一個優選例中，所述的L選自下組a)有機接頭；b)包含3-50個氨基酸的短肽；以及c)式II所示的多肽(II) -Z-Y-Z-其中，Y為載體蛋白；Z為包含0-30個氨基酸的短肽。在另一優選例中，沒有氨基酸的短肽是指肽健。在另一優選例中，接頭對G-CSF 二聚體具有足夠小的空間位阻，以至于不影響或不顯著影響第一單體和第二單體形成的正確的折疊和構象。在一個優選例中，有機接頭選自下組氧甲基苯基乙酰胺基甲基(oxymethylphenyIacetamidomethyI) (PAM)樹脂、4_氧甲基-苯基乙酸胺基甲基樹脂(4-oxymethyl phenyIacetamidomethyI resin)、和氯甲基化聚苯乙烯樹脂(chloromethylpolystyrene resin)。在另一優選例中，所述的第一單體和第二單體是相同的。在一個優選例中，所述融合蛋白的生物活性包括(a)作用于嗜中性粒細胞和干細胞，從而驅動嗜中性粒細胞的分化、生長和成熟；和(b)激活成熟的嗜中性粒細胞,參與免疫反應。在另一優選例中，所述的載體蛋白是白蛋白或人IgG的Fe片段。在一個優選例中，所述的G-CSF 二聚體的血清半衰期是所述第一和/或第二單體血清半衰期的3倍以上、5倍以上、或10倍以上。在另一優選例中，所述的G-CSF 二聚體由兩個G-CSF-Fc復合物制得，其中，每個G-CSF-Fc復合物包含一個選自SEQ ID NO:2_7的氨基酸序列。在本發明的另一方面，提供了一種由第一多肽和第二多肽制備的融合蛋白，其中，所述的第一多肽和第二多肽包含一段如SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列，且兩個多肽無空間位阻地連接。在一個優選例中，所述的第一和第二多肽為G-CSF單體。在本發明的另一優選例中，所述的第一多肽和第二多肽之間的無位阻地連接通過接頭實現。在該實施例中，所述的接頭為a).具有足夠小空間位阻的有機接頭，不影響或不顯著影響第一單體和第二單體形成的正確的折疊和構象；b).包含3-50個氨基酸的短肽；以及c).式II所示的多肽(II) -Z-Y-Z-其中，Y為載體蛋白；Z為包含0-30個氨基酸的短肽。在一個優選例中，所述的沒有氨基酸的短肽是指肽健。在另一優選例中，所述的有機接頭為氧甲基苯基乙酰胺基甲基(oxymethylphenyIacetamidomethyI) (PAM)樹脂、4_氧甲基-苯基乙酸胺基甲基樹脂(4-oxymethyl phenyIacetamidomethyI resin)、和氯甲基化聚苯乙烯樹脂(chloromethylpolystyrene resin)。在本發明的另一方面，提供了一種包含以由兩個G-CSF-Fc復合物制得的純化的G-CSF 二聚體作為活性成分的藥物組合物，其中，每個G-CSF-Fc復合物包含一段選自SEQID N0:2-7的氨基酸序列。在另一優選例中，所述的G-CSF 二聚體的純度為90-100%;在另一優選例中，所述的G-CSF 二聚體的純度為95-100% ;在另一優選例中，所述的G-CSF 二聚體的純度為99-100%。在該特定方面的一個優選例中，提供了一種治療神經系統疾病(neurologicaldisorder)的方法,包括給需要治療的對象施用有效量的前述的藥物組合物。在另一優選例中，所述的有效量為0. OOl-IOOOmg 二聚體每劑。在另一優選例中，所述的疾病選自下組中風、脊柱損傷、以及伴隨著血腦屏障損傷的神經系統疾病。在該特定方面的另一優選例中，提供了一種激活神經細胞中STAT3的方法，包括給需要治療的對象施用有效量的前述的藥物組合物。在另一優選例中，所述的有效量為
0.OOl-IOOOmg 聚體每劑。 在本發明的另一方面，提供了一種分離的包含如SEQ ID NO:2_7任一所示的氨基酸序列的多肽。在一個實施例中，提供了一種以包含如SEQ ID N0:2-7任一所示的氨基酸序列的純化的多肽作為活性成分的藥物組合物。在一個優選例中，所述多肽的純度為90-100% ;在另一優選例中，所述多肽的純度為95-100% ;在另一優選例中，所述多肽的純度為 99-100%。在該特定方面的一個優選例中，提供了一種治療神經系統疾病的方法，包括給需要治療的對象施用有效量的前述的藥物組合物。在另一優選例中，所述的疾病選自下組中風、脊柱損傷、以及伴隨著血腦屏障損傷的神經系統疾病。在該特定方面的另一優選例中，提供了一種激活神經細胞STAT3的方法，包括 給需要治療的對象施用有效量的前述的藥物組合物。在本發明的另一方面，提供了本發明所述人粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 二聚體或本發明分離的多肽在制備治療神經系統疾病藥物中的用途。在在該特定方面的另一優選例中，所述的疾病選自下組中風、脊柱損傷、以及伴隨著血腦屏障損傷的神經系統疾病。在本發明的另一方面，提供了人粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 二聚體或本發明的分離的多肽在制備用于刺激神經細胞STAT3的組合物中的用途。在本發明的另一方面，提供了一種制備G-CSF 二聚體的方法，所述方法包括步驟
