專利名稱:一種重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的純化方法
技術領域:
本發明涉及一種重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的純化方法。屬于蛋 白質純化領 域,是簡單高效地制備高純度,高收率的藥用rhGM-CSF原液的方法。
背景技術:
粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)來源于激活的T細胞、巨噬細胞、成纖維 細胞和內皮細胞,GM-CSF促使造血細胞的增殖和成熟;也能增強抗體依賴的細胞毒活性、 細胞表面受體抗原表達,并刺激細胞因子分泌;特別是能增強腫瘤殺傷細胞因子如腫瘤壞 死因子(TNF) a和IL-10的釋放,而TNFa和IL-1 0有很強的抗病毒活性。目前重組人 GM-CSF臨床用于治療因放化療引起的白細胞減少癥,以及用于免疫佐劑。目前報道的關于GM-CSF的專利主要針對以下幾點(1)通過特別的菌體破碎步驟 富集GM-CSF 如美國專利4912200 ; (2)采用親和層析方法純化,如美國專利5391706 ; (3) 采用分泌型表達宿主菌,如中國專利(申請號03137202. 3),采用畢赤酵母分泌表達系統, 目標蛋白不需要復性,生物學比活性可達到3.4X107IU/mg;中國專利(申請號98106057) 報道了分泌型表達的大腸桿菌表達系統,目的蛋白表達量占胞周質蛋白的40% ;中國專利 (申請號200810114685. 7)報道也使用畢赤酵母作為表達系統。以上這些報道,大多是強調目的蛋白的表達量和生物學活性,但是對于如何獲得 純度高,相關雜質少的純蛋白,卻基本沒有提及。美國專利5391706報道給出了純化方案, 但這個純化方案包括了 QAE,親和層析,硫銨沉淀,凝膠過濾,反相色譜層析等多個步驟,這 一純化方案顯然不符合環保,經濟等要求。尤其是反相色譜法純化蛋白質,需要使用大量的 有機溶劑,不僅價格昂貴,而且有殘余溶劑的問題,蛋白質也容易變性失活。純化產生的有 機溶劑,增加廢水污染處理的難度,而且帶來潛在的環境污染風險。本專利要解決的恰恰是如何在不使用任何有機溶劑的情況下,獲得高純度的 GM-CSF純品,滿足國外藥典中對于本品的質量標準要求。
發明內容
為了解決上述問題,本發明的目的在于提供了一種重組人粒細胞巨噬細胞刺激因 子的純化方法,本發明具有工藝簡便快速,步驟少,收率高,純度高的特點,在兼顧環保的同 時,提高藥品的安全性、可控性和有效性,適合大規模生產。為達到上述的目的,本發明采用如下技術方案一種重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的純化方法,采用的大腸桿菌表達重組人 粒細胞巨噬細胞刺激因子rhGM-CSF為包涵體形式,包括下述純化步驟包涵體超濾復性 -Capto S陽離子柱層析一Superdex 75凝膠過濾層析一得到藥用重組人粒細胞巨噬細胞 刺激因子rhGM-CSF原液。所述超濾復性包括如下步驟①取發酵包涵體溶于包涵體溶解液;②將包涵體溶 解液加入復性液中混勻,泵入超濾系統儲罐中開始超濾,TMP不大于50psig,要求洗濾液與透過液速度相同,稀釋復性35 60分鐘;③稀釋完畢濃縮收樣,按6ml/L加5M醋酸鹽調 pH5. 0士0. 05,10000rpm、10°C離心 30min,收集上清。所述的包涵體溶解液配方為鹽酸胍6M ;pH8. 5士0. 05的Tris_HC150mM ; Nacl40mMo所述的復性液配方為鹽酸胍4M ;pH8. 5士0. 05Tris-HC150mM ;Nacl20mM。所述的Capto S陽離子柱層析步驟中,采用經超濾復性后的樣品,進行選擇性洗脫 目標蛋白,洗脫條件為50mM醋酸鹽和pH為6. 75 士 0. 05的0. 2M NaCl。所述的Superdex 75凝膠過濾層析步驟中,洗脫液采用20mM磷酸鹽緩沖液。本發明的有益效果是(1)采用超濾復性,以包涵體干重計算,復性率可達到55%以上。(2)工藝簡單,步驟少嚴格控制復性中采用的還原和氧化條件,使復性后樣品的 純度達到80%以上;樣品經過第1步柱層析(Capto S柱)后,電泳純度和HPLC反相純度 已經達到98%以上,殘余菌體蛋白和殘余細菌內毒素含量均達到藥典標準要求,也就是說 1步柱層析將樣品純化至超過《中國藥典》現行版的藥用要求;樣品只經過2步純化,即可得 到符合國際標準的原液。