gcagcgctccaggagaagctgtgtgccacctacaagctgtgccaccccgaggagctggtgctgctcggacactctctgggcatcccctgggctcccctgagcagctgccccagccaggccctgcagctggcaggctgcttgagccaactccatagcggccttttcctctaccaggggctcctgcaggccctggaagggatctcccccgagttgggtcccaccttggacacactgcagctggacgtcgccgactttgccaccaccatctggcagcagatggaagaactgggaatggcccctgccctgcagcccacccagggtgccatgccggccttcgcctctgctttccagcgccgggcaggaggggtcctagttgcctcccatctgcagagcttcctggaggtgtcgtaccgcgttctacgccaccttgcccagcccagctccagcagcaaggcccctccaccttccctgcccagtccaagccgactccctgggccctccgatacaccaattctgccacagagctccagcagcaaggcccctccaccttccctgcccagtccaagccgactccctgggccctccgatacaccaattctgccacagtga(SEQ ID N0.7)
[0031]N-端的一個 CTP 及 C-端的一個 CTP 共同與 rhG-CSF 融合(CTP-rhG-CSF-CTP):
[0032]Agctccagcagcaaggcccctccaccttccctgcccagtccaagccgactccctgggccctccgatacaccaattctgccacagacccccctgggccctgccagctccctgccccagagcttcctgctcaagtgcttagagcaagtgaggaagatccagggcgatggcgcagcgctccaggagaagctgtgtgccacctacaagctgtgccaccccgaggagctggtgctgctcggacactctctgggcatcccctgggctcccctgagcagctgccccagccaggccctgcagctggcaggctgcttgagccaactccatagcggccttttcctctaccaggggctcctgcaggccctggaagggatctcccccgagttgggtcccaccttggacacactgcagctggacgtcgccgactttgccaccaccatctggcagcagatggaagaactgggaatggcccctgccctgcagcccacccagggtgccatgccggccttcgcctctgctttccagcgccgggcaggagggtcctagttgcctcccatctgcagagcttcctggaggtgtcgtaccgcgttctacgccaccttgcccagcccagctccagcagcaaggcccctccaccttccctgcccagtccaagccgactccctgggccctccgatacaccaattctgccacagtga(SEQ ID N0.8)
[0033]N-端的一個 CTP 及 C-端的兩個 CTP 共同與 rhG-CSF 融合(CTP-rhG-CSF-CTP):
[0034]AGTTCATCATCAAAAGCACCTCCTCCATCATTGCCATCCCCATCAAGATTGCCTGGTCCATCAGATACTCCTATATTGCCTCAAACACCTTTGGGTCCAGCATCTTCATTGCCACAATCATTTTTGTTGAAGTGTTTGGAACAAGTAAGAAAGATCCAAGGTGACGGTGCTGCATTGCAAGAAAAGTTGTGTGCTACTTACAAGTTGTGCCATCCTGAAGAATTAGTTTTGTTAGGTCACTCTTTGGGTATTCCTTGGGCACCATTATCCAGTTGTCCATCACAAGCTTTGCAATTAGCAGGTTGCTTGTCCCAATTGCATAGTGGTTTGTTTTTATACCAAGGTTTGTTACAAGCCTTAGAAGGTATTTCACCTGAATTGGGTCCAACCTTAGACACTTTGCAATTAGATGTTGCAGACTTCGCCACTACAATATGGCAACAAATGGAAGAATTGGGTATGGCCCCTGCTTTACAACCAACACAAGGTGCTATGCCTGCATTTGCCTCCGCTTTCCAAAGAAGAGCCGGTGGTGTTTTGGTAGCTTCTCATTTGCAATCATTCTTAGAAGTCTCTTACAGAGTTTTGAGACACTTAGCACAACCATCTTCATCCAGTAAAGCCCCACCTCCATCCTTGCCTTCTCCATCAAGATTACCTGGTCCAAGTGATACCCCTATATTACCACAATCTTCATCCAGTAAGGCTCCTCCACCTTCTTTACCATCCCCTTCCAGATTGCCAGGTCCTTCAGACACTCCTATTTTGCCACAATGA(SEQ ID N0.9)
