的原有活性，延長該蛋白質在體內的半衰期，且免疫原性低。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供人粒細胞集落刺激因子的重組融合蛋白，具體涉及一種長效的重組人粒細胞集落刺激因子及其制備方法。本發明制得的重組融合蛋白在保持人粒細胞集落刺激因子的原有活性的前提下，能延長該蛋白質在體內的半衰期，且比同類化學修飾的長效化人粒細胞集落刺激因子產品具有更低的免疫原性。
[0009]本發明的進一步目的是提供所述的重組融合蛋白在用于制備治療放化療或其他原因造成的中性粒細胞減少癥以及骨髓抑制的藥物中的用途。
[0010]本發明要解決的關鍵技術問題是在延長重組人粒細胞集落刺激因子的體內半衰期的同時保持其體內外活性。
[0011]本發明解決的技術方案是采用重組人粒細胞集落因子(rhG-CSF)和人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基端118位到145位的氨基酸所組成的小肽(CTP)融合表達；該融合蛋白可在畢赤酵母中高效表達，所述制備工藝簡單，可用于大規模的藥物級融合蛋白的生產制備。
[0012]具體的，本發明的一種長效的重組人粒細胞集落刺激因子，其特征在于，由一個重組人粒細胞集落刺激因子和一個或多個人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基端118位到145位的氨基酸所組成的小肽(CTP)融合表達制成長效融合蛋白。
[0013]所述融合蛋白中人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基端118位到145位的氨基酸所組成的小肽(CTP)的氨基酸序列為SEQ ID N0.1所示。
[0014]SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID N0.1)。
[0015]所述重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)的氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。
[0016]TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ⑶GAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIffQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQ ID N0.2)
[0017]本發明在提供上述長效重組人粒細胞集落刺激因子融合蛋白的同時，提供了編碼上述長效人粒細胞集落刺激因子融合蛋白的相關核苷酸序列。
[0018]本發明中，編碼所述長效重組人粒細胞集落刺激因子融合蛋白中的人絨毛膜促性腺激素(hCG) β亞基端118位到145位的氨基酸所組成的小肽(CTP)的核苷酸序列如SEQID N0.3 所示:
[0019]agctccagcagcaaggcccctccaccttccctgcccagtccaagccgactccctgggccctccgatacaccaattctgccacag(SEQ ID N0.3)
[0020]本發明中，所述重組人粒細胞集落刺激因子由一個重組人粒細胞集落刺激因子和一至多個CTP多肽融合表達制成；其組合方式包括但不限于:N-端的一個CTP和C-端的一個rhG-CSF融合(CTP-rhG-CSF)，N-端兩個CTP和C-端的一個rhG-CSF融合(CTP-CTP-rhG-CSF)，N-端的 rhG-CSF 和 C-端的一個 CTP 融合(rhG-CSF-CTP)，N-端的rhG-CSF和C-端的兩個CTP融合，N-端的一個CTP及C-端的一個CTP共同與rhG-CSF融合(CTP-rhG-CSF-CTP)，或，N-端的一個CTP及C-端的兩個CTP共同與rhG-CSF融合(CTP-rhG-CSF-CTP-CTP)。
[0021]本發明中最優組合方式是N-端的一個CTP及C-端的兩個CTP共同與rhG-CSF融合表達制成的融合蛋白CTP-rhG-CSF-CTP-CTP。
[0022]本發明中，編碼所述長效重組人粒細胞集落刺激因子融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.4 ?9 所示。
[0023]N-端的一個 CTP 和 C-端的一個 rhG-CSF 融合(CTP-rhG-CSF):
[0024]agctccagcagcaaggcccctccaccttccctgcccagtccaagccgactccctgggccctccgatacaccaattctgccacagacccccctgggccctgccagctccctgccccagagcttcctgctcaagtgcttagagcaagtgaggaagatccagggcgatggcgcagcgctccaggagaagctgtgtgccacctacaagctgtgccaccccgaggagctggtgctgctcggacactctctgggcatcccctgggctcccctgagcagctgccccagccaggccctgcagctggcaggctgcttgagccaactccatagcggccttttcctctaccaggggctcctgcaggccctggaagggatctcccccgagttgggtcccaccttggacacactgcagctggacgtcgccgactttgccaccaccatctggcagcagatggaagaactgggaatggcccctgccctgcagcccacccagggtgccatgccggccttcgcctctgctttccagcgccgggcaggagggtcctagttgcctcccatctgcagagcttcctggaggtgtcgtaccgcgttctacgccaccttgcccagccctga(SEQ ID N0.4)
[0025]N-端兩個 CTP 和 C-端的一個 rhG-CSF 融合(CTP-CTP-rhG-CSF)
[0026]agetccagcagcaaggcccctccaccttccctgcccagtccaagccgactccctgggccctccgatacaccaattctgccacagagctccagcagcaaggcccctccaccttccctgcccagtccaagccgactccctgggccctccgatacaccaattctgccacagacccccctgggccctgccagctccctgccccagagcttcctgctcaagtgcttagagcaagtgaggaagatccagggcgatggcgcagcgctccaggagaagctgtgtgccacctacaagctgtgccaccccgaggagctggtgctgctcggacactctctgggcatcccctgggctcccctgagcagctgccccagccaggccctgcagctggcaggctgcttgagccaactccatagcggccttttcctctaccaggggctcctgcaggccctggaagggatctcccccgagttgggtcccaccttggacacactgcagctggacgtcgccgactttgccaccaccatctggcagcagatggaagaactgggaatggcccctgccctgcagcccacccagggtgccatgccggccttcgcctctgctttccagcgccgggcaggagggtcctagttgcctcccatctgcagagcttcctggaggtgtcgtaccgcgttctacgccaccttgcccagccctga(SEQ ID N0.5)
[0027]N-端的 rhG-CSF 和 C-端的一個 CTP 融合(rhG-CSF-CTP)
[0028]acccccctgggccctgccagctccctgccccagagcttcctgctcaagtgcttagagcaagtgaggaagatccagggcgatggcgcagcgctccaggagaagctgtgtgccacctacaagctgtgccaccccgaggagctggtgctgctcggacactctctgggcatcccctgggctcccctgagcagctgccccagccaggccctgcagctggcaggctgcttgagccaactccatagcggccttttcctctaccaggggctcctgcaggccctggaagggatctcccccgagttgggtcccaccttggacacactgcagctggacgtcgccgactttgccaccaccatctggcagcagatggaagaactgggaatggcccctgccctgcagcccacccagggtgccatgccggccttcgcctctgctttccagcgccgggcaggagggtcctagttgcctcccatctgcagagcttcctggaggtgtcgtaccgcgttctacgccaccttgcccagcccagctccagcagcaaggcccctccaccttccctgcccagtccaagccgactccctgggccctccgatacaccaattctgccacagtga(SEQ ID N0.6)
[0029]N-端的rhG-CSF和C_端的兩個CTP融合
[0030]acccccctgggccctgccagctccctgccccagagcttcctgctcaagtgcttagagcaagtgaggaagatccagggcgatggc