脂蛋白(a)多克隆抗體的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，特別涉及脂蛋白(a)多克隆抗體的制備方法。
【背景技術】
[0002]脂蛋白(a)主要是在肝臟合成，主要的功能是阻止血管內血塊溶解，促進動脈粥樣硬化形成。脂蛋白水平持續升高與心絞痛、心肌梗死、腦溢血有密切關系。是冠心病的獨立危險因子。Lp(a)是一種富含膽固醇的脂蛋白，核心部分為中性脂質和apoB-100分子，其外圍包繞著親水性的apo(a)，二者以二硫鍵共價連接;其中apo(a)是Lp(a)的特征性糖蛋白成分，主要由一種稱為Kringle的特征性結構構成，Kringle由80?114個氨基酸殘基組成，依靠三個內部二硫鍵穩定。
[0003]從apo(a)的N-末端到C-末端.所有的Kringle域通過兩兩之間的大約30個氨基酸的中間序列依次相連。除最靠近C端的Kringle域與纖溶酶原中的Kringle5同源外，其余Kringle域均與纖溶酶原中的Kringle 4同源，并依次被命名為Kringle IV 1_10型。在所有這10型的Kringle IV中，不同個體的Kringle 2型的串聯重復數一般在3_43之間變化，因此Apo(a)的分子量也就在300-800kDa的范圍中變化。Kringle IV9型中有7個半胱氨酸，其中未參與分子內二硫鍵的第4057位半胱氨酸(Cys 4057)與載脂蛋白B_1 00中的第4326位半胱氨酸(Cys4326)肜成分子間二硫鍵，進而組成完整的Lp(a)。
[0004]現有技術中制備脂蛋白(a)的多克隆抗體一般是采用全長脂蛋白(a)的重組蛋白來免疫動物，由于脂蛋白(a)的蛋白含較多的重復片段，制得的抗體多是針對這些重復片段上的抗原決定簇，使得多抗的特異性很低，結合能力很不均一，不能用于免疫檢測試驗。

【發明內容】

[0005]本發明針對現有技術的不足，提供一種特異性好的脂蛋白(a)多克隆抗體的制備方法。
[0006]為實現上述目的，本發明采用的技術方案是:
[0007]脂蛋白(a)多克隆抗體的制備方法，包括:基因的克隆、基因的表達、重組蛋白的純化、免疫動物和純化抗體，通過Kringle IV 1片段序列作為免疫原制備脂蛋白(a)多克隆抗體。
[0008]進一步地，所述免疫原采用酵母表達系統分泌表達。
[0009]進一步地，所述基因的克隆方法為:設計一對含限制性酶切位點的引物，擴增脂蛋白(a)基因的Kring 1 e IV 1片段，用限制性內切酶切割酵母分泌表達載體的質粒DNA和Kringle IV 1片段DNA，然后體外使兩者相連接，再用所得到重組質粒轉化細菌，驗證正確后提取重組質粒，轉化酵母菌感受態細胞。
[0010]進一步地，所述重組蛋白的純化方法為:先濃縮含重組質粒的酵母菌發酵培養液，然后濃縮液按照先疏水，后陰離子交換層析，再分子篩純化，獲得重組蛋白純品。
[0011]進一步地，所述免疫動物的方法為:首次免疫采用弗氏完全佐劑將純化的蛋白進行乳化，每只小鼠注射一定量純化的蛋白，然后采用弗氏不完全佐劑乳化純化的蛋白，以21天為間隔進行第2-3次免疫。
[0012]進一步地，所述純化抗體的方法為:利用飽和硫酸銨法初步純化血清，然后再用溴化氰活化的瓊脂糖4B偶聯脂蛋白(a)蛋白做親和層析。
[0013]本發明提供的脂蛋白(a)多克隆抗體的制備方法，采用單拷貝的KringleIV 1片段來制備多抗，得到的抗體只針對Kringle IV 1結構域部分，專一性較高，效果好于用全長脂蛋白(a)來制備的多克隆抗體。
【附圖說明】
[0014]圖1是本發明實施例提供的使用全長脂蛋白(a)和本發明的脂蛋白(a)片段制備的多抗進行Western Blot的圖。其中泳道1為全長脂蛋白(a)制備的多抗，泳道2為本發明實施例1制備的多抗。
【具體實施方式】