[0035]本發明還提供了含有所述重組人粒細胞集落刺激因子和所述CTP短肽的核苷酸序列的載體。
[0036]本發明還提供了含有所述重組人粒細胞集落刺激因子和所述CTP短肽的核苷酸序列的的宿主細胞。
[0037]本發明中，所述的宿主細胞包括但不限于大腸桿菌，畢赤酵母，和哺乳動物細胞；其中最優的是畢赤酵母。
[0038]本發明的長效的重組人粒細胞集落刺激因子通過下述方法制備；
[0039](I)構建重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白表達載體:
[0040]人工化學合成帶酶切位點及信號肽的重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白編碼基因序列，并將其克隆至pUC57simple質粒載體中，得到含有融合蛋白編碼基因的質粒(由南京金斯瑞生物技術有限公司完成)；
[0041]取pUC57simple-rhG-CSF-CTP3 的質粒及 pPICZaA 表達質粒，采用 XhoI 及 NotI 限制性核酸內切酶進行雙酶切，酶切產物采用I %瓊脂糖凝膠電泳分離，采用膠回收試劑盒回收目的片段；
[0042]在T4DNA連接酶催化下進行連接反應，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5 α，涂布于Zeocin抗性LB平板培養，挑取單克隆，擴大培養后抽提質粒，采用NcoI及XhoI雙酶切；
[0043]酶切產物采用I %瓊脂糖凝膠電泳分離,觀察酶切產物的大小,并測序；
[0044](2)重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白的表達
[0045]制備感受態畢赤酵母GSl 15細胞，將測序正確的表達重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白的表達載體PPICZaA-rhG-CSF_CTP3用限制性內切酶SacI進行單酶切線性化，并收集4000bp處的片段；然后將I線性化的轉化pPICZaA-rhG-CSF-CTP3質粒在場強下轉化感受態畢赤酵母GSl 15細胞，挑取單克隆轉化子備用；
[0046]將單克隆轉化子轉接入BMGY培養基連續培養后，取上清電泳檢測結果顯示，目的蛋白表達，大小與預期相符；
[0047](3)重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白的體外活性測定
[0048]選用G-CSF依賴細胞株NFS60，以MTT法測定生物學活性，結果如圖3所示，rhG-CSF-CTP3的體外生物活性與G-CSF相似，顯著高于同類PEG產品Neulasta。
[0049](4)重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白的體內活性測定
[0050]采用環磷酰胺(CTX)建立小鼠白細胞低下模型測定融合蛋白體內活性結果顯示，制得的融合蛋白rhG-CSF-CTP3與Neulasta及每天注射瑞白的藥效程度相當,在注射7天后仍能保持較好的藥效(如圖4所示)。
[0051]本發明進一步提供了上述長效人粒細胞集落刺激因子在用于制備治療放化療或其他原因造成的中性粒細胞減少癥，骨髓抑制等的治療藥物中的用途。
[0052]本發明的優點在于，
[0053]制得的長效的重組人粒細胞集落刺激因子不會引入任何異源物質，免疫原性相對于化學修飾后蛋白質更低；而且重組CTP融合蛋白為純粹的基因工程表達產品，無需修飾劑，能較好地保持原有蛋白質的生物活性，并且產物得率相比化學修飾蛋白質有明顯提高，使得整個生產成本大幅度降低。
【附圖說明】
[0054]圖1:重組表達載體的酶切鑒定。
[0055]圖2，重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白誘導表達的SDS-PAGE圖譜，
[0056]其中，1，甲醇誘導組；2，甲醇誘導組；3，對照組，4，對照組。
[0057]圖3，重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白的體外活性測定。
[0058]圖4，重組人粒細胞集落刺激因子rhG-CSF與CTP融合蛋白的體內活性測定。
【具體實施方式