專利名稱：長效凝固因子及產生其的方法
技術領域：
公開了包含附著至凝固因子C末端(羧基末端)的至少ー個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的多肽及編碼其的多核苷酸。還公開了包含本發明多肽和多核苷酸的藥物組合物及其使用方法。發明背景 多肽在血液、肝或者腎中易于變性或者被酶降解。因此，多肽典型具有幾小時的短循環半衰期。由于其低穩定性，肽藥物通常以持續的頻率(sustained frequency)遞送，以維持活性肽的有效血漿濃度。此外，由于肽藥物通常通過輸注方式施用，頻繁注射肽藥物導致對象相當不舒適。因此，需要延長治療性多肽半衰期且同時維持其高藥學功效的技木。這種希望的肽藥物在注射進人體時也應滿足如下需要增強的血清穩定性、高活性及誘導不希望的免疫應答的低可能性。不利的藥物動力學如短的血清半衰期可以阻止許多原本是有希望的藥物候選物的藥物開發。血清半衰期是分子的經驗特征，并且對于每種新的潛在藥物必須進行實驗確定。例如，使用較低分子量的多肽藥物，生理學清除機制如腎過濾可以使得難以維持藥物的治療水平，這是由于所需的給藥方案的成本或者頻率。相反，在藥物或者其代謝物具有毒性副作用時，病不希望其具有較長的血清半衰期。發明概述在一個實施方案中，本發明提供了多肽，其由凝固因子及附著于所述凝固因子羧基末端的一至五個促性腺激素羧基末端肽(CTP)組成。在另ー個實施方案中，本發明還提供了多核苷酸分子，其包含編碼由凝固因子及附著于所述凝固因子羧基末端的一至五個促性腺激素羧基末端肽組成的多肽的編碼部分。在另ー個實施方案中，本發明還提供了延長凝固因子的生物學半衰期的方法，所述方法包括將一至五個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽附著于所述凝固因子的羧基末端的步驟，由此改善凝固因子的生物學半衰期。在另ー個實施方案中，本發明還提供了改善凝固因子曲線下面積(AUC)的方法，所述方法包括將一至五個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽附著于所述凝固因子羧基末端的步驟，由此改善凝固因子的曲線下面積(AUC)。在另ー個實施方案中，本發明還提供了降低凝固因子給藥頻率的方法，包括將ー至五個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽附著于所述凝固因子羧基末端的步驟，由此降低凝固因子的給藥頻率。在另ー個實施方案中，本發明還提供了在凝固因子治療的使用中提高順應性的方法，包括向有需要的對象提供多肽，所述多肽包含凝固因子、附著于所述凝固因子羧基末端的一至五個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽，由此在凝固因子治療的使用中提高順應性。
附圖簡述圖 I 是 rFVII-CTP 構建體(A) ,rFV 11-CTP-CTP 構建體(B)、rFIX_CTP 構建體(C)、和rFIX-CTP-CTP構建體(D)的圖示。圖2A是柱狀圖，其顯示了在5μ g/ml維生素K3的存在下，由FVII-CTP變體限制稀釋的克隆轉染的和選擇的細胞的收獲物。FVII水平使用FVIIElisa(AssayPro)來量化。圖2Β是柱狀圖，其顯示了在5μ g維生素Κ3的存在下，由FVII-CTP變體限制稀釋轉染的和選擇的細胞的收獲物。FVII活性使用FVII生色活性測定(AssayPro)來量化。圖2C是柱狀圖，其顯示了在5μ g維生素K3的存在下，由FVII-CTP變體限制稀釋轉染的和選擇的細胞的收獲物。通過以活性值除以收獲物FVII濃度計算。圖2D的圖，顯示了由與正常集合(poll)的人血漿凝固活性相比的FVII、FVII-CTP和FVII-(CTP)2的凝固活性限制稀釋轉染的和選擇的細胞的收獲物。圖2E 的圖，顯示了 FVII、FVII-CTP-CTP 和 FVII-CTP 收獲物的 PK 譜。圖3A是柱狀圖，其顯示了在5μ g/ml維生素K3的存在下，由FIX-CTP和FIX-CTP-CTP變體限制稀釋轉染的和選擇的細胞的收獲物。FIX水平使用人FIX ELISA試劑盒(Affinity Biologicals ；cat. No. FIX-AG RU。)量化,計算的蛋白質濃度(μ g/ml)是兩個獨立實驗的平均值。圖3B顯示了 FIX Ab識別的SDS-PAGE凝膠顯微照片。顯微照片A示出在Western-印跡中抗-FIX抗體的識別；顯微照片B示出在Western-印跡中抗-Y羧化抗體的識別。A-B中的泳道I加載了含有重組FIX的樣品。A-B中的泳道2加載了含有FIX-CTP收獲物的樣品。A-B中的泳道3加載了含有FIX- (CTP) 2收獲物的樣品。圖4 的圖顯不了與;rhFIX (American Diagnostics)相比 FIX-CTP 和 FIX-(CTP) 2 收獲物的對比生色活性(通過EC5tl.濃度測量)。圖5 的圖顯不了與 rhFIX (American Diagnostics)凝固活性相比 FIX-CTP 和FIX-(CTP)收獲物的凝固活性。圖6的圖顯示了 rhFIX、FIX-CTP-CTP的收獲物、和FIX-CTP收獲物的PK譜。圖7是柱狀圖，其分別顯示了 FIX-CTP收獲物和FIX-CTP-CTPM0D-3011及FIX-CTP-CTP_M0D-3012收獲物以及M0D3012純化的蛋白質FIX抗原水平，這是使用HumanFIX ELISA 試劑盒(Affinity Biologicals ；cat. No. FIX-AG RU。)確定的，計算的蛋白質濃度(μ g/ml)是兩個獨立實驗的平均值。圖8顯示了 FIX Ab識別的SDS-PAGE凝膠顯微照片。顯微照片A示出考馬斯藍染色；顯微照片B示出在Western-印跡中的抗-FIX抗體的識別；顯微照片C示出在Western-印跡中抗-Y羧化抗體的識別。A-C中泳道I加載了含有FIX-(CTP) 2 (M0D-3012)的樣品。A-C中泳道2加載了含有未結合的FIX-(CTP)2的樣品。A-C中泳道3加載了含有FIX- (CTP) 2 (M0D-3012)的濃縮洗脫液的樣品。圖9的圖顯不了與人正常集合血衆和 rhFIX (American Diagnostics)相比M0D3012的對比生色活性(樣品濃度/0. D.)。

圖10的圖顯示了與人正常集合血漿和rhFIX相比M0D3012的對比凝固活性。圖11的圖顯示了純化的M0D3012、rhFIX、FIX-CTP-CTP的收獲物以及FIX-CTP的收獲物的PK譜。
發明詳述在一個實施方案中，本發明提供了長效凝固因子以及生產和使用其的方法。在另一個實施方案中，長效凝固因子包含羧基末端肽(CTP，也稱作CTP単位)。在另ー個實施方案中，包含凝固因子的長效多肽還包含人絨毛膜促性腺激素(hCG)的羧基末端肽(CTP)。在另ー個實施方案中，CTP作為對抗凝固 因子降解的保護劑。在另ー個實施方案中，CTP擴展了凝固因子的cmax。在另ー個實施方案中，CTP擴展了凝固因子的Tmax。在另ー個實施方案中，CTP擴展了凝固因子的循環半衰期。在一些實施方案中，CTP增強了凝固因子的效力。在另ー個實施方案中，本發明提供了延長凝固因子生物學半衰期的方法，所述方法包括將一至十個CTP附著至凝固因子羧基末端的步驟，由此改善凝固因子的生物學半衰期。在另ー個實施方案中，本發明提供了延長凝固因子生物學半衰期的方法，包括將一至五個CTP附著至凝固因子羧基末端的步驟，由此改善了凝固因子的生物學半衰期。在另ー個實施方案中，本發明提供了改善凝固因子曲線下面積(AUC)的方法，所述方法包括將一至十個CTP附著至凝固因子羧基末端的步驟，由此改善凝固因子的曲線下面積(AUC)。在另ー個實施方案中，本發明提供了改善凝固因子曲線下面積(AUC)的方法，包括將一至五個CTP附著至凝固因子羧基末端的步驟，由此改善凝固因子的曲線下面積(AUC)。在另ー個實施方案中，本發明的凝固因子是蛋白質。在另ー個實施方案中，本發明的凝固因子是肽。在另ー個實施方案中，本發明的凝固因子是多肽。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是酶。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是絲氨酸蛋白酶。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是糖蛋白。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是轉谷氨酰胺酶(transglutaminase)。在另ー個實施方案中,所述凝固因子是無活性的酶原。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是本領域技術人員已知的任何凝固因子。