重組因子viii制劑的制作方法
【專利說明】重組因子Vl I I制劑
[0001] 背景
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請號61/779, 495和2013年8月 23日提交的美國臨時申請號61/869, 191的優先全，其全部內容通過引用在此并入本申請。
[0003] 甲型血友病是由凝血因子VIII( "FVIII"）缺陷導致并且其是最常見的遺傳性凝 血疾病，其預計發生率為每5000個男性中有1個男性。目前對甲型血友病的治療涉及靜脈 內注射重組的或血漿來源的人FVIII。FVIII的注射應出血事件的需求做出或作為預防性 治療每周施用2至4次。盡管多項研究顯示預防性治療減少甲型血友病的并發癥，需要頻 繁靜脈內注射成為了阻礙患者依從性的屏障并影響患者的生活質量。需要頻繁注射主要是 由于FVIII的循環半衰期較短，其在患者體內為12至14小時。
[0004] 共價加入長鏈聚合物如聚乙二醇（"PEG"）已顯示出使蛋白療法的半衰期增加， PEG化是將PEG分子與蛋白共價結合。
[0005] 美國專利號5, 763, 401 (Nayar)披露了穩定的、無白蛋白的、全長重組FVIII 的凍干制劑（"FL-rFVIII"）。美國專利號 7, 632, 921 (Pan 等）和 Mei 等，Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VII for hemophilia A treatment, 116BL00D 270-279(2010)披露了與一個或多個生物相容性聚合物如PEG共 價結合的半胱氨酸增加的FVIII突變體。美國專利號7, 087, 723(Besman等）涉及無白 蛋白的 FVIII 制劑。Ostefberg.等，Development of a freeze-drieel albumin-free formulation of recombinant factor VIII SQ, Pharmaceutical Research, vol. 14, No ? 7 (1997)，pp. 892-898 和 等，B-domain deleted recombinant factor VIII formulation and stability, Seminars in Hematology, vol. 38, No. 2, suppl. 4(Apr il 2001)，pp. 40-43討論了 B-結構域缺失的FVIII凍干制劑，包括含有氯化鈉、蔗糖、 組氨酸、脫水氯化鈣和聚山梨醇酯80的制劑。Fatouros等，Recombinant factor VIII SQ-influence of oxygen, metal ions, pH and ionic strength on its stability in aqueous solution, Int.J. of Pharmaceutics 155(1997) 121-131 披露了rFVIII SQ在不含 白蛋白的溶液中貯存的性質。W02011/027152(JeZek等）披露了 FVIII的制劑。
[0006] 概述
[0007] 在一個實施方式中，本發明涉及一種rFVIII制劑，所述制劑包括：(a)范圍從約 ImM至約5mM的二價陽離子；(b)范圍從約150mM至約250mM的氯化鈉或氯化鉀；（c)范圍 從約50ppm至約200ppm的非離子表面活性劑；和（d)范圍從約100IU/ml至約5000IU/ml 的rFVIII，其中所述rFVIII包含將在SEQ ID NO: 3的氨基酸序列中的一個或多個非半胱氨 酸殘基用半胱氨酸殘基取代的氨基酸序列；其中所述rFVIII制劑具有范圍從約pH 6. 0至 約pH 7. 5的pH。在另一個實施方式中，本發明涉及一種rFVIII制劑，所述制劑包括：(a) 范圍從IOmM至IOOmM的MOPS ; (b)范圍從以重量計0. 5%至10%的糖或糖醇；（c)范圍從 0. 5mM至20mM的二價陽離子；（d)范圍從IOmM至IOOmM的氯化鈉或氯化鉀；（e)范圍從50 至150ppm的非離子表面活性劑；和（f)范圍從約100IU/ml至約1500IU/ml的rFVIII ;其 中所述rFVIII制劑含有以重量計小于5.0%的具有伯胺或仲胺基團的rFVIII以外的成分。
