專利名稱：：人粒細胞集落刺激因子異構體的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種新型的人粒細胞集落刺激因子異構體，可以使人粒細胞集落刺激因子在體內生存期得到延長。更詳細地說，本發明涉及一種人粒細胞集落刺激因子異構體，獲得該異構體的方法是將聚乙二醇作為一種非蛋白結構域共價連接到一種人粒細胞集落刺激因子異構體上，在該異構體的N末端或C末端已經加上了半胱氨酸。
背景技術：
：人粒細胞集落剌激因子主要的生物功能是刺激特異白細胞，即中性粒細胞或嗜中性粒細胞，以完成它們在體內的生長和發育。(Welte等，PNAS，82，1526-1530，1985:Souza等，Science,232,61-65,1986)。當這些中性粒細胞釋放到血流中時，具有保護生物對抗微生物感染的功能。Nagate等人報道了人粒細胞集落刺激因子的氨基酸順序(Nature,319，415-418，1986)。人粒細胞集落刺激因子是一種蛋白質，能夠利用一種受體的二聚作用與該受體按2:2的比率形成一種復合物(Homn等，Biochemistry,35,4886-96，1996)。Antomi等己經給出了具有受體的人粒細胞集落刺激因子的BN-BC結構域復合體的X射線結構(Nature,401，713-717，1999)。Aritomi等報道了存在于人粒細胞集落刺激因子與受體結合的接觸區或相鄰區的氨基酸，包括G4、P5、A6、S7、S8、L9、PIO、Qll、S12、L15、K16、E19、Q20、L108、D109、D112、T115、T116、Q119、E122、E123、和L124。有些由蛋白質工程獲得的人粒細胞集落刺激因子異構體已經公開(USP5,581，476，USP5，2H，132，USP5，362，853，USP4，904，584)。Ridehall-Olsen等人，報道了存在于人粒細胞集落刺激因子氨基酸序列中并參與了與人粒細胞集落刺激因子受體的結合的賴氨酸40、纈氨酸48、亮氨酸49和苯丙氨酸144。另外，Rayton等報道了谷氨酸46、亮氨酸49和苯丙氨酸144與人粒細胞集落刺激因子受體的類免疫球蛋白結構域(Ig類結構域)接觸，而賴氨酸40和纈氨酸49則遠離該結構域。因而，賴氨酸40和纈氨酸49是否與該受體接觸是不能確定的(J.biol.Chem.,2001,276，36779-36787)。而且，Rayton等已經證明人粒細胞集落刺激因子的谷氨酸19與受體精氨酸288互相作用，從而幫助傳送人粒細胞集落刺激因子的信號(J.Biol.Chem.，1999,274，17445-17451)。有人認為可通過遺傳工程方法人為地向人粒細胞集落刺激因子蛋白導入至少一個額外的糖鏈(USP5，218,092)。這種糖鏈的引入是通過置換、刪除和增加多肽氨基酸序列中的氨基酸來實現的。另外，還有很多關于將聚乙烯連接到人粒細胞集落刺激因子上的研究報道(Satake-Ishikawa等，CellStructureandFunction，17，157-160，1992;USP5，824，778'USP5，824,784，W096/11953,W095/21629,和WO94/20069)。人體內多肽或聚合體的消除可以通過腎、脾或肝中蛋白質的消除(或清除)和受體介導的降解來實現。這種消除伴隨有對底物特異或非特異的蛋白酶作用。通常，人體內蛋白質的消除取決于蛋白質的分子大小(不能被腎小球濾過的分子大小)、蛋白質分子電荷、糖鏈的連接、細胞表面的蛋白質受體等因素。特別地，蛋白質在腎內的消除取決于蛋白質或其聚合體的物理性質，比如大小(分子直徑)，對稱性，形狀/剛性或帶電性等。蛋白受體介導的降解是當該蛋白質喪失它與受體結合的功能時發生的。剛開始，白細胞數量不足，它與初生造血干細胞表面上的一種受體結合引起分化并發育成為白細胞。然而，一旦白細胞數量增加到某一程度時，將通過存在于白細胞表面上的受體除去人粒細胞集落刺激因子以免由其引起分化和發育過度。初生造血干細胞與存在于白細胞表面上人粒細胞集落刺激因子的比率大約是1:5。由存在于白細胞表面的受體引起的蛋白質消除，是通過在細胞中引入一種受體結合多肽，并通過在內體中引入蛋白酶而進行溶酶體降解完成的。Saker和Roufenburger(Mol,Phamiaco1.，2003，63，147-158)和Saker(Naturebiotech.2002'908-913)詳細地描述了由受體與人粒細胞集落刺激因子結合導致的蛋白質降解。為了增加蛋白在血液中的半衰期，必須減少蛋白質的腎消除和由受體結合引起的蛋白質降解。結合一種能夠增加蛋白表觀分子尺寸的聚合體可能會降低蛋白的腎消除并增加其在體內的半衰期。而且，在蛋白質上附著一種聚合體可有效阻隔蛋白酶，并因此可阻止非特異蛋白酶作用。在這些聚合體當中，聚乙二醇(PEG)是廣泛應用于制備治療用蛋白質產品的聚合體之一。由結合蛋白質藥物與合成聚合體而造成的蛋白質分子表面修飾可增加該藥在水或有機溶劑中的溶解度。相應地，可能增加該藥的生物適應性，減少免疫反應性，提高其在體內的穩定性，并延遲在消化系統、腎、脾或肝中的清除。小分子蛋白質通過在消化系統或腎中的過濾作用而清除。因此，當一種高分子量PEG被偶聯到這些小蛋白質分子上，有可能阻止這些清除作用(knauf，M.J.等J.Hiol.Chem.263:15064，1988)。引入一個高分子量的聚乙二醇(PEG)到蛋白藥物中可增加該蛋白質分子在溶液中的穩定性。另外可能通過有效保護該蛋白原有的表面特性來阻止非特異蛋白質吸附。在這方面，已有通過偶聯PEG到一種生物活性肽或蛋白質以增加蛋白質在體內的半衰期、增加蛋白質溶解性并減少其在體內免疫反應性的嘗試。USP4,179,337第一次報道了這些嘗試的結果。盡管由于上述優點，PEG偶聯到蛋白質上減少了許多副作用，但由于蛋白質活性部位被PEG阻擋，PEG偶聯的蛋白質在體內的活性不如人愿地明顯降低。PEG,迄今已得到廣泛地應用，能與至少一個自由賴胺酸殘基形成共價鍵以附著于蛋白質的表面。在這里，如果結合到PEG的位點在蛋白質表面并直接與蛋白質的活性相關，那么該蛋白的活性將降低。