a)用表達載體轉化哺乳動物細胞，所述的表達載體包含一段編碼G-CSF-Fc復合物的DNA序列，所述核苷酸序列選自下組SEQ ID NO :9-10 ；b)在適于表達G-CSF-Fc復合物和G-CSF二聚體的條件下，培養所述轉化的哺乳動物細胞；和分離和純化步驟(b)得到的G-CSF 二聚體；其中，所述的G-CSF 二聚體包含兩個G-CSF-Fc復合物，其中，每個G-CSF-Fc復合物包含選自SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。在本發明的另一方面，提供了一種生產分離的多肽的方法，所述方法包括步驟a)用表達載體轉化哺乳動物細胞，所述的表達載體包含一段編碼所述多肽的DNA·序列，所述核苷酸序列選自下組SEQ ID N0:9-10 ；b)在適于表達所述多肽的條件下，培養轉化的哺乳動物細胞；和分離和純化步驟(b)得到的多肽；其中，所述的多肽包含選自SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。


圖I顯示了本發明的一個實施例中的序列如SEQ ID NO: I所示的一個G-CSF 二聚體的結構。圖中，表示接頭，標記為“G-CSF”橢圓形表示G-CSF單體。在該實施例中，所述的G-CSF 二聚體通過接頭(氨基酸殘基175-190位)將一個G-CSF單體(氨基酸殘基1-174位)連接于另一個G-CSF單體(氨基酸殘基191-364位)。圖2a和圖2b顯示了本發明的一個實施例中的G-CSF 二聚體的結構。圖中，表示接頭，標記為“G-CSF”的橢圓形表示G-CSF單體,標記為“C”的橢圓形表示載體蛋白，并且所述的G-CSF單體位于載體蛋白的N-末端，標記為“Fe”的橢圓形表示人IgG2的Fe片段。圖3a和圖3b顯示了本發明的一個實施例中的具有氨基酸G-CSF 二聚體的結構。圖中，表示連接，標記為“G-CSF”的橢圓形表示G-CSF單體，標記為“C”的橢圓形表示載體蛋白，其中，所述的G-CSF單體位于載體蛋白的C-末端。標記為“Fe”的橢圓形表示人IgG2的Fe片段。圖4、6顯示了本發明的一個實施例中的G-CSF 二聚體在局灶性腦缺血動物模型(Focal cerebral ischemia)中的臨床效果。圖5顯示了本發明的一個實施例中的G-CSF 二聚體在體外能夠激活STAT3的效力。
具體實施例方式經過廣泛而深入的研究，發明人成功創造了一種本發明所述的新G-CSF 二聚體。所述的新G-CSF 二聚體能夠延長體內半衰期、改善藥物的動力學性能、減少給藥頻率、增強體內藥物活性以及促進神經功能的恢復。與等G-CSF摩爾比例的G-CSF單體相比，所述的G-CSF 二聚體還顯示了顯著的STAT3激活能力，從而改善了藥物的生物活性，提高了神經損傷的治療效果。前述特征將在如下實施例中進一步描述。G-CSF 二聚體
本發明第一個實施例為如式⑴所示的G-CSF 二聚體，其結構如圖1-3所示。載體蛋白包括人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的Fe片 段，和人白蛋白。在一個優選例中，G-CSF可以位于載體蛋白的C-末端或N-末端(如圖2_3所示)。如本文以及權利要求所用，術語“接頭(linker) ”指能將兩個單體多肽連接在一起的分子，從而使產生的化合物保持生物活性或較單體多肽具有提高的生物活性。在一個優選例中，“接頭(linker) ”指有機接頭或由肽鍵連接的氨基酸序列，或指由肽鍵連合或連接的兩個氨基酸；或指不是由常態肽鍵連合的兩個氨基酸序列或多肽域。接頭序列由一段多核苷酸讀碼框編碼，所述的多核苷酸通過接頭連接，介于編碼兩個多肽域的序列之間。在另一個優選例中，“接頭”還指位于兩個G-CSF單體之間的、起連接作用的短肽。接頭的長度沒有特別限制。一段接頭的長度通常為5-50個氨基酸殘基，通常，一段接頭不影響或不顯著影響兩個G-CSF單體形成正確的折疊和構象。一些接頭的例子包括有機接頭、包含3-50個氨基酸的短肽、和前述式(II)所示的多肽。