[0008] 在又一個實施方式中，本發明涉及一種rFVIII制劑，所述制劑包括：(a)范圍從 IOmM 至 IOOmM 的 MOPS ; (b)范圍從 150mM 至 300mM 的 NaCl ; (c)范圍從 ImM 至 20mM 的二價 陽離子；和（d)范圍從約100IU/ml至約5000IU/ml的非綴合的rFVIII。在又一個實施方 式中，本發明涉及一種rFVIII制劑，所述制劑包括：(a)范圍從IOmM至IOOmM的MOPS或組 氨酸；（b)范圍從25mM至200mM的NaCl ; (c)范圍從ImM至20mM的二價陽離子；和⑷范 圍從約l〇〇IU/ml至約5000IU/ml的綴合的rFVIII。在又一個實施方式中，本發明涉及一 種rFVIII制劑，所述制劑包括：（a)約OmM，或范圍從約ImM至約20mM的組氨酸；(b)范圍 從約0. 5 %至20%的鹿糖或海藻糖；（c)范圍從約ImM至約5mM的二價陽離子；（d)約OmM， 或范圍從約IOmM至約50mM的氯化鈉；（e)約OmM，或范圍從約20ppm至約80ppm的非離子 表面活性劑；（f)約〇%，或范圍從約1. 0%至約5. 0%的甘氨酸，和（g)范圍從約100IU/ml 至約5000IU/ml的綴合的rFVIII ;其中所述rFVIII制劑具有范圍從約pH 6. 0至約pH 7. 5 的pH。
[0009] 附圖簡述
[0010] 本領域技術人員將理解下文描述的附圖僅用于說明目的。這些附圖并非旨在以任 何方式限制本申請中提供的發明的范圍或權利要求的范圍。
[0011] 圖1示意性顯示了全長人因子VIII和BDD-rFVIII的結構域。
[0012] 圖2是顯示具有由二硫鍵連接的結構域的BDD-rFVIII突變體相對濁度的圖。該 濁度在包含濃度增加的氯化鈉的緩沖液中檢測。濁度在A34^下測定。除了氯化鈉以外，緩 沖液中含有20mM組氨酸、2. 5mM氯化鈣、29mM蔗糖、293mM甘氨酸和80ppm聚山梨醇酯80。
[0013] 圖3是顯示具有由二硫鍵連接的結構域的BDD-rFVIII突變體相對濁度的圖。該 濁度在包含濃度增加的聚山梨醇酯80的緩沖液中檢測。濁度在A34toni下測定。除了聚山梨 醇酯80以外，緩沖液中含有20mM組氨酸、30mM氯化鈉、2. 5mM氯化鈣、29mM蔗糖和293mM甘 氨酸。
[0014] 圖4是顯示具有由二硫鍵連接的結構域的BDD-rFVIII突變體相對濁度的圖。該 濁度在包含濃度增加的人血清白蛋白（"HSA"）的緩沖液中檢測。濁度在A34teni下測定。緩 沖液中含有20mM組氨酸、30mM氯化鈉、2. 5mM氯化鈣、29mM蔗糖、293mM甘氨酸和80ppm聚 山梨醇酯80。
[0015] 圖5是顯示具有由二硫鍵連接的結構域的BDD-rFVIII突變體相對濁度的圖。該 濁度在包含濃度增加的氯化鈉與聚山梨醇酯80和has組合的緩沖液中檢測。濁度在A34toni下測定。除了氯化鈉、HSA和聚山梨醇酯80以外，緩沖液中含有20mM組氨酸、2. 5mM氯化 鈣、29mM蔗糖和293mM甘氨酸。
[0016] 圖6顯示了在加入賦形劑前后具有二硫鍵連接的結構域的BDD-rFVIII突變體在 溶液中的澄清度變化情況。從左至右：（1)賦形劑的組合（HSA、氯化鈉和聚山梨醇酯80)、 (2)HSA、（3)氯化鈉、（4)聚山梨醇酯80、和（5)加入HSA、聚山梨醇酯80和氯化鈉之前。
[0017] 圖7是顯示全長FVIII在組氨酸、MOPS和TEA緩沖液中在40°C下貯存7天的液體 穩定性的圖。
[0018] 圖8是顯示rFVIII在MOPS和組氨酸緩沖液中在25°C下穩定性的圖。
[0019] 圖9是顯示PEG化的BDD-rFVIII結構的圖。由A3區伸出的鏈表示PEG分子。
[0020] 圖10是顯示氯化鈉對于PEG化的BDD-rFVIII在23°C下貯存6天的效能回收影響 的圖。