另外，因為PEG和賴胺酸殘基之間的偶聯是隨機的，不同類型的PEG-蛋白偶聯物是以混合物形式存在，以至于分離純化一種期望的偶聯物變得非常復雜和困難。例如，EP0401384公開的一種生產加入G-CSF的聚乙二醇的材料和方法。EP0335423公開了一種具有人粒細胞集落刺激因子活性的修飾后多肽。然而，按照現有技術，聚乙二醇分子不能可預見地與特異殘基偶聯，而是與存在于蛋白質中的任何活性基團偶聯，比如以非特異方式與賴胺酸殘基或N末端偶聯，結果形成一種非均質產品。為了使PEG連接在蛋白質的特異區域，USP5，766,897和WO00/42175公開了一種偶聯人生長激素和PEG的方法，其中，通過利用PEG-順丁烯二酰亞胺，使PEG可以選擇性的與半胱氨酸反應，以阻止PEG與人生長激素的活性區反應。使用上述種類的PEG，要求存在一個沒有參與人生長激素二硫鍵形成的游離半胱氨酸殘基。然而，存在于人生長激素中所有的四個半胱氨酸殘基都參與了二硫鍵形成。因此，按照現有技術，聚乙二醇化是通過使用一種人生長激素衍生物，該衍生物被人為地插入一個半胱氨酸殘基。另外，USP6,555，660和USP6,753,165以及美國專利公布號為2005/0058621和KR公開了人粒細胞集落刺激因子氨基酸序列中不同位置的半胱氨酸變巳升。其間，Bowen等已經表明在聚乙烯修飾的人粒細胞集落刺激因子中，聚乙烯的分子量與該藥物的生存期有關。在體外試驗中，蛋白質藥物的功效與和與蛋白質偶聯的聚乙烯分子量成反比關系。但在體內，活性則隨著分子量的增加而增加。人們認為一個生理活性蛋白的聚合體在受體介導降解中顯示出低的親合力，因此表現了更長的半衰期。所以，雖然這些人粒細胞集落刺激因子聚合體在體內能實現淋巴細胞的恢復，但從體外活性來看，它們顯示的活性比起未聚合的人粒細胞集落刺激因子的活性要低一些。最近，一種包含了連接于N末端的20kDa聚乙二醇的修飾人粒細胞集落剌激因子已經研制成功并商業化(Neuksta)。聚乙二醇聚合的人粒細胞集落刺激因子具有更長的半衰期，因此可降低給藥頻率。已商業供應的人粒細胞集落刺激因子的具體例子包括E型大腸桿菌衍生的重組人粒細胞集落刺激因子(商品名Gran和Neupogen)，粒系集落刺激因子(商品名NeutrogimmdGi:anocyte)產于動物細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，E型大腸桿菌衍生的那托司亭(商品名Neu-up)，在這些藥品中，變異均出現在五個氨基酸序列的N末端區，這樣能增加人粒細胞集落刺激因子蛋白質的功效。技術問題然而，按照現有技術中的人粒細胞集落刺激因子異構體仍存在很多問題，因為這些氨基酸序列修飾的人粒細胞集落刺激因子異構體在體內活性低或半衰期不夠長，或在偶聯PEG和人粒細胞集落剌激因子時產生非均一產物。
發明內容技術方案因此，鑒于上述提到的問題，產生了本發明。本發明的一個目的是提供一種具有極好的活性和明顯增長的半衰期的人粒細胞集落刺激因子異構體，通過偶聯聚乙二醇到氨基酸序列修飾后的人粒細胞集落刺激因子上得到該異構體，其中通過在特異位點取代或加成半胱氨酸來進行氨基酸序列修飾，以利于聚乙二醇偶聯到人粒細胞集落剌激因子上，然后該修飾位點部分與聚乙二醇偶聯。按照現有技術，人粒細胞集落刺激因子異構體已經能常規生產，該異構體通過修改多肽鏈序列并在特異位點對一個適當氨基酸進行聚乙二醇化以增加在體內的活性或壽命。然而，本發明的發明人發現通過將氨基酸加成到人粒細胞集落刺激因子多肽鏈的兩個末端并同時在加成位點進行聚乙二醇化可以得到一種人粒細胞集落刺激因子的新型異構體，該異構體顯示出比現有技術的異構體更好的體內活性或壽命。本發明正是以該發現為基礎的。本發明一方面提供了一種人粒細胞集落刺激因子異構體，該異構體在人粒細胞集落刺激因子N末端的蘇氨酸之前，見序列No.l，或在C末端脯氨酸后至少加成了一個氨基酸，其中這些被加成到人粒細胞集落刺激因子上的氨基酸至少有一個是半胱氨酸并且至少有一個半胱氨酸與聚乙二醇偶聯。本領域技術人員通常知道序列No.l的N末端可能包括甲硫氨酸。在這種情況下，半胱氨酸可以加在N末端的甲硫氨酸和蘇氨酸之間。上述異構體也包括在本發明范圍內。更具體地說，可以在該序列每個末端加成112氨基酸。優選加入一個半胱氨酸。更優選的是該半胱氨酸是175C，被加在C末端。本發明的優選方案之一，聚乙二醇與加在人粒細胞集落刺激因子上的半胱氨酸共價偶聯。優選具有2040kDa分子量的聚乙二醇。更優選支鏈聚乙二醇。本發明的另一個優選方案，在聚乙二醇被偶聯到人粒細胞集落刺激因子上之前，在人粒細胞集落刺激因子上至少有一個氨基酸被另一個氨基酸取代。本發明另一方面提供了一種藥物組合物，包括上述人粒細胞集落刺激因子異構體和一種藥物可接受的載體。本發明的再一方面提供了編碼具有上述在N末端或C末端加有半胱氨酸的人粒細胞集落刺激因子異構體的蛋白質的基因。本發明還有一方面，即提供了一種寡脫氧核糖核苷酸作為修飾人粒細胞集落刺激因子氨基酸序列成為上述人粒細胞集落刺激因子異構體的引物。優選序列Na27所示的任何一個寡脫氧核糖核苷酸作為弓I物。有益效果本發明的人粒細胞集落刺激因子異構體表現出明顯提高的體內活性或壽命，因此可降低給藥頻率。通過以下結合附圖的詳細說明，本發明上述的及其他的目的、特征和優點會更為清楚圖1圖解人粒細胞集落刺激因子的基因序列和蛋白質序列；圖2圖解一種人粒細胞集落剌激因子異構體的氨基酸序列，該氨基酸的修飾發生在N末端位點。圖3圖解一種人粒細胞集落刺激因子異構體的氨基酸序列，該氨基酸的修飾發生在C末端位點。圖4圖解一種人粒細胞集落刺激因子異構體的氨基酸序列，該氨基酸的修飾發生在該多肽鏈的中間部分。圖5圖解表達人粒細胞集落刺激因子異構體的一種質粒載體的結構；圖6是人粒細胞集落刺激因子異構體在大鼠體內生存期的曲線圖。具體實施例方式在此對本發明的優選方案進行詳細論述。圖1圖解了人粒細胞集落刺激因子的基因序列和蛋白序列。除了-1位甲硫氨酸之外，氨基酸序列No.1與圖1所示氨基酸序列相同。圖2圖解一種人粒細胞集落刺激因子異構體的氨基酸序列，該氨基酸的修飾發生在N末端位點。