(3)原液質量反相色譜純度(EP)達到98%以上,排阻色譜純度達到99%以上, 殘余工程菌蛋白含量低于0. 005%,低于國家標準的10分之1,細菌內毒素每毫克低于 0. 25EU,僅相當于國家標準的120分之1。(4)提高藥品的安全性、可控性和有效性,適合大規模生產,工藝單批規模可達到 50g以上。本發明的另一個明顯優勢是完全避免了強有機溶劑在生產工藝中的使用。乙腈 和甲醇是一種常見的純化用試劑,以達到蛋白質精細純化,獲得高純度的目的。當在規模化 生產中使用反相色譜方法進行蛋白的純化時,乙腈和甲醇等有機溶劑的用量很大,它們都 屬于有毒性的溶劑,大量使用有機溶劑帶來一系列的問題不僅價格昂貴,生產成本過高; 樣品中的殘余溶劑可能帶來安全性隱患;廢水的處理會產生大量的環保處理費用;如排放 到環境中,將對環境帶來污染。本工藝在不降低任何收率和純度指標的情況下,避免使用有 機溶劑,優點突出。
圖1是本發明rhGM-CSF原液SDS-PAGE (還原型SDS-PAGE)銀染法電泳圖譜;
圖2是本發明rhGM-CSF原液SDS-PAGE (非還原型SDS-PAGE)銀染法電泳圖譜;圖3是本發明rhGM-CSF原液HPLC-RPC圖譜;圖4是本發明rhGM-CSF原液HPLC-SEC圖譜;圖5是本發明rhGM-CSF原液SDS-PAGE (非還原型SDS-PAGE)考染法電泳圖譜;圖6是本發明rhGM-CSF原液SDS-PAGE (還原型SDS-PAGE)考染法電泳圖譜。
具體實施例方式下面通過具體實施例,對本發明作進一步的描述。本實施例的一種重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的純化方法,采用的大腸桿菌表達重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子rhGM-CSF為包涵體形式,首先進行包涵體超濾 復性①取發酵包涵體(750g士 10%)溶于包涵體溶解液(鹽酸胍6M ;pH8. 5士0.05的 Tris-HC150mM ;Nacl40mM)中,加還原劑后充氮避光2小時備用。用0. 5NNa0H溶液清洗 MaxCell UFP-3_C_65超濾系統30min,清洗后用注射水沖洗至中性。②稀釋復性將包涵 體溶解液加入復性液(鹽酸胍4M ;pH8. 5士0. 05Tris-HC150mM ;Nacl20mM)中混勻,泵入 超濾系統儲罐中開始超濾,TMP不大于50psig,要求洗濾液與透過液速度相同,(洗濾液 為pH8. 5士0. 05Tris-HCl 50mM ;恒體積透析一邊超濾流出超濾透出液,一邊往復性罐中 流加等體積的洗濾液,目的是緩慢地降低復性液中鹽酸胍、DTT還原劑等的濃度)稀釋復 性35 60分鐘。③收樣稀釋完畢濃縮收樣,按6ml/L加5M醋酸鹽調pH 5.0士0.05。 10000rpm、10°C離心30min,收集上清,本步驟得到的樣品液電泳純度已達到80%以上。反 相色譜純度達到80%以上。復性液收率蛋白總量(掃描計)已不低于包涵體重量的8%, 以包涵體干重計算,復性率不低于55%。其次進行CaptoS陽離子柱層析(GM I柱層析)①小100GM I柱層析用0. 5NNa0H 按200士 10% cm/h流速清洗30min,用注射用水按相同流速洗至中性,后用50mM醋酸鹽緩 沖液(pH5. 0 士 0. 05),按300 士 10% cm/h流速平衡I柱約10倍柱體積。②將超濾復性后的樣品按300士 10% cm/h流速上樣,上樣完畢,用50mM醋酸鹽 +0. 2M NaCl (PH6. 75士0.05)液按相同流速洗脫,收集目標峰,本步驟得到的I柱后樣品,電 泳及液相色譜純度均達到98%以上。最后進行Superdex 75凝膠過濾層析(GMII柱層析)① 200GMII柱層析用 0. 5NNa0H按20 士 10% cm/h流速清洗30min,用20mM磷酸鹽緩沖液按20 士 10% cm/h流速 平衡II柱4倍柱體積。以相同流速上經I柱處理后的樣品。②上樣完畢,用20mM磷酸鹽緩沖液按相同流速洗脫,收集目標峰,取樣并送檢, rhGM-CSF原液SDS-PAGE (還原型SDS-PAGE)銀染法和SDS-PAGE (非還原型SDS-PAGE)銀染 法電泳純度均符合歐洲藥典的要求,如圖1、2所示。反相色譜純度(EP)法達到98. 