[0021] 圖11是顯示氯化鈉對于非PEG化的BDD-rFVIII在23°C下貯存6天的效能回收影 響的圖。
[0022] 圖12是顯示在26周后在凍干制劑A中的PEG化的BDD-rFVIII標準化的效能趨 勢的圖。制劑A含有2. 5mM氯化鈣、30mM氯化鈉、20mM組氨酸、293mM甘氨酸、29mM蔗糖和 80ppm聚山梨醇酯80。
[0023] 圖13是顯示在26周后在凍干制劑B中的PEG化的BDD-rFVIII標準化的效能趨 勢的圖。制劑B含有2. 5mM氯化鈣、30mM氯化鈉、20mM組氨酸、346mM甘氨酸、38mM蔗糖和 80ppm聚山梨醇酯80。
[0024] 圖14是顯示在26周后在凍干制劑C中的PEG化的BDD-rFVIII標準化的效能趨 勢的圖。制劑C含有2. 5mM氯化鈣、20mM組氨酸、234mM蔗糖和80ppm聚山梨醇酯80。
[0025] 圖15是顯示在26周后在凍干制劑D中的PEG化的BDD-rFVIII標準化的效能趨 勢的圖。制劑D含有2. 5mM氯化鈣、20mM組氨酸、21 ImM海藻糖和80ppm聚山梨醇酯80。
[0026] 圖16是顯示在長達30個月時在凍干制劑A中的PEG化的BDD-rFVIII標準化的 效能趨勢的圖。制劑A含有2. 5mM氯化鈣、30mM氯化鈉、20mM組氨酸、293mM甘氨酸、29mM 鹿糖和80ppm聚山梨醇酯80。
[0027] 圖17是顯示在長達13周時在凍干制劑B中的PEG化的BDD-rFVIII標準化的效 能趨勢的圖。制劑B含有2. 5mM氯化鈣、30mM氯化鈉、20mM組氨酸、346mM甘氨酸、38mM蔗 糖和80ppm聚山梨醇酯80。
[0028] 圖18是顯示在長達12個月時在凍干制劑A中的PEG化的BDD-rFVIII (200IU/mL) 標準化的效能趨勢的圖。制劑A含有2. 5mM氯化鈣、30mM氯化鈉、20mM組氨酸、293mM甘氨 酸、29mM蔗糖和SOppm聚山梨醇酯80。
[0029] 圖19是顯示在長達9個月時在凍干制劑A中的PEG化的BDD-rFVIII (1200IU/mL) 標準化的效能趨勢的圖。制劑A含有2. 5mM氯化鈣、30mM氯化鈉、20mM組氨酸、293mM甘氨 酸、29mM蔗糖和SOppm聚山梨醇酯80。
[0030] 圖 2〇 是 BDD-rFVIII SQ 的氨基酸序（SEQ ID NO:3)列。
[0031] 圖 21 是 FL-rFVIII 的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1)。
[0032] 詳細描述
[0033] 除非另有明示，出于解釋本說明書的目的，將應用下述定義。在本申請中引用的所 有參考文獻均通過引用整體并入本申請。
[0034] 因子VIII :因子VIII( "FVIII"）是一種凝血因子，其作為由約200kDa的重鏈和 80kDa的輕鏈組成的異二聚體在循環中存在。重鏈含有結構相關的Al和A2結構域，以及獨 特的B結構域，輕鏈包括A3、C1和C2結構域。參見例如，Mei等，116BL00D 270-279(2010)。 亦參見圖1，其顯示了 FVIII的結構域。在本申請中使用的術語"因子VIII"或"FVIII"指 所有VIII分子，無論其來源于血漿還是通過使用重組DNA技術生產，其具有野生型人FVIII 的一些促凝血活性的性質。如在本申請中所使用的，FVIII包括野生型或重組因子VIII的 修飾或截短形式，其保留了野生型因子VIII或活化的野生型因子VIII的一些或全部的促 凝血活性，包括具有超過野生型因子VIII或活化的野生型因子VIII活性的促凝血活性的 變體或截短形式。FVIII還包括含有具有活性的因子VIII的融合產物，如與免疫球蛋白片 段或結構域的融合物。市售的含有FVIII的治療性配制品的示例包括以商品名KOGENATE FS(來自 Bayer Healthcare LLC, Berkeley, CA, U.S.A.)銷售的那些。
[0035] 重組因子VIII :在本申請中使用的重組因子VIII ("rFVIII"）指使用重組技術生 產的FVIII，或其具有生物活性的衍生物，并且不包括來自哺乳動物血漿的FVIII。