AA表示氨基酸，n表示氨基酸的數量，N為從l到12的整數。這些氨基酸包括至少一個半胱氨酸。圖3圖解一種人粒細胞集落刺激因子異構體的氨基酸序列，該氨基酸的修飾發生在C末端位點。AA表示氨基酸，n表示氨基酸的數量，N為從1到12的整數。這些氨基酸包括至少一個半胱氨酸。圖4圖解一種人粒細胞集落剌激因子異構體的氨基酸序列，氨基酸修飾發生在包含一個糖鏈的部分。在這里，133-蘇氨酸被半胱氨酸取代，聚乙二醇與該半胱氨酸共價偶聯。這是一個現有技術中已知的異構體(見韓國專利公布號為)。圖5圖解表達一種人粒細胞集落刺激因子異構體的質粒載體的結構。X噬菌體的PR被用作啟動子。為了實現在E型大腸桿菌中的表達，廣泛應用于實驗室中的是，含有cl857基因的質粒載體，該基因能夠誘導質粒載體中的這種表達。圖6為人粒細胞集落刺激因子異構體質粒載體在大鼠體內的壽命曲線圖。用磷酸鹽緩沖鹽水進行調節，試驗樣品包括T133C20kDa(Br)(按照公布號為的韓國專利，將133蘇氨酸取代為半胱氨酸，然后將20kDa的支鏈PEG共價偶聯到該半胱氨酸上，從而獲得G—CSF異構體)；已商品化的Neuksta(Amgene公司)，有20kDaPEG與N末端偶聯；N+20kDa(Br)(通過在G—CSF的N末端(-1C)的蘇氨酸和甲硫氨酸之間與半胱氨酸加成，并將在20kDa的支鏈PEG與該半胱氨酸公價偶聯而獲得的G-CSF異構體)；175C+20kDa(Br)(通過在G-CSF的C端的174-脯氨酸后與半胱氨酸加成，并在該半胱氨酸上共價偶聯20kDa的支鏈PEG而獲得的G-CSF異構體)；以及175C+40kDa(Bt)(通過在G-CSF的C末端的174-脯氨酸后與半胱氨酸加成，并在該半胱氨酸上共價偶聯40kDa支鏈PEG而獲得的G-CSF異構體)。每種異構體用PBS稀釋，并通過尾部靜脈向大鼠給藥，給藥量為100Hg/kg，取決于給藥當天測量的體重。僅在實驗當天給藥一次。本發明的發明人已經研究了人粒細胞集落刺激因子的蛋白質結構和組成人粒細胞集落刺激因子氨基酸的活性效果。參考人粒細胞集落刺激因子結構，組成人粒細胞集落刺激因子氨基酸活性效果的相關信息，和GOR4蛋白質二級結構預測的結果，以確定在蛋白質結構上進行氨基酸修飾的效果(GOR二級結構預測項目，http:us.expasy.org)。在此處，術語"人粒細胞集落刺激因子異構體"包括保持了人粒細胞集落刺激因子本身活性的類似物，變體，變異體，偶聯物等等，即使它們經過在原有人粒細胞集落刺激因子氨基酸序列中從一個氨基酸殘基到另一個氨基酸殘基的修飾。在此使用的三字母或單字母氨基酸代碼按照生物標準定義Ak(A):丙氨酸；Asx(B):天門冬酰胺或天門冬氨酸；Cys(C):半胱氨酸；Asp(D):天門冬氨酸；Glu(E):谷氨酸；Phe(F):苯丙氨酸；Gly(G):甘氨酸；His(H):組氨酸；Ik(I):異亮氨酸；Lys(K):賴胺酸；Leu(L):亮氨酸；Met(M)甲硫氨酸；Asn(N):天冬酰胺；Pro(P)脯氨酸；Gln(Q)谷氨酰胺；Arg(R):精氨酸；Ser(S)絲氨酸；ThrOQ:蘇氨酸；Val(V):纈氨酸；Trp(w):色氨酸；Tyr(Y):酪氨酸；Gk(Z):谷氨酰胺或谷氨酸。在此描述的"(氨基酸單字母)(氨基酸位置)(另一個氨基酸單字母)"是指在相應位置上，前者氨基酸被后者氨基酸取代。例如T133C意思是在人粒細胞集落刺激因子天然序列的第133位的蘇氨酸被半胱氨酸取代。.在此，用于誘導特異位點氨基酸修飾的引物由下式表示(氨基酸單字母)(氨基酸位置)(另一個氨基酸單字母)l或2，其中后綴l表示在雙鏈模板中該引物引導單鏈模板延續方向是5'—3'，而后綴2表示該引物引導單鏈模板延續方向是3'—5'。按上述方法獲得的人粒細胞集落刺激因子基因可在該位置有至少一個密碼子的修飾。在此使用的"修飾"指由于在編碼人粒細胞集落刺激因子基因中取代或加成至少一個密碼子而引起的人粒細胞集落刺激因子氨基酸序列的改變。更詳細地說，這些修飾包括:在蘇氨酸，人粒細胞集落刺激因子氨基酸序列中的第一個氨基酸之前加成半胱氨酸；在同樣氨基酸序列C末端的脯氨酸后加成半胱氨酸；除末端位點修飾之外的多肽序列中部的修飾；等等。例如，T133C的意思是用半胱氨酸取代天然人粒細胞集落刺激因子第133位的蘇氨酸。按照本發明的具體實施例，構建了一種包括一個密碼子的合成寡核苷酸，該密碼子將人粒細胞集落刺激因子中的一個目標氨基酸的修飾進行編碼。通常，使用一段長度大約為27~36條核苷酸的寡聚核苷酸。雖然可以使用較短的寡聚核苷酸，但優選寡聚核苷酸具有12-15條核苷酸以在模板兩側補充核苷酸編碼修飾。這些寡聚核苷酸可以與模板DNA充分雜交。表1給出了一種本發明所述用于氨基酸修飾的合成寡核苷酸。該寡聚核苷酸可以按現有技術中的方法制備。按照本發明的一種實施例，構建了一個人粒細胞集落刺激因子異構體的DNA，該異構體中的一個氨基酸被修飾了。在該實施例中，使用人粒細胞集落刺激因子DNA(表1)作為模板和一段合成寡核苷酸編碼修飾作為引物進行PCR。如果雙鏈模板在PCR的加熱步驟被分開，一個補充引物則與每條單鏈模板雜交。DNA聚合酶允許與模板互補的核苷酸連續不斷地沿著5'—3'方向連接到編碼修改部分引物的羥基上。結果第二鏈就含有了編碼修改部分的引物序列，以至于產生的基因可編碼目標的修改部分。第二鏈又作為一段模板DNA以重復復制步驟，以至于基因編碼修飾能被連續擴增。以下，將以T133C為例更詳細地說明在人粒細胞集落刺激因子多肽鏈中部進行的修飾。T133C指天然人粒細胞集落刺激因子的133位蘇氨酸被半胱氨酸取代。為了獲得T133C，使用天然粒細胞集落刺激因子DNA(圖1)作為模板并引入每一個由N末端T133C2和C末端T133C1形成的引物對進行PCR。這樣做，可獲得含有被修飾的密碼子的兩段DNA片段，相應的133位氨基酸蘇氨酸，被半胱氨酸的取代。然后，通過引入兩段DNA片段和使用N末端和C末端引物對進一步進行PCR擴增。用這種方法，可獲得人粒細胞集落刺激因子異構體T133C的修飾基因，其中第133位的氨基酸蘇氨酸被半胱氨酸取代。