在一個優選例中，所述的有機接頭可為氧甲基苯基乙酰胺基甲基(oxymethylphenyIacetamidomethyI) (PAM)樹脂、4_氧甲基-苯基乙酸胺基甲基樹脂(4-oxymethyl phenyIacetamidomethyI resin)、氯甲基化聚苯乙烯樹脂(chloromethylpolystyrene resin)、或其組合，并具有足夠小的空間位阻，以不影響或不顯著影響兩個G-CSF單體形成的正確的折疊和構象。在另一優選例中，所述的接頭包含具有相對較小結構的氨基酸，不影響或不顯著影響兩個G-CSF單體形成的正確的折疊和構象，例如甘氨酸(glysine)、丙氨酸、脯氨酸等。在另一優選例中，所述的接頭包含選自下組的氨基酸序列(a)疏水性氨基酸甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)構成的3_15個氨基酸殘基的氨基酸序列，例如 Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro ；(b)多克隆位點所編碼的氨基酸序列。該序列通常包含5-20個氨基酸殘基；在一個優選例中，該序列包含10-20個氨基酸殘基；(c)來自于G-CSF單體之外的蛋白的氨基酸序列，例如IgG或白蛋白的氨基酸序列；(d)包含上述(a)、(b)和(C)的任意組合的氨基酸序列。在一個優選例中，所述的接頭的序列是GSGGGSGGGGSGGGGS (例如SEQID NO: I中第175-190位氨基酸殘基)。在另一優選例中，所述的接頭具有ASTKGP (例如SEQ ID N0:4中的第175-180位氨基酸殘基)的序列。在另一優選例中，可在G-CSF 二聚體的N端或C末端添加其他不影響G-CSF單體生物學活性的氨基酸序列。在一個優選例中，這些添加的氨基酸序列對表達(如信號肽)、純化(如6XHis序列、釀酒酵母α-因子信號肽切割位點)有利，或提高G-CSF 二聚體的生物活性。序列表SEQ ID NO: I表示如圖I所示的G-CSF 二聚體，包含通過接頭(第175-190位氨基酸殘基)，將一個G-CSF單體(第1-174位氨基酸殘基)連接于另一個G-CSF單體(第191-364位氨基酸殘基)。SEQ ID NO: 2表示構成G-CSF 二聚體的G-CSF-Fc復合物，如圖2a和圖2b所示，其包含一個G-CSF單體(第1-174位氨基酸殘基)，一個人IgG2的Fe片段(第191-418位氨基酸殘基)，以及連接所述G-CSF單體和所述Fe片段的肽(第175-190位氨基酸殘基)。二個G-CSF-Fc復合物帶有Fe片段，通過所述Fe片段的配對構成所述的二聚體。在一個實施例中，所述的Fe片段通過所述的Fe片段的多個二硫鍵配對；在另一個實施例中，所述的二硫鍵的數量為2或4。SEQ ID NO: 3表示構成G-CSF 二聚體的G-CSF-Fc復合物，如圖3a和圖3b所示，其包含一個G-CSF單體(第245-418位氨基酸殘基)，人IgG2的Fe片段(第1-228位氨基酸殘基)，以及連接所述G-CSF單體和所述Fe片段的肽(第229-244位氨基酸殘基)。二個G-CSF-Fc復合物帶有Fe片段，通過Fe片段的配對構成二聚體。在一個實施例中，所述Fe片段通過所述的Fe片段的多個二硫健配對；在另一實施例中，所述的二硫鍵的數量為2或
4。 SEQ ID NO:4表示構成G-CSF 二聚體的G-CSF-Fc復合物，如圖2a和圖2b所示，其包含一 G-CSF單體(第1-174位氨基酸殘基)，人IgG2的Fe片段(第181-403位氨基酸殘基)，連接所述G-CSF單體和所述Fe片段的肽(第175-180位氨基酸殘基)。與SEQID N0:2相比，SEQ ID NO:4連接所述G-CSF單體和所述Fe片段的肽較短(少于10個氨基酸)。而且，SEQ ID N0:5刪除了短序列ERKCC，因此除去了兩個二硫鍵，從而減少了鉸鏈的錯配。二個G-CSF-Fc復合物帶有Fe片段，通過Fe片段的配對構成二聚體。在一個實施例中，所述Fe片段通過所述的Fe片段的多個二硫健配對；在另一個實施例中，所述的二硫鍵的數量為2或4。SEQ ID NO: 5表示構成G-CSF 二聚體的G-CSF-Fc復合物，如圖3a和圖3b所示，其包含一個G-CSF單體(第230-403位氨基酸殘基)，人IgG2的Fe片段(第1-223位氨基酸殘基)，連接所述G-CSF單體和所述Fe片段的肽(第224-229位氨基酸殘基)。與SEQ IDNO: 3相比，SEQ ID NO: 5連接所述G-CSF單體和所述Fe片段的肽較短(少于10個氨基酸殘基)。而且，SEQ ID N0:5刪除了短序列ERKCC，因此除去了兩個二硫鍵，從而減少了鉸鏈的錯配。