Pcsk9抗體、其藥物組合物及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于免疫學和分子生物學領域，涉及一種PCSK9抗體、其藥物組合物及其 用途。具體地，本發明涉及PCSK9的單克隆抗體。
【背景技術】
[0002] 前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin-9型（Proproteinconvertasesubtilisin/ kexintype9，PCSK9)是一種具有前蛋白轉化酶活性的枯草溶菌素蛋白酶。PCSK9在肝臟、 小腸和腎臟中表達量較多，在皮膚、神經系統中有少量表達。肝臟中的PCSK9可以分泌到 血循環中，并通過結合與內吞作用降低細胞表面低密度脂蛋白受體（LDLreceptor，LDLR) 的數目。因為LDLR可以從血漿中高效消除LDL，LDLR受體數量減少可促使LDL積聚，所以 PCSK9所介導的LDLR降解，可以提高血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)的水平。PCSK9參 與富含甘油三脂的載脂蛋白B的脂代謝，PCSK9的分泌能提高腸道甘油三脂（TG)的水平，從 而參與誘發高膽固醇血癥（RashidS.，etal·，Proproteinconvertasesubtilisinkexin type9promotesintestinaloverproductionoftriglyceride-richapolipoprotein Blipoproteinsthroughbothlow-densitylipoproteinreceptor-dependent and-independentmechanisms.Circulation. 2014Jul29 ; 130 (5):431-4L)〇
[0003] 高膽固醇血癥病人中有29%的病人在使用他汀類藥物。不能耐受他汀類藥物和他 汀類藥物不能達到所需血脂膽固醇水平的患者占高膽固醇血癥病人的8. 2%。全球七大藥 物市場（不包括中國）共有高膽固醇血癥病人3億9千萬。2004年10月12日，衛生部公 布的《中國居民營養與健康狀況調查》報告顯示，我國成人高血壓患病率為18. 8%，估計全 國患病總數為1. 6億人，比1991年增加了 7000多萬人。全國血脂異常患者也已達到1. 6 億人。
[0004]目前，尚需要開發新的能夠特異作用于人類PCSK9的免疫治療抗體，其可結合至PCSK9并阻斷PCSK9與LDLR的結合。阻斷PCSK9與LDLR的結合可以提高細胞表面LDLR的 數量，提高LDL和所攜帶膽固醇的代謝，防治和減少高膽固醇血癥所引起的心血管疾病。尤 其需要開發高效能的PCSK9抗體，其還能夠同時提高甘油三脂（TG)代謝或降低TG水平，甚 至能夠在較長的時間內維持功效。

【發明內容】

[0005] 本發明人經過深入的研究和創造性的勞動，得到了一種PCSK9單克隆抗體。本發 明人驚奇地發現，本發明的單克隆抗體能夠很好地特異性與PCSK9結合，并且能夠十分有 效地阻斷PCSK9與LDLR的結合，提高細胞表面LDLR的數量，提高LDL和所攜帶膽固醇的代 謝，提高甘油三脂（TG)代謝，具有用于制備防治高膽固醇血癥所引起的心血管疾病的藥物 的潛力。由此提供了下述發明：
[0006] 本發明的一個方面涉及一種單克隆抗體，其包括：
[0007] 重鏈可變區，其包含氨基酸序列為（或者包含）SEQIDN0:17 - 19的⑶R;和/或
[0008] 輕鏈可變區，其包含氨基酸序列為（或者包含）SEQIDNO: 20 - 22的⑶R。
[0009] 抗體治療藥物，特別是單克隆抗體（MAB)已在多種疾病的治療中取得了良好的療 效。獲取這些治療性抗體的傳統實驗方法是采用抗原免疫動物，在免疫動物體內獲取靶向 抗原的抗體，或通過親和力成熟的方法來改進那些與抗原的親和力較低的抗體。然而，這些 方法需要大量時間和精力，大多數時候也并不能針對抗原上的特定表位。
[0010] 輕鏈和重鏈的可變區決定抗原的結合；每條鏈的可變區均含有三個高變區，稱互 補決定區（CDR)(重鏈（H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3,輕鏈（L)的CDR包含LCDR1、 LCDR2、LCDR3;其由Kabat等人命名，見SequencesofProteinsofImmunological Interest,FifthEdition(1991)，第 1-3 卷，NIHPublication91-3242,BethesdaMd)〇
[0011] 本發明人創造性地構建了 6個CDR區的氨基酸序列，并做特定修改以提高抗體可 變區對抗原的結合活性。為配合在CDR區的改動，框架區也同時被修改，但是需要確保這些 框架區的修改仍與人源的種系序列相兼容。框架的修改也將同時進行分析，以確保這些改 變對CDR區與抗原的結合沒有影響。
[0012] 本發明重鏈可變區的3個⑶R如下：
[0013]HCDR1：GFTFSSYS(SEQIDNO：17)
[0014]HCDR2：ISSSSSYI(SEQIDNO： 18)