本發明所述的另一個實施例，氨基酸的加成發生在N末端或C末端。構建具有至少一個修飾氨基酸的人粒細胞集落刺激因子可以在該N末端和C末端進行。這樣的修飾包括在N末端的甲硫氨酸-(AA)n-蘇氨酸序列(見圖2)和在C末端的谷酰胺-脯氨酸-(AA)n序列(見圖3)。在此AA表示任何一個氨基酸，具體例子包括一個具有低分子量和不表現特殊功能的氨基酸，比如甘氨酸、絲氨酸或丙氨酸。其中至少一個AA包括半胱氨酸。后綴ii表示氨基酸的數量，其范圍是從1到12。在機體內對修飾后的人粒細胞集落刺激因子進行再識別大概至少需要12個氨基酸，對這些加入的氨基酸，作為一種異源蛋白可以生產抗體。這就是為什么氨基酸的最大數量限于12。因此，為了構建具有額外氨基酸的人粒細胞集落刺激因子基因，其N末端具有甲硫氨酸-(AA)n-蘇氨酸序列并包括ATG-(NNN)n-ACT-的DNA堿基序列，而C末端具有谷酰胺-脯氨酸《AA)n的氨基酸序列并包括-CAG-CCG-(NNN)nTAADNA堿基序列。在此NNN表示編碼相關氨基酸的DNA堿基序列。然后，通過使用引物，構建具有至少有一個修飾氨基酸的人粒細胞集落刺激因子的基因，該引物包括由上述方法和在圖1中展示的人粒細胞集落刺激因子基因獲得的DNA堿基序列。例如，如果給N末端加上一個甘氨酸和一個半胱氨酸，那么在N末端的氨基酸序列就包括甲硫氨酸-(甘氨酸-半胱氨酸-)蘇氨酸。則該處使用的引物可以被設計成具有序列GTAATAAATA-ATG-(GGT-TGT-)ACT。然后，通過使用如圖1所示的人粒細胞集落刺激因子基因模板和表1所示的C末端引物，利用上述引物就可構建具有Met-(Gly-Cys-)Thr序列的修飾人粒細胞集落刺激因子基因。按上面描述的方法獲得的人粒細胞集落剌激因子基因進一步使用N末端和C末端引物進行PCR。本發明所述的另一個實施例，在偶聯聚乙二醇以前，可能在N末端或C末端加一個氨基酸以及在人粒細胞集落刺激因子多肽鏈中部將至少一個氨基酸替換為另一種氨基酸。例如，-1C/T133C包括在N末端與半胱氨酸加成，并使用半胱氨酸取代了位于人粒細胞集落刺激因子多肽鏈的133位的氨基酸蘇氨酸。為了獲得-lC/T133C，通過使用已構建好了的-lC人粒細胞集落刺激因子異構體DNA作為模板并使用N末端T133C2和C末端T133C1引物對進行PCR。這樣做可獲得具有取代第133位蘇氨酸為半胱氨酸的修飾密碼子的兩段DNA片段。然后使用該兩段DNA片段與N末端和C末端的引物對進一步進行PCR。用這種方法，可獲得含有被修飾的密碼子的兩段DNA片段，相應的133位氨基酸蘇氨酸，被半胱氨酸的取代。然后，使用N末端和C末端引物對引發兩段DNA片段進一步進行PCR擴增。用這種方法，可獲得人粒細胞集落刺激因子異構體4C/T133C的修飾基因，其中第133位的氨基酸蘇氨酸被半胱氨酸取代，并且半胱氨酸加在N末端的蘇氨酸以前。構建在除了133位以外的異構體可以通過使用相關DNA引物和與-lC/T133C異構體同樣的方法進行。對于已與氨基酸加成的異構體，該異構體在N末端或C末端包括至少一個半胱氨酸，在其多肽鏈中部某一位點進行氨基酸修飾的方法已為本領域技術人員所熟知。例如，在人粒細胞集落刺激因子多肽鏈的中部取代至少一個氨基酸為另一氨基酸的方法已在下列文獻中公開韓國專利公布號為024811(N末端聚乙二醇偶聯G-CSF或類似物，及其制備)；韓國專利公布號為(G-CSF偶聯物)，(G-CSF偶聯物)及(G-CSF偶聯物)，美國專利5，214，132(人粒細胞集落刺激因子的多肽衍生物)和5，416，195(粒細胞集落剌激因子的多肽衍生物)，美國專利公布號為(G-CSF多肽和偶聯物)，和。更詳細地說，按照USP5,14,132，USP5,416,195和US20040214287，人粒細胞集落刺激因子的1、3、4、5和17位氨基酸分別被丙氨酸、蘇氨酸、精氨酸和絲氨酸取代，或17位的半胱氨酸被丙氨酸或絲氨酸取代。上述專利和專利申請的內容納入此處作為參考。同時，在現有技術中公幵的生產人粒細胞集落刺激因子異構體的方法、聚乙二醇化方法等也納入此處作為參考。本發明中的編碼人粒細胞集落刺激因子異構體的DNA序列可以通過為本領域技術人員所知的常規方法合成，例如使用DNA自動合成儀(mosearch，AppliedBiosystetn等可提供)。本發明的再一方面提供了一種包括編碼人粒細胞集落刺激因子異構體DNA序列的重組表達載體和一種可被上述表達載體轉化或轉染的宿主細胞。在此使用的術語"多肽"可以表達為"蛋白質"或有"生理活性的蛋白質"。在此使用的術語"異構體"表示一種被遺傳工程方法或其它方法修飾的生理活性蛋白，它具有原始的生理活性蛋白的主要功能。在此術語"修飾"指在一個氨基酸序列中的取代、加成和缺失，包括為了偶聯聚乙二醇而被半胱氨酸取代或與半胱氨酸加成。而且，這些修飾還包括半胱氨酸和聚乙二醇之間化學反應而形成的共價鍵。在此使用的術語"體內壽命"定義如下當一種生理活性蛋白用于人體或動物后，因為蛋白酶介導的消除和腎內消除而引起該生理活性蛋白總量和活性的降低，從而喪失其功能。因此，術語"體內壽命"表示這種蛋白在體內可以執行它的功能的持續時間，其通過該生理活性蛋白的體內半衰期來表征。在此使用的術語"載體"是指一種DNA分子，其作為一種承載體能夠穩定地轉移異體基因進入一個宿主細胞。要成為一種有用的載體，它必須能夠復制，能通過一定的方法轉移進入宿主細胞，并能用一定的方法進行自身檢測。另外，術語"重組表達載體"指將一種載體與異體基因可操作性地連接而形成的循環DNA分子，通過它異體基因可在一種宿主細胞中表達。作為重組表達載體，可以生產插入了人粒細胞集落刺激因子的DNA載體。當構造一種重組表達載體時，為了增加轉染基因在宿主細胞中的表達程度，相關基因應該可操作性地連接到一種在所選宿主細胞中起作用的轉錄和翻譯表達調控序列上，這在該領域中通常為人熟知。表達調控序列和相關基因應優選包含在單一表達載體中，該載體還包括一個細菌性的選擇標示物和復制起點。一種適當的載體不僅包括編碼人粒細胞集落刺激因子異構體的基因，而且包括上述元件(例如調控序列)都可以通過基本重組DNA技術進行構建。