二個G-CSF-Fc復合物帶有Fe片段，通過Fe片段的配對構成二聚體。在一個實施例中，所述Fe片段通過所述的Fe片段的多個二硫健配對；在另一個實施例中，所述的二硫鍵的數量為2或4。SEQ ID N0:6表示構成G-CSF 二聚體的G-CSF-Fc復合物，如圖2a和圖2b所示，其包含一個G-CSF單體(第1-174位氨基酸殘基)，人IgG2的Fe片段(第191-413位氨基酸殘基)，連接所述G-CSF單體和所述Fe片段的肽(第175-190位氨基酸殘基)。與SEQ IDN0:2相比，SEQ ID N0:6刪除了短序列ERKCC，因此除去了兩個二硫鍵，從而減少了鉸鏈的錯配。二個G-CSF-Fc復合物帶有Fe片段，通過Fe片段的配對構成二聚體。在一個實施例中，所述Fe片段通過所述的Fe片段的多個二硫健配對；在另一個實施例中，所述的二硫鍵的數量為2或4。SEQ ID NO: 7表示構成G-CSF 二聚體的G-CSF-Fc復合物，如圖3a和圖3b所示，其包含一個G-CSF單體(第240-413位氨基酸殘基)，人IgG2的Fe片段(第1-223位氨基酸殘基)，連接所述G-CSF單體和所述Fe片段的肽(第224-239位氨基酸殘基)。與SEQ IDN0:3相比，SEQ ID N0:7刪除了短序列ERKCC，因此除去了兩個二硫鍵，從而減少了鉸鏈的錯配。二個G-CSF-Fc復合物帶有Fe片段，通過Fe片段的配對構成二聚體。在一個實施例中，所述Fe片段通過所述的Fe片段的多個二硫健配對；在另一個實施例中，所述的二硫鍵的數量為2或4。SEQ ID NO:8 表示 G-CSF 單體分子。SEQ ID NO:9 表示 SEQ ID NO: 2 的 DNA 序列。SEQ ID NO: 10 表示 SEQ ID NO:6 的 DNA 序列。制備方法編碼本發明G-CSF 二聚體或融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。或者，也可用PCR擴增或合成獲得第一 G-CSF單體和/或第二 G-CSF單體的DNA編碼序列，然后將其連接在一起，形成本發明G-CSF 二聚體或融合蛋白的DNA編碼序列。 為了提高宿主細胞的表達量，可以對G-CSF 二聚體編碼序列進行改造。例如可以采用宿主細胞偏好的密碼子，消除不利于轉錄及翻譯的序列。在一個優選例中，可以采用酵母細胞或哺乳動物細胞偏好的密碼子，并采用計算機DNA軟件對DNA 二聚體基因進行檢測，以排除不利于轉錄及翻譯的序列。在一個優選例中，所述被排除的基因可為內含子切割位點，轉錄終止序列等。在獲得了本發明新融合蛋白的DNA編碼序列之后，首先將其連入合適的表達載體，再轉入合適的宿主細胞。最后，培養、純化轉化的宿主細胞，得到本發明的新的融合蛋白。SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:6的DNA序列分別顯示在SEQID N0:9和10中。如本文以及權利要求中所用，“載體”指質粒、粘粒、表達載體、克隆載體、病毒載體
坐寸ο在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地連接于表達調控序列，從而形成蛋白-表達載體。如本文和權利要求所用，“可操作地連接于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果使用信號DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號DNA(分泌前導序列)就是“可操作地連接于”所述的多肽。如果一個啟動子控制序列的轉錄，那么它是“可操作地連接于”所述的編碼序列。如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么所述的核糖體結合位點是“可操作地連接于”編碼序列。一般，“可操作地連接于”意味著重要殘基相鄰近；而對于分泌前導序列，則“可操作地連接于”意味著在閱讀框中相鄰。如本文和權利要求所用，“宿主細胞”是指原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞包括大腸桿菌(E. coli)、枯草桿菌(B. subtilis)等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。在一個優選例中，使用的宿主細胞是真核細胞；在另一優選例中，使用的宿主細胞是哺乳動物細胞。在獲得轉化的宿主細胞后，可在適合表達本發明融合蛋白的條件下培養該細胞，從而表達出融合蛋白。然后再分離出表達的融合蛋白。如本文和權利要求所用，“神經系統疾病或神經性疾病”是指中風、脊柱損傷、和伴有血腦屏障損傷的神經系統疾病。
