專利名稱：一種重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地說是人中性粒細胞集落刺激因子(G-CSF)cDNA克隆的獲得，表達G-CSF菌種的構建，及G-CSF大規模純化，制成藥品。
人外周血各種成熟血細胞均源自于骨髓造血干細胞的分化增殖，從造血干細胞到外周成熟細胞之間，存在一系列調節因子，形成網絡，控制著人體各種血細胞的數量和功能，維持機體白細胞的穩定。
人G-CSF是該網絡中存在于正常人體，刺激CFU-GM分化為CFU-G的因子，具有刺激前體細胞分化增殖為成熟外周中性粒細胞并增強其功能的蛋白質調節因子。
人G-CSF的發現是從生物活性研究開始的，早在1980年，Asano等人[Asano，etal.，Br.J.Cancer，41，689-694(1980)]發現一些癌癥患者體內有粒細胞增多現象，當把這些人癌細胞移植到裸鼠體內后也發生粒細胞增多現象，表明人癌細胞可產生一種使鼠粒細胞增多的集落刺激因子(CSF)。把人口腔(鱗狀)癌細胞株chu-2的條件培養液在體外刺激人和小鼠骨髓細胞時，能形成嗜中性粒細胞集落[Nomura.H，etal.，EMBO，5,871-876(1986)]人膀胱癌5637細胞株的條件培養液，能誘使人骨髓白血病細胞素HL-60和小鼠粒單系白血病細胞系WEHI-3BO+分化，故被稱為多向刺激因子。(Sonia.LM.Amgen Patent 1985.08.23US 768,959； Sonia.LM.1986 Science 23761-65)后來Strife等發現，如果骨髓細胞樣品在去除成熟髓系和淋巴系細胞后，再用這種多向刺激因子作用，則其促進嗜中性粒細胞集落形成，其多向刺激活性是由于輔助細胞的間接作用造成的。[Strife.A，etal.，Blood，69，1508-1523(1987)]隨后，從上述條件培養基中分離純化出具有粒細胞集落刺激活性的蛋白組份，它是一種小分子糖蛋白，分子量在18-22KD[Lu Hs，etal.，Arch Biochem Biophys.268 1781-92(1989)]其糖基化與否并不影響G-CSF刺激嗜中性粒細胞分化增殖的活性。僅影響體內清除速率、穩定性，[Oheda.M，etal.，J.Biol.Chem，265，11432-11435(1990)]并進一步證實其受體細胞主要是嗜中性細胞，是嗜中性粒細胞終端分化和活化因子。在人體正常生理狀態下，主要由單核巨噬細胞系產生。由于80年代基因重組技術的飛速發展，已能利用DNA重組技術大量生產可供臨床應用的人重組G-CSF。美國柯瑞英-艾格公司就重組生產G-CSF獲得專利(優先權號US 768949和US 835548，中國專利號ZL86106234)發明人通過從膀胱癌細胞株5637(A1)中提取總RNA，純化出PolyA+RNA，制備cDNA庫，轉化E.coliHB101備用，再把天然極微量的G-CSF純化，測序，設計并合成一組20bp左右混合探針，利用此探針與cDNA文庫雜交，篩選出編碼G-CSF的cDNA，擴增這些陽性克隆后，切下G-CSF基因進行序列分析，然后把此基因重組于如PNWI等表達載體，并轉化于E.coli中表達G-CSF蛋白。由于人體中含有的天然的G-CSF極其稀少，在如此稀少的情況下把它純化，用于準確分析N-氨基酸序列是極其困難的，并且混合探針設計合成耗費試劑，設備，且雜交條件嚴格，工作量大。
利用基因工程手段構建的表達外源目的基因的菌株常采用E.coli表達系統，且多以包含體形式表達于菌體內。包含體是以表達產物為主，聚集形成的蛋白性質的顆粒，目的蛋白具有正確的一級結構順序，但缺乏正確的構象，因而不具備其生物活性，欲研究或利用其生物活性，必須先經變性劑充分增溶，爾后經復性過程恢復其天然構象，才能顯示其活性。到目前為止，復性完全是自發的和隨機的，因此復性速度慢，回收率低，目前國內外所用的蛋白質復性方法均是依據排除使蛋白變性的環境，具體采用透析或大量稀釋方法，降低變性劑濃度，使目的蛋白復性。
透析法需要時間長，一般要24小時以上，且需要多次更換透析溶液，更主要的是透析袋內部溶液在透析過程中是不均一的，靠近透析膜的溶液變性劑濃度下降快而內部下降慢，只有部分蛋白處于適于復性的變性劑濃度范圍，其它蛋白很容易聚集、絮凝、沉淀，使復性回收率下降，而稀釋法的大體積稀釋試樣給后工序的純化工藝帶來不便，而且要增大設備的處理容量。雖有用中空纖維以超濾方式進行復性，但均采用內壓式中空纖維，這方式類似于血透原理，雖然可以用于大規模生產，但存在下述缺點復性蛋白溶液自中空纖維一端流向另一端，變性劑濃度變化劇烈，蛋白被濃縮，部份蛋白來不及復性就超過折疊范圍，沉淀析出，此沉淀進一步聚集在中空纖維內，堵塞通路，造成壓力上升，中空纖維破損。而且此方式不利于NaOH在位清洗。
本發明的目的是提出一種新的改進的，獲得G-CSF cDNA的方法，以及一種新的有效表達系統，使能高效生產G-CSF。
本發明的目的還在于提供一種使變性蛋白復性的簡便，快速，高活性回收率，處理量大的新方法。