[0036] 全長、天然的人因子VIII ( "FL-FVIII"）是一種具有2, 351個氨基酸的單鏈糖蛋 白。表達2, 351個氨基酸的序列如SEQ. ID. NO: 1所示。但是，當表達的多肽轉位進入內質網 腔時，裂解掉19個氨基酸的信號序列，結果產生第二條序列。該第二條序列，在本申請中如 SEQ，ID. NO:2所示，缺乏19個先導氨基酸并且研究人員通常使用該序列指定編碼位置（例 如Arg372)以給定VIII的氨基酸殘基。因此，除非特別說明，本申請所提供的為氨基酸殘基 分配的所有編碼位置均基于SEQ. ID. NO: 2。例如，根據通常做法和如本申請所使用的，當涉 及BDD rFVIII中的突變氨基酸時，根據其在全長FVIII序列中的位置涉及突變氨基酸。例 如，BDD rFVIII突變體可以包括K1808C氨基酸取代，其中在位置類似于全長序列（在本申 請中，SEQ ID NO:2)中的1808的賴氨酸（K)被半胱氨酸（C)取代。
[0037] B-結構域缺失（"BDD"）的因子VIII :如在本申請中所使用的，BDD或BDD-rFVIII 的特征為具有B-結構域全部或部分缺失的氨基酸序列。在一個實施方式中，BDD是稱為 BDD-SQ的分子，其含有因子VIII的B-結構域除14個氨基酸以外的全部氨基酸缺失。在 BDD-SQ中，B-結構域的前4個氨基酸（SEQ ID NO:4)與B結構域的后10個殘基（SEQ ID NO: 5)連接。參見例如，Lind et al, Novel forms of B-domain-deleted recombinant factor VIII molecules, 232EUR0PEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY 19-27(1995)。亦參見 圖1，其以結構域組序顯示了 BDD。在本申請中使用的BDD-SQ包括SEQ ID NO: 3的氨基酸 序列。因子VIII的B-結構域似乎是可有可無的，因為具有90kD A1-A2重鏈和80kD輕鏈 的BDD分子已顯示出其能夠有效作為甲型血友病的替代療法。具有B-結構域其他部分缺 失或B-結構域全部缺失的FVIII分子亦包括在本發明的制劑和方法中。
[0038] BDD突變體或BDD-rFVIII突變體：BDD突變體或BDD-rFVIII突變體是BDD-SQ的 變體，其含有至少一些FVIII的促凝血活性和至少一個氨基酸殘基不同于BDD-SQ。BDD突 變體或BDD-rFVIII突變體包括氨基酸序列與BDD-SQ不同的變體，例如但不限于通過將一 個或多個氨基酸殘基位點定向突變。不具有限制作用的，BDD突變體或BDD-rFVIII突變體 包括引入美國專利號7, 928, 199 (Griffin等）中公開的半胱氨酸殘基的FVIII多肽。
[0039] PEG化：PEG化是將長鏈聚乙二醇（PEG)分子與蛋白共價結合，如通過將具有活性 官能團的PEG與FVIII上存在的位點結合。用于PEG化的一種方法是將功能化的PEG部分 與天然蛋白中存在的賴氨酸殘基或NET-末端胺基連接。由于FVIII含有多個胺基殘基，因 此胺功能化的聚合物隨機綴合至FVIII上的不同位點。
[0040] 位點定向PEG化使得能夠將PEG分子靶向至特定位點。這些特定位點可以包括 引入PEG聚合物可以與其綴合的表面暴露的半胱氨酸。參見美國專利號7,632,921 (Pan 等）。還可以通過共價連接至FVIII上的糖類，將PEG與FVIII連接。參見例如，美國專利 申請公開號20110112028 (Turecek等）。通過將PEG與FVIII上的多糖如0-多糖酶促偶 聯，可以將PEG與FVIII連接。Stennicke等公開了通過將全長FVIII與緩沖液中的唾液酸 酶和過量CMP-SA-甘油-PEG試劑孵育將PEG與FVIII B-結構域中獨特的0-多糖選擇性 偶聯。Stennicke 等，"A novel B-domain 〇-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates fu