藥物組合物和施用方法由于本發明G-CSF 二聚體具有優異的血清半衰期，因此G-CSF 二聚體以及含有G-CSF 二聚 體為主要活性成分的藥物組合物可用于治療神經損傷相關的疾病，并保護神經元。在一個優選例中，所述的神經損傷相關的疾病選自下組中風、脊柱損傷、和伴有血腦屏障損傷的神經系統疾病。本發明的藥物組合物包含安全和有效量的所述G-CSF 二聚體及藥理上可以接受的賦形劑或載體。“安全和有效量”是指化合物的量足以明顯改善所需要的病人的病情，而不至于產生嚴重的副作用。通常，藥物組合物含有O. OOl-IOOOmg的G-CSF 二聚體/劑；在一個優選例中，藥物組合物含有O. 05-300mg的G-CSF 二聚體/劑；在另一優選例中，藥物組合物含有O. 5-200mg的G-CSF 二聚體/劑。本發明的化合物及其藥學上可接受的鹽可制成不同的制劑，包含安全和有效量的所述G-CSF 二聚體或其藥學上可接受的鹽以及藥學上可以接受的賦形劑或載體。“安全和有效量”是指化合物的量足以顯著改善所需要的病人的病情，而不至于產生嚴重的副作用。化合物的安全和有效量根據治療病人的年齡、病情、療程等具體情況來確定。“藥學上可以接受的賦形劑或載體”是指一種或多種不同種類的相容性固體或液體填料或凝膠物質，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。“相容性”是指組合物中各組份能與本發明的化合物以及它們之間相互摻和，而不明顯降低化合物的藥效。一些藥學上可以接受的賦形劑或載體例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如吐溫 )、潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調味劑、穩定劑、抗氧化齊U、防腐劑、無熱原水等。施用本發明G-CSF 二聚體包括口服給藥、直腸施用、腸胃外(靜脈內、肌肉內、或皮下)給藥、以及局部給藥。用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑、和顆粒劑。在這些固體劑型中，活性化合物與至少一種常規惰性賦形劑(或載體)混合，如檸檬酸鈉、磷酸二鈣，或與下述成分的任一種混合(a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和硅酸；(b)粘合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖、和阿拉伯膠；(C)保濕劑，例如，甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、復合硅酸鹽、和碳酸鈉；(e)緩沖劑，例如，石蠟；(f)吸收加速劑，例如，季胺化合物；(g)潤濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土 ；和(i)潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑也可包含緩沖劑。固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑、和顆粒劑可采用包衣和殼材制備，如腸衣和其它本領域公知的材料。這些材料包含不透明劑，并且，這種組合物中活性化合物或化合物的釋放可以延遲的方式在消化道內的某一部分中釋放。可采用的包埋組分如聚合物質和蠟類物質。如果需要，活性化合物也可與以上描述的賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。用于口服給藥的液體劑型包括藥學上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿、或酊劑。除了活性化合物外，液體劑型可包含本領域中常規采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、和油，特別是棉籽油、花生油、蓖麻油、橄欖油、玉米胚油、芝麻油、或其混合物。除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含添加劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑、和香料。除了活性化合物外，懸浮液還可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁、瓊脂、或其混合物。