為了得到期望的載體，獨立分開的DNA片段應該彼此連接。因此每個DNA片段首先使用限制性內切酶進行酶切，然后將這些DNA片段按特定次序和方向連接起來。可以通過使用一種特異限制性內切酶在適合的緩沖液中剪切DNA。通常，大約0.2-1Ug的質粒或DNA片段在20y1的緩沖溶液中與1~2單位的相應的限制性內切酶共用作用。適合的緩沖液、DNA濃度、反應時間和反應溫度取決于限制性內切酶的生產商。通常反應在37t:進行大約1~2小時。但有些酶要求較高的溫度。反應以后，酶及其他雜質通過使用苯酚和氯仿混合物萃取酶切溶液而除去。DNA可以用乙醇沉淀法從水層進行回收。這時，彼此連接的DNA片段末端應該彼此相容，以連接DNA片段使其成為有功能的載體。剪切后的DNA片段可通過電泳基于分子大小進行分類和選擇。DNA電泳可以用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠進行。凝膠的選擇取決于被分離的DNA分子大小。在電泳以后，通過電洗脫或直接萃取可以將DNA從凝膠中回收。當使用低熔點瓊脂糖凝膠時，瓊脂糖應該在提取DNA之前熔化。彼此連接的DNA片段應該等摩爾量地加到溶液中。溶液中含有ATP、連接酶緩沖液和每0.5UgDNA約10單位的連接酶比如T4連接酶。為了鏈接DNA片段到載體上，載體應該首先使用合適的限制性內切酶進行剪切以形成直線型載體。這些直線型的載體用堿性磷酸酶或牛腸水解酶處理后使用。用水解酶處理可防止載體自連。按上述方法構建的重組表達載體被用于轉化或轉染宿主細胞。多聚核苷酸可按照在實驗手冊上公開的方法導入宿主細胞，比如[戴維斯等，分子生物學基本方法(1986)]和[SambmokJ.等(1989)分子克隆實驗手冊第二版]。介導多聚核苷酸進入宿主細胞的優選方法包括氯化鈣轉化、電穿孔法等等。按照本發明，使用一種己知技術將宿主細胞培養在適合生產多肽的營養培養基中。例如宿主細胞可以培養在一種實驗室或工業發酵裝置中，用合適的培養基在允許多肽表達和/或分泌的情況下采用小規模或大規模發酵/搖瓶培養。按照已知技術在含有碳源、氮源和無機鹽的合適的營養培養基中進行培養。該培養基通常已為本領域技術人員所知并已經商品化。另外，還可以使用一種直接在實驗室中制備的培養基。如果多肽直接分泌到營養培養基中，則該多肽可從該培養基中直接分離。如果多肽不能分泌到營養培養基中，它們則需從細胞溶解液中分離。多肽的分離可使用常規方法。例如，從培養基分離多肽的常規方法包括離心分離、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發或沉淀。另外，為本領域技術人員所知的各種多肽純化方法包括色譜法(例如，離子交換色譜法、親和色譜法、疏水色譜法或尺寸排阻色譜法)、電泳、分級溶解分離法(例如硫酸銨沉淀法)、SDS-PAGE或萃取。然后，如上所述已純化的人粒細胞集落剌激因子異構體按下述方法進行聚乙二醇化。本發明所述用于聚乙二醇化的合適的"非蛋白部分"包括聚乙二醇，并且優選支鏈聚乙二醇。非蛋白部分還包括但不局限于至少一種從水溶性聚合體如聚丙二醇(PPG)、聚氧乙烯(POE)、聚環丙二醇、聚乳酸和其衍生物、聚丙烯酸和其衍生物、聚氨基酸、聚乙烯醇、聚亞安酯、聚磷腈、聚L-賴氨酸、聚烯基氧化物(PAO)、多醣等等，和無免疫性聚合體如葡聚糖、聚乙烯基吡咯垸酮、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺等等中選擇的材料。本發明優選分子量約為2,000~100，000的用于制備聚合體衍生物的生物相容聚合體，更優選20，000~40,000。為了通過G-CSF的硫醇基在生物相容聚合體和G-CSF的之間形成鍵，該生物相容聚合體應先被活化。為了達到這個目的，生物相容聚合體可以與一種活性官能團偶聯。術語"活性聚合物基團"表示能夠活化生物相容聚合體使其可與生物活性物質偶聯的一個或部分基團。為了在生物相容聚合體和生物活性物質之間形成鍵，該生物相容聚合體的末端基團之一要被轉變成為一種活性官能團。這種方法稱為"活化"。例如，為了在聚(亞烷基氧化物)和一種生物活性蛋白之間形成鍵，末端羥基之一可以被轉變成為一種活性基團，比如碳酸酯。這樣就能獲得活化的聚(亞垸基氧化物)。本發明所述可用于活化生物相容的非蛋白部分聚合體的活性基團選自下列基團順丁烯二酰亞胺、乙酰胺、戊烯酰胺、丁烯酰胺、異氰酸酯、異硫氰酸酯、氯代三聚氰酸、1,4-苯醌、二硫化物等。通過巰基偶聯PEG和蛋白質可使用一種通常為本領域技術人員所知的方法進行。例如，通過Mu:hael反應使用PEG-順丁烯二酰亞胺使巰基偶聯到活化的雙鍵上[IsM等，B10physJ.1986,50:75-80]。另夕卜，通常為在蛋白質化學領域技術人員所知，可使用PEG-碘乙酰胺試劑。后一種方法更有效，因為可通過強酸性水解獲得一種穩定的PEG偶聯半胱氨酸衍生物，即羧甲基半胱氨酸，通過標準氨基酸分析可鑒定和測定該衍生物[GardFRN.Carboxytnethylation，MethodEnzytnol1972;B25:424-49]。除上述方法之外，還要用到如下方法通過使用PEG-鄰嘧啶基-二硫化物生產穩定的對稱二硫化物的方法[Woghken等，BioconjugateChem1993,50:75-80];使活化的PEG，艮卩sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidometliyl)cyclohexane-l-carboxykte活化的PEG與半胱氨酸的巰基反應形成共價鍵的方法[USP5，166，322];—種使活化的PEG,maleimido-6-aminocaproylester活化的PEG4000，在特異位點與有半胱氨酸取代的IL-2突變物反應以使其與半胱氨酸殘基共軛的方法[USP5，206，344];以及使用Y-馬來酰亞胺丁酸(maleimidobutyricacid)和e-馬來酰亞胺丙酸(maleimidopropionicacid)修飾蛋白巰基的方法[Ridi等，J.Med.Chem.18，1004，1975]。