[0015]本發明實施例提供一種脂蛋白(a)多克隆抗體的制備方法。由脂蛋白(a)的基因序列分析結果，脂蛋白(a)是高度重復序列，根據序列的特征，采用將Kringle IV 1部分序列克隆到酵母表達載體pPic9k的方法來得到免疫動物的抗原，采用部分片段進行動物免疫，得到只針對部分片段的多克隆抗體，抗體的針對性很強，只針對部分片段，類似于單抗的效果。具體方案是，構建脂蛋白(a)Kringle IV 1片段的畢赤酵母表達載體(相關序列見序列1)。轉化畢赤酵母，篩選穩定表達的畢赤酵母菌落。采用甲醇誘導畢赤酵母分泌表達脂蛋白(a)的片段，采用蛋白沉淀，疏水層析，陰離子交換層析和分子篩過濾層析等方法濃縮純化誘導表達的所得到的片段，并分三次加弗氏完全佐劑和不完全佐劑免疫小鼠，檢測小鼠抗體效價和特異性，經抗體純化，最終得到脂蛋白(a)多克隆抗體。
[0016]因Lp(a)特有載脂蛋白Apo(a)組成結構單元中KringleIV 2的拷貝數多態性存在，大部分抗體直接針對Kringle IV 2位點，測定結果必然受到Apo (a)大小影響。不管如何選擇.校準品、參考物質與待測樣本中apo(a)分子的大小、分布不可能完全一致，從而造成不同試劑盒檢測結果的差異，引起差異的主要原因就是抗體的識別位點或特異性。本發明采用同源性低的Kringle IV 1部分片段來免疫小鼠，獲得相應抗原決定簇的抗體，克服了apo (a)分子的大小、分布不一致的缺點，抗體針對性強，制備的試劑盒穩定性好。采用畢赤酵母表達載體來構建分泌表達脂蛋白(a)片段Kringle IV 1結構域的載體，得到人脂蛋白a蛋白的蛋白片段，用于免疫小鼠，得到的抗體穩定性和特異性都較好。
[0017]實施例1
[0018]實施例1提供一種脂蛋白(a)多克隆抗體的制備方法。具體方法如下:
[0019]1、基因的克隆
[0020]設計特異性引物，特異性引物序列如下:兩端帶上的E.coRΙ,ΝοΤ I酶切位點:[0021 ] CGCGAATCCATGGAACATAAAG(E.coR I)
[0022]CGCGCGGCCGCTTAGCGGCCGGTCACG(NoT I)。
[0023]以人肝細胞總RNA為模板，先逆轉錄，后PCR擴增脂蛋白(a)KringleIV 1片段。PCR擴增條件:94°C60s，55°C60s，72°C60s，30個循環。PCR產物純化后得到優化抗原決定簇后的片段，該片段和pPic9k表達載體質粒用E.coR I和NoT I同時進行雙酶切，將二者酶切后的片段用T4DNA連接酶連接。用氯化鈣轉化法將重組質粒轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，通過氨芐青霉素抗性篩選轉化子。提取質粒，用PCR、E.coR I和NoT I雙酶切鑒定是否有外源基因的插入。驗證正確的質粒用于酵母菌感受態細胞的轉化。
[0024]2、酵母細胞表達基因
[0025]pPic9k表達載體質粒酶切線性化后，轉化插入畢赤酵母:用Bglll酶切重組質粒pPic9k-Lp(a)，使之線性化。將線性化的lOOng重組質粒DNA加入10yL經100°C變性的鮭魚精DNA，混勻。加入ΙΟΟμΙ感受態酵母，劇烈振蕩5s。加入530yL PEG、60yL 1.0mol/L LiAc，劇烈振蕩58。30°(3，20(^/1^11，溫育30111丨11。加入7(^1^ DMS0，顛倒溫和混勻，42°C，水浴 15min。室溫，12000r/min離心10s，吸盡上清。用500yL無菌水重懸細胞，涂RDB平板，30°C培養。從轉化平板RDB上挑取His+重組子，將其分別接種到MM和MD固體培養基，將能在MD培養基上正常生長，而在MM培養基上不能生長或生長極其緩慢的轉化子定義為陽性轉化子。
[0026]重組質粒與酵母細胞發生同源重組后可將外源基因整合到酵母染色體Α0Π基因位點上去，該外源基因的表達受甲醇的嚴格調控和誘導。選取重組畢赤酵母中的陽性轉化子，經5ml BMGY培養基30°C培養48h，離心取菌體，換5mL BMMY培養基，繼續30°C培養，并每24h補加甲醇連續誘導48h。獲得誘導表達的培養液，用于下一步的蛋白純化。
[0027]3、從培養液純化脂蛋白(a)片段
[0028]重組酵母的誘導培養的上清液濃縮過程:加入含0.4%脫氧膽酸鈉的三氯乙酸溶液于培養基上清液，至三氯乙酸的終濃度為20 % (W/W)，震蕩混合，冰上孵育20?30min。離心15min，去上清。加3倍體積的丙酮，靜置約lOmin。離心15min，去上清，沉淀物置冰上干燥lO