本發明還有一個目的是提供一種工業化藥品生產具有人G-CSF活性多肽的純化方法。
本發明的目的是這樣實現的利用PCR技術設計一對引物從人血白細胞總RNA中直接釣出G-CSF cDNA(參表I)，測序正確后擴增獲得較多G-CSF cDNA，并構建于依賴T7 RNA聚合酶的表達載體PGENS1(參圖6)成為表達型重組體PGENSG，轉化E.coli BL21(DE3)plysS，篩選后獲得表達G-CSF的陽性克隆，經發酵、離心收集、勻漿破碎后得到含目的蛋白的包含體。
根據

圖1，組成復性裝置，將待復性蛋白及起始復性液置于復性反應器中，用蠕動泵抽出蛋白液，經中空纖維外側功能層由下端注入中空纖維柱，變性劑因超濾作用進入纖維中心管路并注入廢液缸，而蛋白沿管壁外側重新回到復性反應器中，同時以同樣速度將貯液注入復性反應器，使反應器內體積維持恒定，經不斷循環，反應器中變性劑濃度逐步下降，變性蛋白在溫和的條件下完成水合表面的脫水過程和折疊過程，直至復性。
復性后蛋白仍含有雜蛋白、熱源、核酸，須進一步去除，本發明設計了離子交換層析接疏水層析，后接分子篩層析的順序組合。離子交換層析填料為DEAE，Q或QAE。rhG-CSF等電點介于5.8-6.2，PH適于7.0-9.0，可直接以復性時稀釋液作為上樣平衡液，平衡離子交換柱，爾后將復性濃縮好的G-CSF蛋白溶液直接上樣，并以上述相應的流動相加0.01-0.5N NaCl梯度進行洗脫，此條件下洗脫的G-CSF蛋白可將復性過程中錯配構象及多聚體除去，參圖2。疏水柱選用butyl-，phenyl-或octyl基的疏水填料，將離子交換收集的目標峰直接補加0.1-1.0N(NH4)2SO4或0.1-1.0N NaCl，即可上樣于疏水柱，疏水柱以離子交換時相應的流動相加上述0.1-1.0N(NH4)2SO4或0.1-1.0N NaCl平衡柱子，上樣結束后以20-50mM磷酸緩沖液，PH7.0-9.0洗脫。因磷酸鹽具有一定鹽析作用，目標蛋白仍吸附在柱上，而在此充分洗滌的過程中核酸及熱原被充分洗脫，爾后以Tris鹽酸緩沖液或咪唑緩沖液及水順序地階段洗脫。G-CSF目標峰在Tris鹽酸或咪唑鹽酸緩沖液的洗脫峰中。經疏水層析后收集的目標峰，可直接上樣于以5-50mM醋酸-醋酸鈉為流動相平衡好的Sephacryl或Superdex層析柱，進行精制。
本發明所用此流動相旨在將可能存在的寡聚體進一步去除的同時，可以將前述疏水條件下的體系改換為5-50mM醋酸-醋酸鈉，經此分子篩層析得到的目標蛋白G-CSF，可以直接用于制劑的配制，而無須采用透析等其他改換溶液體系的處理，減少處理步驟中可能的污染與損失。
本發明提供一種具有商業價值的，大規模獲得重組人粒細胞集落刺激因子的方法，其突出的優點在于(1)利用聚合酶鏈式反應技術代替混合探針釣G-CSF cDNA，所以省去合成大量混合探針的繁瑣工作。
(2)采用外壓式中空纖維柱復性，可減少中空纖維破損，復性處于可控制變性劑去除速度的過程中，縮短復性時間，使得復性收率高達70％，一次復性規模可達1-10g，所用的聚砜材料便于NaOH進行原位清洗和消毒，可適應藥物蛋白開發生產的GMP要求。同時采用此復性方式，還可在復性完成后，直接調整泵的流量差，而將大體積蛋白溶液進行濃縮，以便于后續純化工藝操作的方便與省時。
(3)離子交換層析、疏水層析和分子篩層析三種不同分離機理層析順序組合，使復性后的G-CSF得以純化精制，經反相高效液相層析(HPLC-RP)及毛細管電泳(CE)檢測，其純度均大于95％。并且其生物活性達1×108u/mg。
本發明附圖的詳細說明都在實施例中
圖1是表達載體PGENS1的組成與特性圖；圖2是離子交換層析圖譜；圖3是疏水層析圖譜；圖4是分子篩層析圖譜；圖5是重組工程菌的SDS-PAGE電泳圖；圖6是復性裝置圖1.代表復性貯液缺罐； 2.代表復性反應器；3.代表磁力攪拌器； 4.代表中空纖維柱；5.代表蠕動泵； 6.代表廢液罐；表I是rhG-CSF cDNA的全序列；以下的實例是為了詳細說明本發明實例1G-CSF工程菌構建健康的中國人外周血，用Ficoll作梯度離心，分離出白細胞層。取出白細胞在培養基中作短暫洗滌，直接用異硫氰酸胍/酚氯仿抽提出總RNA。總RNA用作模板。以合成的反義鏈3′端寡核苷酸為引物進行反轉錄，反轉錄液中加入合成的5′端和反義鏈3′端寡核苷酸引物，用聚合酶鏈式反應法合成出G-CSF結構基因。經2％瓊脂糖凝膠電泳分離出條合成產物，切取λHindIII分子標準564bp處的DNA帶，再做第二次聚合酶鏈式反應，再電泳時可明晰地見到544bp的DNA帶。用第二次聚合酶鏈式反應后的反應液，經純化后以平末端方法和質粒載體pUC18直接重組連接，并轉化到E.coli BL21(DE3)plysS受體菌中得到的轉化體按單菌落擴大培養，抽取重組質粒DNA，作DNA測序，證明含有G-CSF的結構基因，其DNA序列與Gene Bank No.X03438 M17706中的G-CSF結構基因完全一致(表2)。
以上有關總RNA抽提，多聚酶循環反應，瓊脂糖凝膠電泳，平末端DNA連接反應，重組質粒轉化，轉化子篩選和DNA測序等一般的DNA克隆技術，都參照J.smbrook等1989，第二版的″分子克隆-實驗指南″一書操作。