92%, 如圖3所示。排阻色譜純度達到99. 98%,如圖4所示。SDS-PAGE (還原型SDS-PAGE)考染 法和SDS-PAGE (非還原型SDS-PAGE)考染法電泳純度均達到99%以上,高于中國藥典的標 準,如圖5,6所示。本步驟后得到的得到藥用重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子rhGM-CSF原液,排阻 色譜純度達到99%以上,反相色譜純度(EP)法達到98%以上,殘余工程菌蛋白含量低于 0. 005%,低于國家標準的10分之1,細菌內毒素每毫克低于0. 25EU,僅相當于國家標準的 120分之1。
權利要求
一種重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的純化方法,采用的大腸桿菌表達重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子rhGM-CSF為包涵體形式,其特征在于包括下述純化步驟包涵體超濾復性→Capto S陽離子柱層析→Superdex 75凝膠過濾層析→得到藥用重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子rhGM-CSF原液。
2.如權利要求1所述的一種重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的純化方法,其特征在 于所述超濾復性包括如下步驟①取發酵包涵體溶于包涵體溶解液;②將包涵體溶解液 加入復性液中混勻,泵入超濾系統儲罐中開始超濾,TMP不大于50psig,要求洗濾液與透 過液速度相同,稀釋復性35 60分鐘;③稀釋完畢濃縮收樣,按6ml/L加5M醋酸鹽調 pH5. 0士0. 05,10000rpm、10°C離心 30min,收集上清。
3.如權利要求2所述的一種重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的純化方法,其特征在于 所述的包涵體溶解液配方為鹽酸胍6M ;pH8. 5士0. 05的Tris_HCl 50mM ;Nacl 40mM。
4.如權利要求2所述的一種重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的純化方法,其特征在于 所述的復性液配方為鹽酸胍4M;pH8. 5士0. 05Tris-HCl 50mM ;Nacl 20mM。
5.如權利要求1所述的一種重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的純化方法,其特征在 于所述的Capto S陽離子柱層析步驟中,采用經超濾復性后的樣品,進行選擇性洗脫目標 蛋白,洗脫條件為50mM醋酸鹽和pH為6. 75 士 0. 05的0. 2M NaCl。
6.如權利要求1所述的一種重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的純化方法,其特征在 于所述的Superdex 75凝膠過濾層析步驟中,洗脫液采用20mM磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發明公開了一種重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的純化方法,采用的大腸桿菌表達重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子rhGM-CSF為包涵體形式,包括下述純化步驟包涵體超濾復性→Capto S陽離子柱層析→Superdex 75凝膠過濾層析→得到藥用重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子rhGM-CSF原液。本發明具有工藝簡便快速,步驟少,收率高,純度高的特點,在兼顧環保的同時,提高藥品的安全性、可控性和有效性,適合大規模生產。
文檔編號C07K1/16GK101830976SQ20101017069
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月7日 優先權日2010年5月7日
發明者何艷, 余東新, 孫黎, 楊美花, 林崧, 蔡慧麗, 裴廣強 申請人:廈門特寶生物工程股份有限公司