用于腸胃外給藥的組合物也可包含生理學上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、懸浮液、或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水或無水載體、稀釋劑、溶劑、或賦形劑包括水、乙醇、多元醇、及其適宜的混合物。用于局部給藥的本發明G-CSF 二聚體的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑、和吸入劑。活性成分在無菌條件下與生理學上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑，或必要時可能需要的推進劑一起混合。·本發明G-CSF 二聚體可以單獨給藥，或者與任何藥學上可接受的化合物聯合給藥。使用藥物組合物時，是將安全和有效量的本發明的G-CSF 二聚體施用于需要治療的哺乳動物(如人)，其中施用時劑量為藥學上可接受的有效給藥劑量。對于60kg體重的人而言，每次給藥劑量通常為O. 01-300mg ;在一個優選例中，給藥劑量為O. 5-100mg。在決定實際劑量時，還應考慮本領域的已知因素，如給藥途徑、病人健康狀況等。本發明的G-CSF 二聚體具有許多優點，包括(但不限于)I.更長的體內生物半衰期。2.在神經細胞中更強的激活STAT3的生物活性。3.在缺血性動物模型中，單次或兩次注射，具有顯著的臨床效果。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。盡管所述闡述涉及具體實施例，本領域技術人員應理解本發明可通過這些實施例的變體實現。因此，這些實施例不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例本發明的G-CSF 二聚體具有如SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列或由具有如SEQ IDNO: 2-7所示氨基酸序列的G-CSF-Fc復合物構成，結構如圖1_3，用常規方法制備和純化。實施例1-3描述了具體的實施方法。實施例I構建表達rh-G-CSF 二聚體的哺乳動物載體合成包含人G-CSF、接頭肽、和人免疫球蛋白(IgG2)Fe片段的全長DNA序列。在5’端，引入包含限制性內切酶HindIII位點、Kozak序列、和信號肽的序列，在3’端，引入包含EcoRI位點的序列。G-CSF 二聚體全長DNA序列被克隆至pUC19，得到pG-CSF-Fc。質粒在E. coli TGl中擴增，并用HindIII和EcoRI消化，亞克隆至pcDNA3(英杰公司)載體，得到表達載體pEX-G-CSF-Fc。pEX-G-CSF-Fc經線性化、通過電穿孔轉染入CHO細胞。在選擇性培養基中篩選轉染的細胞并克隆。ELISA法檢測個體克隆的蛋白水平。G-CSF-Fc 二聚體表達水平最高的克隆被凍存、建立細胞庫，并用于生成重組蛋白。舉例說明，上述的包含人G-CSF、接頭肽、和人免疫球蛋白(IgG2)Fc片段的全長DNA序列具有SEQ ID NO: 2_7中的相應氨基酸序列。同樣的，根據上面描述的步驟，獲得的表達載體pEX-G-CSF-Fc包含SEQ ID NO:2-7中相應的氨基酸序列，pEX-G-CSF-Fc經線性化、通過電穿孔轉染入CHO細胞。在選擇性培養基中篩選被轉染的細胞，G-CSF-Fc單體和G-CSF-Fc 二聚體的混合物被表達于所述培養基中，用ELISA法檢測個體克隆的蛋白水平。首選表達有G-CSF-Fc 二聚體的克隆，那些G-CSF-Fc 二聚體表達水平最高的克隆被凍存、建立細胞庫、并用于生成重組蛋白。實施例2在哺乳動物細胞中生產G-CSF 二聚體從所述細胞庫中解凍一瓶細胞(約I X IO7細胞/mL)，、并接種于IOcm有蓋培養皿中的IOmL基礎培養基中，37° C，5%C02培養大約24小時。種子擴增培養物在搖瓶中連續擴增體積3-4倍(例如IOmL到30_40mL)，當細胞密度達到I. 0-1. 5 X IO6細胞/mL、且成活率彡90%時，培養物體積達到300-400mL。搖瓶以·120rpm,37° C、5%C02 培養。生物反應器(3L-10L)培養物擴增的階段一當種子擴增至細胞密度達