本方法所用的5′端和3′端DNA寡核苷酸引物分別為N端引物5′GAATCTAGACATGACACCATTAGGCCCTGCCAGC端引物5′CATGGAYCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT本方法所用的聚合酶鏈式反應條件為第一次反應37℃ 2min→72℃ 2min→90℃ 1min循環5次再42℃ 2min→72℃ 2min→90℃ 1min循環30次再72℃保溫5min第二次反應55℃1min→72℃2min→90℃1min→循環30次72℃保溫5min本方法所用的表達型重組質粒的構建，是利用引物寡核苷酸引入結構基因兩端的NdeI和BamHI酶切點，酶切回收G-CSF基因，插入連接到以pUC為基礎，T7噬菌體啟動子啟動轉錄的質粒載體PGENS1(圖6)上，表達載體各組份來源復制子(ori)E.coli的coli E1型，選擇標記Ampr，啟動子T7噬菌體Φ10基因的啟動子，終止序列T7噬菌體Φ10基因的終止序列，插入位點NdeI-BamHI。重組體轉化E.coliBL21(DE3)plysS，然后篩選而獲得rhG-CSF的表達型重組體G-CSF基因的5′端部分編碼子作E.coli型的優化，以提高G-CSF的表達量，使之占總蛋白的20％以上(圖5)。
實例2包含體增溶液復性按圖1組配復性裝置。將包含體增溶液以一定比例混于復性起始液中。
復性起始液配方Urea1-6Mβ-疏基乙醇 5-20mMCu2SO410-40uM
Tris-HCl 20-50mMPH7.5-9.5復性蛋白濃度0.1mg/ml-1.5mg/mlEDTA 1-10mM貯液配方Cu2SO410uMTris-Cl 20-50mM PH 7.5-9.5EDTA 1-10mM貯液與復性液的體積比可控制在1∶3-1∶10，復性反應器置于磁力攪拌器上，均勻攪拌，用蠕動泵抽取復性液從中空纖維柱下端注入，從上部注回復性反應器中，透出液被導入廢液缸。調節泵流量及進入廢液缸的管路口徑使之體積維持恒定。
在此循環過程中，水及變性劑不斷從中空纖維透出。因超濾膜的分子量截留在3000-10,000，因此蛋白不會漏出，重新回到復性反應器中進行復性。整個復性過程需10小時。中空纖維材質選用聚砜材料或硝酸纖維素酯或醋酸纖維素酯。
實例3G-CSF純化制備用20mM Tris-HCl PH 7.0-9.0平衡DEAE-Sepharose FF柱，以l00cm/h上樣，用離子交換流動相I加0.01-0.5N NaCl進行梯度洗脫，收集B峰(圖2)。
離子交換目標峰中補加0.1-1.0N(NH4)2SO4，上phenyl-SepharoseFF柱，用20-50mM磷酸緩沖液，在PH7.0-9.0洗脫，而后以20mMTris-HCl pH 7.5洗脫，收集洗脫峰(圖3)，將疏水層析目標峰中加入(NH4)2SO44℃老化過夜，10,000rpm，4℃，10min離心收集沉淀，用5-50mM NaAc-HAc PH4.0溶解沉淀，上Sephacyl S-200柱，洗脫，收集目標峰(圖4)。*** SEQUENCE LIST *** (SINGLE)1 605′CCG CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CAC AAC GGT TTC CCT CTA GCT AGA AAT61120AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG ACA CCA TTA GGC CCT GCC AGC TCCMet Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser121 180CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGCLeu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Cys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly181 240GCA GCG CTC CAG GAG AAG CTG TGT GCC ACC TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG GAG CTG GTGAla Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val241 300CTG CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCCLeu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala301 380CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT AGC GCC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTCLeu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu381 420CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTGLeu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu421 480GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCTAsp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro481 540GCC CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCAAla Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala541GGA GGG GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTC CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC GTT CTAGly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu601 644CGC CAC CTT GCC CAG CCC TAA GGA TCC GGC TGC TAA CAA AGC CC 3′Arg His Leu Ala Gln Pro表I rhG-CSF cDNA的全序列ATG為G-CSF N端第一個氨基酸的編碼TAA為G-CSF C端終止信號CTG為G-CSF 成熟蛋白的第36位氨基酸(Leu)其后沒有GTGAGTGAG序列(Val-Ser-Glu)，表明為β型G-CSF。
權利要求
1.一種重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)的生產方法，其特征在于以反轉錄后的聚合酶鏈式(RT-PCR)反應方法，釣取人外周血白細胞中粒細胞集落刺激因子(G-CSF)基因的cDNA，構建重組質粒，轉化E.coli菌；以外壓式或內壓式中空纖維超濾透析復性；以離子交換柱層析、疏水柱層析和分子篩柱層析順序組合純化，大規模制得高純度的藥用rhG-CSF蛋白。
2.權利要求1所述的生產方法，其特征在于以外壓式或內壓式中空纖維超濾方式透析變性的rhG-CSF溶液。
3.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于其中復性裝置由復性貯液缸、復性反應器、中空纖維超濾器、廢液缸、蠕動泵、不銹鋼管道和閥門構成。
4.權利要求3所述的復性裝置，其特征在于采用并聯的中空纖維柱。
5.權利要求3所述中空纖維超濾器，其中中空纖維材料是醋酸纖維素酯、硝酸纖維素酯或聚砜。
6.權利要求3所述復性裝置，其中中空纖維超濾器膜中的截留分子量在3000-10000。
7.權利要求1所述的生產方法，其中離子交換柱填料為DEAE、Q、QAE等陰離子交換劑，疏水柱填料為butyl-、phenyl-或octyl基的疏水介質，分子篩柱填料為低吸附的Sephacryl系列或Superdex系列的介質。
8.權利要求1所述的生產方法，其中離子交換柱層析，其流動相I為20-50mM咪唑鹽酸、巴比妥鹽酸、Tris鹽酸、硼砂-硼酸或磷酸緩沖液，PH的范圍在7.0-9.0，流動相II為上述相應的流動相I中加0.01-0.5NNaCl梯度洗脫。
9.權利要求1所述的生產方法，其中疏水柱層析，其流動相為20-50mM咪唑鹽酸、巴比妥鹽酸、Tris鹽酸、硼砂-硼酸及磷酸緩沖液，PH范圍在7.0-9.0，其中流加0.1-1.0N(NH4)2SO4或0.1-1.0N NaCl，流動相II分別以20-50mM PH范圍在7.0-9.0磷酸緩沖液、Tris鹽酸緩沖液或咪唑緩沖液及水順序洗脫。
10.權利要求1所述的生產方法，其中分子篩柱層析，其流動相為5-50mM醋酸-醋酸鈉。
全文摘要
本發明涉及一種重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)的生產方法。該方法采用反轉錄后的聚合酶鏈式(RT-PCR)反應，釣取人粒細胞集落刺激因子基因，轉化E.coli菌；蛋白以中空纖維超濾透析方式復性，經離子交換層析、疏水層析和分子篩層析順序組合，純化，大規模制得高純度的藥用rhG-CSF蛋白。
文檔編號C07K14/52GK1167150SQ96106418
公開日1997年12月10日 申請日期1996年6月5日 優先權日1996年6月5日
發明者蘇勇, 孔鐵山, 王昌梅, 黃巖山, 孫漢棟 申請人:杭州九源基因工程有限公司