[0015]HCDR3：EYDFWSAYYDAFDV(SEQIDNO： 19)
[0016] 輕鏈可變區的3個⑶R如下：
[0017]LCDR1:SRNIGGGND(SEQIDNO:20)
[0018]LCDR2:GVI(SEQIDNO:21)
[0019] LCDR3:QSFDGSLSGSV(SEQIDNO:22)。
[0020] 在本發明的一個實施方案中，涉及一種單克隆抗體，其包括：
[0021] 重鏈可變區，其氨基酸序列為（或者包含）SEQIDN0:14 ;和/或
[0022] 輕鏈可變區，其氨基酸序列為（或者包含）SEQIDN0:16。通過本領域技術人員所 熟知的技術手段，例如通過美國國立生物技術信息中心網站（NCBI)，分析該單克隆抗體重 鏈可變區和輕鏈可變區的互補決定區（⑶R)，其亦分別如上面的SEQIDN0:17 - 19和SEQ IDN0:20 - 22所示。在本發明中，將該單克隆抗體命名為ΜΑΒΙ。
[0023] 根據本發明任一項所述的單克隆抗體，其中，其重鏈恒定區為小鼠抗體的重鏈恒 定區或人抗體的重鏈恒定區，其輕鏈恒定區為小鼠抗體的輕鏈恒定區或人抗體的輕鏈恒定 區。
[0024] 本發明的另一方面涉及一種分離的核酸序列，具體地，所述核酸序列為SEQID NO: 13和SEQIDNO: 15所示的核苷酸序列；其編碼SEQIDNO: 14和SEQIDNO: 20所示的 氨基酸序列。
[0025] 本發明的再一方面涉及一種核酸構建體，其含有本發明任一項所述的核苷酸序 列；具體地，所述核酸構建體為重組表達載體；更具體地，為重組原核表達載體或重組真核 表達載體。
[0026] 本發明的再一方面涉及一種重組宿主細胞，其含有本發明任一項所述的核酸構建 體；具體地，所述重組宿主細胞為重組原核細胞或者重組真核細胞。
[0027] 本發明的再一方面涉及一種單克隆抗體偶聯物，包括單克隆抗體和偶聯部分，其 中，所述單克隆抗體為本發明中任一項所述的單克隆抗體，所述偶聯部分為選自放射性核 素、藥物、毒素、細胞因子、酶、熒光素、和生物素中的一種或多種；具體地，所述偶聯部分為 蓖麻毒素；更具體地，所述偶聯部分為蓖麻毒素A鏈。
[0028] 本發明的再一方面涉及本發明中任一項所述的單克隆抗體或者本發明任一項所 述的單克隆抗體偶聯物在制備預防和/或治療和/或輔助治療高血壓、高膽固醇、高膽固醇 血癥及其所引起的心血管疾病的藥物中的用途。
[0029] 本發明的再一方面涉及本發明中任一項所述的單克隆抗體或者本發明任一項所 述的單克隆抗體偶聯物在制備如下的藥物或者試劑中的用途：
[0030] 特異性與PCSK9結合的藥物或者試劑，
[0031] 阻斷PCSK9與LDLR結合的藥物或者試劑，
[0032] 提高細胞表面LDLR數量或者血漿中LDLR水平的藥物或試劑，
[0033] 降低血漿中LDL或LDL-C水平的藥物或試劑，
[0034] 降低血漿中TG水平的藥物或試劑，
[0035] 抑制血漿中LDL積聚的藥物或試劑，
[0036] 抑制PCSK9所介導的LDLR降解的藥物或試劑，或者
[0037] 提高LDL所攜帶膽固醇的代謝水平和/或提高TG代謝水平的藥物或者試劑。
[0038] 本發明人還通過實驗（體內實驗）發現，本發明的PCSK9抗體能夠有效地降低血 漿中LDL和/或LDL-C水平，并且能在更長時間（可達17天）降低血漿中LDL和/或LDL-C 水平。特別是出乎意料地發現，本發明的PCSK9抗體還能降低體內血清的TG水平，并且效 果能夠維持長達13天。目前現有技術中，尚未有任何PCSK9抗體能夠實現這一技術效果。
[0039] 本發明的再一方面涉及一種在體內或體外的方法，包括使用有效量的本發明中任 一項所述的單克隆抗體或者本發明任一項所述的單克隆抗體偶聯物的步驟，所述方法選自 如下：
[0040] 治療和/或預防和/或輔助治療高血壓、高膽固醇、高膽固醇血癥及其所引起的心 血管疾病的方法，
[0041] 特異性與PCSK9結合的方法，
[0042] 阻斷PCSK9與LDLR結合方法，
[0043] 提高細胞表面LDLR數量或者血漿中LDLR水平的方法，
[0044] 降低血漿中LDL或LDL-C水平的方法，
[0045] 降低血漿中TG水平的方法，
[0046] 抑制血漿中LDL積聚的方法，
[0047] 抑制PCSK9所介導的LDLR降解的方法，或者
[0048] 提高LDL所攜帶膽固醇的代謝水平和/或提高TG的代謝水平的方法。
[0049] 本發明中部分術語的解釋：
[0050] 多核苷酸
[0051] 本發明還涉及含有編碼本發明所述單抗的重鏈可變區和/或輕鏈可變區的核酸 序列的分離多核苷酸。在一個優選實施方案中，該核酸序列包含編碼SEQIDN0:18或20 所示的氨基酸序列。在另一個優選實施方案中，該多核苷酸包含SEQIDNO:17或19的核 苷酸序列。本發明的核酸序列包括基因組序列，以及相應的cDNA和RNA序列。此處所用術 語"核酸序列"應理解為包括合成DNA在內的所有這類變種。
[0052] 核酸構建體
[0053] 本發明還涉及包含本發明所述核酸序列及與之可操作連接的一個或多個調控序 列的核酸構建體，所述調控序列在其相容條件下能指導編碼序列在合適的宿主細胞中進行 表達。表達應理解為包括多肽（單抗）生產中所涉及的任何步驟，包括，但不限于轉錄、