如下實施例所述聚乙二醇化的方法，使用NOF提供的mPEG20，000-順丁烯二酰亞胺、支鏈mPEG20,000-順丁烯二酰亞胺和支鏈mPEG40,000以摩爾比20:1,與人粒細胞集落刺激因子反應。該聚乙二醇化反應在0.1M磷酸緩沖液(pH7-8)中于室溫攪拌反應2小時。藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑必須在相應的給藥劑量以及濃度下對受試者無毒并與其它藥物制劑成分相容。例如，藥物制劑不應含有任何已知對多肽有害的材料，比如氧化劑和其它的材料。適合的載體包括緩沖劑如磷酸、檸檬酸及其他有機酸；抗氧化劑如維生素C;小分子量多肽；蛋白質比如血漿白蛋白、明膠和免疫球蛋白；親水聚合物比如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸比如甘氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或賴胺酸；單糖、二醣或其它碳水化合物如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA;金屬離子如鋅、鈷或銅；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；組成鹽的抗衡離子如鈉離子；和/或非離子性表面活性劑如吐溫、聚醚或聚乙二醇(PEG)。偶聯糖鏈的人粒細胞集落刺激因子異構體作為治療給藥之前應該先消毒。可以將其通過已滅菌的濾膜過濾來完成消毒。通常，將一種治療用偶聯糖鏈的粒細胞集落刺激因子異構體組合物儲存在一種備有已滅菌的進入孔的容器中，例如靜脈注射袋或具有隔膜的小瓶，該隔膜可被皮下注射針刺穿。本發明所述的人粒細胞集落刺激因子異構體可以通過合適的途徑直接對動物給藥，如局部或系統地腸胃外給藥。具體的給藥途徑要根據病人的病史確定，如人粒細胞集落刺激因子異構體給藥后已知的或可能出現的副作用。具體的腸胃外給藥途徑包括皮下注射、肌肉注射、靜脈注射、動脈注射和腹腔注射。最優選的給藥方法是進行持續輸注(例如滲透泵等小型泵)或注射，例如靜脈注射或皮下注射。對于人粒細胞集落刺激因子異構體的一種優選給藥途徑是皮下注射給藥。本發明所述的人粒細胞集落刺激因子異構體可以按治療有效量給藥于病人。術語"治療有效量"指在指定條件下使用一種既定的給藥模式而足以獲得期望治療效果的用藥量。人粒細胞集落刺激因子治療組合物應處方化，給藥符合醫療實踐，考慮具體的治療情況、個別病人的臨床情況(特別是人粒細胞集落刺激因子單一給藥時出現的副作用)、人粒細胞集落刺激因子異構體組合物的傳輸部位、給藥模式、給藥進度及其他通常為本領域技術人員已知的因素。人粒細胞集落剌激因子異構體的治療有效量應考慮上述因素而決定。通常，本發明所述的人粒細胞集落刺激因子每日劑量范圍大約為liig/kg至擺Ug/kg。現詳細闡述本發明優選方案的參考例子。應注意以下僅為說明性的例子，本發明的范圍并不局限于此。<實施例1〉人粒細胞集落刺激因子異構體的構建為了構建天然人粒細胞集落刺激因子的異構體，首先合成人粒細胞集落刺激因子基因作為模板。該實施例合成的基因具有如下列表1所示的堿基序列，如圖l所示的作為模板的人粒細胞集落刺激因子DNA序列和氨基酸序列。表l中，N末端175C分別對應于序列2—7。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>1、-IC人粒細胞集落刺激因子異構體的構建使用天然人粒細胞集落刺激因子為模板，-ic引物和c末端引物形成的引物對，進行PCR構建-lC異構體。進一步使用N末端引物和C末端引物將擴增DNA片段進行PCR，從而引入限制酶剪切位點(Xbal和BamHI)，然后引入表達載體。通過這樣做，有可能獲得將半胱氨酸加到N末端的蘇氨酸之前的人粒細胞集落刺激因子異構體基因。N末端的氨基酸順序是甲硫氨酸-半胱氨酸-蘇氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸。2、T133C人粒細胞集落刺激因子異構體的構建構建T133C的目的是為了提供一種已知異構體作為對照組或實現人粒細胞集落刺激因子多肽中間的氨基酸修飾。可以通過使用天然人粒細胞集落刺激因子作為模板與T133C2N末端引物和T133C1C末端引物形成的引物對進行PCR獲得T133C，T133C即天然人粒細胞集落刺激因子異構體的第133位上的氨基酸蘇氨酸被半胱氨酸取代。結果，有可能獲得密碼子修飾的兩個DNA片段，該密碼子的第133位氨基酸蘇氨酸相應地被半胱氨酸取代。使用N末端引物和C末端引物形成的引物對將這兩個DNA片段進行進一步PCR以獲得T133C的修飾基因，一種第133位氨基酸蘇氨酸被半胱氨酸取代的人粒細胞集落刺激因子異構體。采取與上述-lC人粒細胞集落刺激因子異構體的構建相同的方法導入表達載體。3、-1C/T133C人粒細胞集落刺激因子異構體的構建構建-lC/T133C的目的是為了實現人粒細胞集落刺激因子N末端的氨基酸加成和其多肽中間的氨基酸修飾。為了構建-1C/T133C，預先形成的-1C人粒細胞集落刺激因子異構體第133位氨基酸蘇氨酸，被半胱氨酸取代。為此，使用預先形成的-lC人粒細胞集落刺激因子異構體作為模板，與N末端引物T133C2和C末端引物T133C1形成的引物對進行PCR。結果，有可能獲得密碼子修飾的兩個DNA片段，該密碼子的第133位氨基酸蘇氨酸相應地被半胱氨酸取代。使用N末端引物和C末端引物形成的引物對將這兩個DNA片段進行進一步PCR以獲得-lC/T133C的修飾基因，一種第133位氨基酸蘇氨酸被半胱氨酸取代的人粒細胞集落刺激因子異構體。采取與上述-lC人粒細胞集落刺激因子異構體的構建相同的方法導入表達載體。4、175C人粒細胞集落刺激因子異構體的構建使用天然人粒細胞集落刺激因子DNA作為模板與N末端引物和175C引物形成的引物對進行PCR以構建175C。使用N末端引物和C末端引物將擴增DNA片段進一步進行PCR，從而引入限制酶剪切位點(Xbal和BamHI)，然后導入表達載體。