I.0-3. OXlO6細胞/mL、300-400mL、且成活率彡90%時，種子擴增培養物被無菌轉移至含有基礎培養基的3-10L生物反應器，培養控制條件為37° C，pH 6. 8，約50%溶解氧，攪拌速率65-100rpmo生物反應器(30L-100L)培養物擴增的階段二 當3. 0-10L生物反應器中的細胞密度達到I. 0-3. OX IO6細胞/mL、且成活率> 90%時，培養物被無菌轉移至含有基礎培養基的30-100L生物反應器中，培養條件為37° C，pH 6. 8，約50%溶解氧，攪拌速率65_100rpm。在收獲之前添加補料培養基，培養12-48小時控制葡萄糖水平于lg/L或低于lg/L。實施例3重組人G-CSF 二聚體蛋白的純化由于G-CSF聚體蛋白含有能結合Protein A的人Fe片段，采用親和層析純化G-CSF 二聚體蛋白。從生物反應器中收集的上清含有G-CSF-Fc多聚體(或集合物)、二聚體、以及G-CSF-Fc復合物和代謝物。從生物反應器培養物中收獲后，通過過濾獲得細胞培養物的上清，室溫下采用一系列的層析柱逐步純化，獲得純化的重組產物。例如，采用典型的重組蛋白A瓊脂糖凝膠FF(通用醫療集團，貨號17-1279-04)柱和含有5OmM檸檬酸/檸檬酸鈉、O. 2M NaCl的洗脫液(pH3. 7-3. 8)，得到經反相HPLC分析純度為>90%的純G-CSF 二聚體蛋白。額外的層析步驟包括采用Capto Adhere層析柱和含有50mMNaAc/HAC、0. 2M NaCl 的洗脫液(pH 4. 5-5. O)，然后采用 SP Sepharose FF (通用醫療集團，貨號=17-0729-04)，上樣緩沖液為50mM NaAC/HAC(pH4. 5-5. O)，平衡緩沖液為IOmMPB(pH6. 0±0. I)。使用的洗脫緩沖液為 IOmM PB 和 O. 2M NaCl (pH 7. 2±0. 1)，流速為10-200cm/hr并取決于柱子的大小。額外的工藝涉及低pH條件下病毒的活化、過濾、和透析平衡。G-CSF 二聚體蛋白的純度>95% (采用反相HPLC檢測)，估計分子量為47 ± 5Kd (采用還原型SDS-PAGE分析^G-CSF 二聚體蛋白用寡糖進行糖基化，寡糖占總分子量的2-10%。該蛋白的等電點在PH5. 8-pH6. 8之間，最大UV吸收波長在280nm。G-CSF 二聚體融合蛋白表現出以下體外生物學活性，包括劑量依賴性地刺激增殖和激活M-NSF-60細胞系中的STAT3。M-NSF-60細胞系中STAT3激活和增殖的ED50介于O. 1-lOng/mL。G-CSF 二聚體刺激M-NFS-60細胞的增殖可被抗人G-CSF抗體中和。此外，G-CSF 二聚體蛋白能激活原代神經元細胞的STAT3。G-CSF 二聚體融合蛋白表現出以下體內生物學活性，包括迅速提高白細胞(WBC)數、正常或嗜中性粒細胞減少癥的動物(包括小鼠、大鼠和猴子)的嗜中性粒細胞數。G-CSF 二聚體蛋白還可以在體外激活原代神經元的STAT3，并且降低急性缺血性中風大鼠模型的腦梗死面積。實施例4 G-CSF 二聚體的體內半衰期大鼠皮下單次注射100 μ g/kg本發明的G-CSF 二聚體，其由兩個G-CSF-Fc復合物(SEQ ID NO: 3)構成，計算藥代動力學參數，列于表I。表I
權利要求
1.一種式I所示的人粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 二聚體，(DM1-L-M2 式中， Ml是G-CSF的第一單體； M2是G-CSF的第二單體；和 L是位于所述的第一單體和第二單體之間、將所述第一單體和第二單體連接在一起的接頭; 其中，所述的G-CSF 二聚體保持了 G-CSF的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一單體或第二單體的血清半衰期的2倍以上。
2.如權利要求I所述的二聚體，其特征在于，所述的L選自下組 a)有機接頭； b)包含3-50個氨基酸的短肽；和 c)式(II)所示的多肽(II)-Z-Y-Z- 其中， Y為載體蛋白；和 Z為包含0-30個氨基酸的短肽。
3.如權利要求2所述的二聚體，其特征在于，所述的有機接頭選自下組氧甲基苯基乙酰胺基甲基(PAM)樹脂、4-氧甲基-苯基乙酰胺基甲基樹脂、和氯甲基化聚苯乙烯樹脂。
4.如權利要求I所述的二聚體，其特征在于，所述的第一單體和第二單體是相同的。
5.如權利要求I所述的二聚體，其特征在于，所述的生物活性包括 (a)作用于嗜中性粒細胞和干細胞，從而驅動嗜中性粒細胞的分化、生長、和成熟；和 (b)激活成熟的嗜中性細胞，參與免疫反應。
6.如權利要求2所述的二聚體，其特征在于，所述的載體蛋白是白蛋白或人IgG的Fe片段。
7.如權利要求2所述的二聚體，其特征在于，所述的為肽健。