通過這樣做,有可能獲得在N末端與半胱氨酸加成的人粒細胞集落刺激因子異構體基因。采用與上述-lC人粒細胞集落刺激因子異構體的構建相同的方法導入表達載體。C末端的氨基酸順序是丙氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸-半胱氨酸。5、175C/T133C人粒細胞集落刺激因子異構體的構建為了構建175C/T133C，預先形成的-lC人粒細胞集落刺激因子異構體第133位氨基酸蘇氨酸用半胱氨酸取代。為此，使用預先形成的175C人粒細胞集落刺激因子異構體作為模板，與N末端引物T133C2和C末端引物T133C1形成的引物對進行PCR。結果，有可能獲得密碼子修飾的兩個DNA片段，該密碼子的第133位氨基酸蘇氨酸相應地被半胱氨酸取代。使用N末端引物和C末端引物形成的引物對將這兩個DNA片段進行進一步PCR以獲得175C/T133C的修飾基因，一種第133位氨基酸蘇氨酸被半胱氨酸取代的人粒細胞集落剌激因子異構體。采取與上述-ic人粒細胞集落刺激因子異構體的構建相同的方法導入表達載體。如上所述構建的人粒細胞集落刺激因子異構體基因被導入表達載體從而通過APR啟動子表達。表達載體的組成元件如下表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><實施例2〉人粒細胞集落刺激因子異構體的表達和純化將含有人粒細胞集落刺激因子異構體基因的質粒載體轉化成E型大腸桿菌來構建生產人粒細胞集落刺激因子蛋白質的菌株。通常使用本領域技術人員已知的氯化鈣法進行轉化。這里，用作宿主細胞的E型大腸桿菌是普通可用的E型大腸桿菌(HB101、NM菌株系列，等等)。已轉化的大腸桿菌接種至置于15ml管中的5mlLum肉湯(LB)培養基中，在30。C恒溫箱中過夜孵育(培養)。種子細胞培養液接種至置于3,000ml三角瓶中的500mlLum肉湯(LB)培養基中，3(TC孵育。當600nm吸光率達到0.8-1.2時，將恒溫箱加熱到42°C，再孵育細胞4小時以誘導人粒細胞集落刺激因子異構體的表達。培養完成后，培養液進行離心分離以收集細胞，然后用蒸餾水洗滌細胞。洗滌后的細胞在微射流均質機(獲自mio:oflmdks公司)中12,000psi下處理四次而溶解，包涵體通過離心分離回收，再使用蒸餾水洗滌三次。將包涵體完全懸浮并溶于10ml8M的尿素、50mM甘氨酸(pH11.0)中，室溫下保持至少5小時，然后懸浮物在10,00(kpm下離心分離30分鐘。收集上清液，獲得人粒細胞集落刺激因子異構體蛋白質溶液。在該蛋白質溶液中加入甘氨酸和蒸餾水，分別控制甘氨酸濃度和尿素濃度分別為50mM和2M。得到的蛋白質溶液進行滴定使其pH值為9.0，然后在4'C下過夜進行蛋白質再折疊。蛋白質再折疊完成后，調節溶液pH到4.0，用蒸餾水稀釋三倍或以上，加樣至裝有10mlCMSepharoseFF的柱中(獲自AmershamBiosciences),之前該柱子已使用至少三倍于柱容積量的2mMHCl進行平衡。加樣完成后，使用至少三倍于柱容積量的2mMHC1平衡柱子，再使用至少三倍于柱容積量的50mM醋酸鹽氯化鈉緩沖液(pH5.4)沖洗。然后，人粒細胞集落刺激因子異構體使用包含35tnM氯化鈉的50mM醋酸鹽氯化鈉緩沖液(pH5.4)，以至少十二倍于柱容積的量進行洗脫，分成每5ml—份。進行高效液相色譜法分析后收集各部分。用CM瓊脂糖凝膠FF純化的人粒細胞集落刺激因子異構體通過CentricwiPlus-80過濾裝置濃縮，分子量10,000Da，3000rpm，25分鐘，從而獲得終濃度大約5mg/ml的蛋白質濃縮物。濃縮蛋白質加樣到300mlSephacrylS—100(AmershamBiosciences)的柱中，之前該柱子已使用至少三倍于柱容積量的lOmM醋酸鹽氯化鈉緩沖液(pH5.4)進行平衡。緩沖溶液以lml/min的速率洗脫，從而除去蛋白質溶液中人粒細胞集落刺激因子異構體的多聚體，分離純化單體，輪流用于后來的聚乙二醇加成反應。<實施例3〉將聚乙二醇偶聯至人粒細胞集落刺激因子異構體上1、支鏈mPEG(20,000)-順丁烯二酰亞胺-GCSF異構體的制備將10毫克實施例2所述的每一種人粒細胞刺激因子異構體溶入到0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0-8.0)中，并向其中加入200mg支鏈mPEG(20，000))-順丁烯二酰亞胺(獲自NOF)。在室溫下攪拌進行反應2小時。反應混合物通過使用INHC1溶液降低pH至3.0從而中止。2、支鏈mPEG(40，000)-順丁烯二酰亞胺-GCSF異構體的制備將10毫克實施例2所述的每一種人粒細胞刺激因子異構體溶入到O.IM磷酸鹽緩沖液(pH7.0-8.0)，并向其中加入400mg支鏈mPEG(40,000)-順丁烯二酰亞胺(獲自NOF)。在室溫下攪拌進行反應2小時。反應混合物通過使用INHC1溶液降低pH至3.0從而中止。<實施例4>用聚乙二醇純化人粒細胞集落刺激因子異構體的聚合體實施例4獲得的PEG-G-CSF聚合體采用如下方法進行純化。1、CM瓊脂糖凝膠FF色譜法反應完成后，滴定每一種mPEG-GCSF聚合體使其pH值為3.0,用蒸餾水稀釋至少10倍，加樣至裝有lOmlCMSepharoseFF的柱中(獲自AmershamBiosciences)，之前該柱子已通過至少三倍于柱容積量的2mMHC1進行平衡。加樣完成后，通過使用至少三倍于柱容積量的2mMHC1平衡柱子，然后使用至少三倍于柱容積量的50mM醋酸鹽氯化鈉緩沖液(pH5.0)沖洗。對于mPEG(20,000)-順丁烯二酰亞胺-G-CSF異構體和支鏈mPEG(20,000)-順丁烯二酰亞胺-G-CSF異構體，使用包含40mM氯化鈉的50mM醋酸鹽氯化鈉緩沖液(pH5.4)以至少十二倍于柱容積的量洗脫mPEG-G-CSF聚合體。對于支鏈mPEG(40,000)-順丁烯二酰亞胺-G-CSF異構體，使用包含20mM氯化鈉的50mM醋酸鹽氯化鈉緩沖液(pH5.4)以至少十二倍于柱容積的量洗脫mPEG-G-CSF聚合體。洗脫溶液每5ml—份，在高效液相色譜分析后收集。2、凝膠滲透色譜法mPEG-G-CSF聚合體用CM瓊脂糖凝膠FF通過CentriconPlus-80過濾裝置濃縮，分子量10，000Da，3,()00rptn25分鐘，從而獲得蛋白質終濃度大約5mg/ml的蛋白質濃縮物。濃縮蛋白質加樣到300mlSephacrylS-100(AmersliamBiosciences)的柱中，之前該柱子已使用至少三倍于柱容積量的10mM醋酸鹽氯化鈉緩沖液(pH5.4)進行平衡。以lml/min的流速對緩沖溶液進行洗脫，以除去蛋白質溶液中的mPEG-G-CSF多聚體，蛋白質按照G-CSF多聚體、PEG-G-CSF、G-CSF二聚物和G-CSF單體的順序，依次洗脫。<實施例5>mPEG-G-CSF聚合體在大鼠體內的壽命和活性評估通過使用8周齡大鼠(SD大鼠，雄性，每一實驗樣品中五只大鼠)評價實施例4和5制備并純化的mPEG-G-CSF聚合體的體內壽命和活性。實驗樣品包括作為載體的PBS載體；按照實施例1到4制備和純化的G-CSFT133C20kDa(Br)(根據韓國專利公布號，將第133位的蘇氨酸用半胱氨酸取代，然后將20kDa的PEG共價偶聯到該半胱氨酸上，從而獲得G-CSF異構體)；商品化的Neuksta(Amgene公司)，有20kDa的PEG被偶聯至N末端；按照實施例1到4制備并純化的本發明所述的異構體，艮卩，N+20kDa(Br)(將半胱氨酸加成到G—CSFN末端(-1C)的蘇氨酸和甲硫氨酸之間，然后將20kDa的支鏈PEG共價結合到該半胱氨酸上，從而獲得G-CSF異構體)；175C+20kDa(Br)(將半胱氨酸加到G-CSF的C末端的174-脯氨酸之后，然后將20kDa的支鏈PEG共價結合到該半胱氨酸上，從而獲得G-CSF異構體)；和175C+40kDa(Br)(將半胱氨酸加到G-CSFC末端的174脯氨酸之后，然后將40kDa的支鏈PEG共價結合到該半胱氨酸上，從而獲得G-CSF異構體)。每個異構體用PBS稀釋，基于給藥當天大鼠的體重以100戰/kg的劑量通過大鼠尾部靜脈給藥。實驗當天僅給藥一次。為了提供分析樣品，基于實驗群的組成，按預定的時間從尾部靜脈收集200^血。給藥之前收集的血樣作為空白樣。對給藥后7、24、48和72小時收集的血樣進行PD/PK分析。對每個血樣中的嗜中性細胞進行計數來測定其體內活性。另外，將每個血樣放入EDTA抗凝血劑管中進行離心分離以分離血漿。使用人G-CSFELISA試劑盒(Quantokine，R&DSystems)測量血衆中的G-CSF濃度。每個樣品依次稀釋至線性區域從而在試劑盒中檢測濃度。每個樣品檢測兩次。結果如下表3所示。如表3所看到的，本發明所述的將半胱氨酸加到N末端或C末端的人粒細胞集落刺激因子異構體與聚乙二醇偶聯，其體內活性和體內壽命均增加。特別是N+20kDA(Ik)和175C+20kDa(Br)在給藥后24小時與對照組相比，其活性大大增強。另外175C+40kDa(Br)在給藥后24小時與對照組相比，其活性增強并類似于嗜中性粒細胞產物的外觀。而175C+40kDa(Br)可以維持活性至給藥后72小時。特別地，175C+40kDa(Br)的壽命大大延長，而175C+20kDa(Bi:)和N+20kDa(Br)的活性明顯增強。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>工業實用性從前面可以看出，本發明所述的人粒細胞集落刺激因子異構體的體內壽命大大延長，而且能被用于治療或預防各種人粒細胞集落刺激因子相關的疾病。通過目前最實用和最優的實施例對本發明進行了描述，但本發明并不局限于上述實施例和附圖。相反，本發明包括任何在隨附的權利要求中所定義的實質和范圍內的修改和變化。權利要求1.一種粒細胞集落刺激因子異構體，即在氨基酸序列No.1所示的人粒細胞集落刺激因子N末端的蘇氨酸之前或在C末端的脯氨酸之后加入至少一種氨基酸，其中加入的氨基酸至少有一個是半胱氨酸，并且這些半胱氨酸中至少有一個與聚乙二醇偶聯。2.如權利要求1所述的粒細胞集落刺激因子異構體，其中所述人粒細胞集落刺激因子的每個末端加有1~12個氨基酸。3.如權利要求1所述的粒細胞集落剌激因子異構體，其中所述人粒細胞集落刺激因子上加有一個半胱氨酸殘基。4.如權利要求3所述的粒細胞集落刺激因子異構體，其中所述聚乙二醇為支鏈聚乙二醇，且分子量為20kDa40kDa。5.如權利要求4所述的粒細胞集落刺激因子異構體，其中所述半胱氨酸為175C，且被加到C末端。6.如權利要求1所述的粒細胞集落刺激因子異構體，其中所述人粒細胞集落刺激因子在與聚乙二醇偶聯之前，至少有一個人粒細胞集落刺激因子的氨基酸被其他氨基酸取代。7.—種藥物組合物，包含由權利要求1至6中任何一項所述的人粒細胞集落刺激因子異構體和藥學上可接受的載體。8.—種編碼人粒細胞集落刺激因子異構體蛋白質的基因，所述人粒細胞集落刺激因子異構體為在權利要求1至6任一項所述的人粒細胞集落刺激因子異構體的N末端或C末端加入半胱氨酸。9.一種用作引物的寡脫氧核糖核苷酸，用于修飾人粒細胞集落刺激因子的氨基酸序列使之成為權利要求1至6中任何一項所述的人粒細胞集落刺激因子異構體。10.如權利要求9所述的寡脫氧核糖核苷酸，其中所述引物是由序列號2至7任何一個所示的寡脫氧核糖核苷酸。全文摘要本發明公開的是一種新型的生理活性蛋白，該蛋白是一種人粒細胞集落刺激因子異構體，其構建目的是為了增加人粒細胞集落刺激因子在體內的壽命。該人粒細胞集落刺激因子異構體包含一條多肽鏈和與之偶聯的非蛋白聚合體聚乙二醇(PEG)。選擇多肽鏈中的一個特異位點使聚乙二醇連接到該位點同時不影響蛋白的活性。該位點的氨基酸被修改為半胱氨酸，聚乙二醇被共價結合到該修改位點。同時還公開了一種包含該異構體的藥物組合物、編碼該異構體的基因和用于修飾氨基酸序列的一種引物。文檔編號A61K47/48GK101198357SQ200680021159公開日2008年6月11日申請日期2006年6月13日優先權日2005年6月13日發明者高亨坤申請人:Cj第一制糖株式會社