8.如權利要求I所述的二聚體，其特征在于，所述的二聚體由兩個G-CSF-Fc復合物制得，每個G-CSF-Fc復合物包含一段選自SEQ ID NO: 2-7的氨基酸序列。
9.一種藥物組合物，其特征在于，權利要求8所述的純化的二聚體作為活性成分。
10.如權利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述的二聚體的純度為90-100%。
11.如權利要求8所述的二聚體，其特征在于，每一個所述的G-CSF-Fc復合物包含一個G-CSF單體、一個人IG2的Fe片段、以及連接所述G-CSF單體和所述Fe片段的肽；所述二聚體通過兩個所述Fe片段的多個二硫健配對形成。
12.如權利要求11述的二聚體，其特征在于，所述二硫鍵的數量為2或4。
13.一種包含第一和第二多肽的融合蛋白，其特征在于， a)所述的第一多肽包含SEQID NO:8所示的氨基酸序列； b)所述的第二多肽包含SEQID NO:8所示的氨基酸序列；和 c)所述的第一多肽與所述第二多肽無空間位阻連接。
14.如權利要求13述的融合蛋白，其特征在于，所述的第一多肽和第二多肽為G-CSF單體。
15.如權利要求13述的融合蛋白，其特征在于，所述的第一多肽和第二多肽之間的無位阻連接通過接頭實現，所述接頭選自下組 a)具有足夠小空間位阻的有機接頭，不影響或不顯著影響由第一單體和第二單體形成的正確的折疊和構象； b)包含3-50個氨基酸的短肽； c)式II所示的多肽(II)-Z-Y-Z- 式中， Y為載體蛋白；和 Z為包含0-30個氨基酸的短肽。
16.如權利要求15述的融合蛋白，其特征在于，所述的有機接頭選自下組氧甲基苯基乙酰胺基甲基(PAM)樹脂、4-氧甲基-苯基乙酰胺基甲基樹脂、和氯甲基化聚苯乙烯樹脂。
17.—種包含SEQ ID NO:2-7所示氨基酸序列的分離的多肽。
18.—種藥物組合物，其特征在于，權利要求17所述的分離的多肽作為活性成分。
19.如權利要求18所述的藥物組合物，其特征在于，所述的多肽的純度為90-100%。
20.一種治療神經系統疾病的方法，其特征在于，包括給需要治療的對象施用有效量的權利要求9或權利要求18所述的藥物組合物。
21.一種權利要求I所述的人粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 二聚體或權利要求17所述的分離的多肽在制備用于治療神經系統疾病藥物中的用途。
22.如權利要求21所述的用途，其特征在于，所述的疾病選自下組中風、脊柱損傷、以及伴隨血腦屏障損傷的神經系統疾病。
23.一種權利要求I所述的人粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 二聚體或權利要求17所述分離的多肽在制備激活神經元細胞中的STAT3的藥物中的用途。
24.一種生產權利要求I所述二聚體的方法，其特征在于，包括步驟 a)用表達載體轉化哺乳動物細胞，所述的表達載體包含一段編碼G-CSF-Fc復合物的DNA序列，所述核酸序列選自SEQ ID N0:9_10 ； b)在足以表達所述G-CSF-Fc復合物和所述二聚體的條件下，培養轉化的哺乳動物細胞；和 c)分離和純化步驟(b)得到的所述二聚體； 其中，所述的二聚體包含兩個所述的G-CSF-Fc復合物，每一個所述的G-CSF-Fc復合物包含一段選自SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。
25.—種生產權利要求17所述的分離的多肽的方法，其特征在于，包括步驟 a)用表達載體轉化哺乳動物細胞，所述的表達載體包含一段編碼所述多肽的DNA序列，所述核酸序列選自SEQ ID NO:9-10 ； b)在足以表達所述多肽的條件下，培養所述轉化的哺乳動物細胞；和 c)分離和純化步驟(b)得到的多肽； 其中，所述的多肽包含選自SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。
全文摘要
本發明提供了一種重組人G-CSF(rhG-CSF)二聚體，其具有比GCSF延長的血清半衰期和增強的生物活性，其中，所述的二聚體由二個G-CSF-Fc復合物通過Fc片段的二硫鍵配對形成，并且所述G-CSF-Fc復合物包含G-CSF單體、IgG2的Fc片段、以及連接所述G-CSF單體和Fc片段的肽。所述的rhG-CSF可用于治療神經性疾病。
文檔編號C07K14/535GK102906120SQ201180025773
公開日2013年1月30日 申請日期2011年5月25日 優先權日2010年5月25日
發明者嚴孝強, 黃智華, 楊紅舟, 孫乃超, 黃予良 申請人:健能隆醫藥技術(上海)有限公司