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FVIII。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FV。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是因子XIII。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是因子X。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是凝血酶。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是纖維蛋白。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FVIIa。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FVII。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FIX。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FX。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FXIa。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FXII。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是Fxa。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是Fva。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是凝血酶原。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是凝血酶。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FV。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FXI。在另一個實施方案中，所述凝固因子是vWF。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FVIIIa。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是B-缺失的結構域FVIII (FVIIIBDD)。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FIXa。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是前激肽釋放酶。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是激肽釋放酶。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FXIIa。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是纖維蛋白原。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是血栓調節蛋白(thrombomodulin)。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是FII。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是糖蛋白。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是維生素K依賴性糖蛋白。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是維生素K非依賴性糖蛋白。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組蛋白質。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組糖蛋白。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組糖蛋白FV。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組FVI。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組FVII。在另一個實施方案中，所述凝固因子是重組FVIII。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組FIX。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組FX。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組FXI。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組FXII。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組FvW。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組FII。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組FIXa。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組FXIa。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組纖維蛋白。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組FVIIa。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組Fxa。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組Fva。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組凝血酶原。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組凝血酶。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組FVIIIa。在另一個實施方案中，所述凝固因子是重組前激肽釋放酶。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組激肽釋放酶。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是重組FXIIa。在另ー個實施方案中，所述凝固因子是任何已知的重組凝固因子。在另ー個實施方案中，包含信號肽的凝固因子是任何已知的重組凝固因子。在另ー個實施方案中，凝固因子包含附著于C末端的1-10個CTP重復而N末端無CTP附著。在另ー個實施方案中，包含信號肽的凝固因子是任何已知的重組凝固因子。在另ー個實施方案中，凝固因子包含附著于C末端的至少ー個CTP而無CTP附著于N末端。在另ー個實施方案中，包含附著于C末端的1-10個CTP而N末端無CTP附著的凝固因子是改造的凝固因子。在另ー個實施方案中，包含附著于C末端的至少ー個CTP而N末端無CTP附著的凝固因子是改造的凝固因子。在另ー個實施方案中，包含附著于C末端的1-10個CTP而N末端無CTP附著的凝固因子是綴合的凝固因子。在另ー個實施方案中，包含附著于C末端的至少ー個CTP而N末端無CTP附著的凝固因子是綴合的凝固因子。 在另ー個實施方案中，所述凝固因子包含與FIX、FVII、因子X、蛋白質C和凝血酶原的結構域組織相似或相同的結構域組織。在另ー個實施方案中，所述凝固因子被合成為具有N末端前肽(prop印tide)的前體。在另ー個實施方案中，本文所用凝固因子是無活性的酶原形式。在另ー個實施方案中，所述凝固因子在肝細胞中產生。在另ー個實施方案中，所述凝固因子包含Y羧化酶的停靠位點(docking site)，所述Y羧化酶將谷氨酸(Glu)轉變為Y羧基谷氨酸(Gla)。在另ー個實施方案中，本文所用凝固因子是可商購的凝固因子。在另ー個實施方案中，因子VII的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSD⑶QCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHD⑶EQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLT
GIVSWGQG CATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP(SEQ ID NO :9)在另ー個實施方案中，因子VII的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSD⑶QCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHD⑶EQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP*GCGR(SEQID NO :10).在另ー個實施方案中，編碼因子VII的核酸序列包含如下核酸序列CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCAGGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGGGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTTGTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTCGACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTCAGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCCAGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACCAGCCCGTGGTCCTCACTGACCATGTGGTGCCCCTCTGCCTGCCCGAACGGACGTTCTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAGCTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGTGCCCCGGCTGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATATCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAAGGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGACGGGCATCGTCAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCAACCGTGGGCCACTTTGGGGTGTACACCAGGGTCTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAAAAGCTCATGCGCTCAGAGCCACGCCCAGGAGTCCTCCTGCGAGCCCCATTTCCCTGAGGATGCGGCCGC(SEQ IDNO : 11)·在另ー個實施方案中，編碼因子VII-CTP(附著于羧基末端)的核酸序列包含如下核酸序列CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCA
GGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGGGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTTGTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTCGACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTCAGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCCAGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACCAGCCCGTGGTCCTCACTGACCATGTGGTGCCCCTCTGCCTGCCCGAACGGACGTTCTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAGCTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGTGCCCCGGCTGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATATCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAAGGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGACCGGCATCGTGAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCCACCGTGGGCCACTTCGGCGTGTACACCAGGGTGTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAGAAACTGATGAGAAGCGAGCCCAGACCCGGCGTGCTGCTGAGAGCCCCCTTCCCCAGCAGCAGCTCCAAGGCCCCTCCCCCTAGCCTGCCCAGCCCTAGCAGACTGCCTGGGCCCAGCGACACCCCCATCCTGCCCCAGTGAGGATCCGCGGCCGC(SEQ ID NO :12).在另ー個實施方案中，因子VII-CTP (附著于羧基末端)的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSD⑶QCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHD⑶EQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSL PSPSRLPGPSDTPILPQ*(SEQ ID NO 13).在另ー個實施方案中，編碼因子VII-CTP-CTP(附著于羧基末端)的核酸序列包含如下核酸序列
CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCAGGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGGGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTTGTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTCGACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTCAGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCCAGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACCAGCCCGTGGTCCTCACTGACCATGTGGTGCCCCTCTGCCTGCCCGAACGGACGTTCTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAGCTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGGCCCCGGCTGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATATCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAAGGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGACCGGCATCGTGAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCCACCGTGGGCCACTTCGGCGTGTACACCAGGGTGTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAGAAACTGATGAGAAGCGAGCCCAGACCCGGCGTGCTGCTGAGAGCCCCCTTCCCCAGCAGCAGCTCCAAGGCCCCTCCCCCTAGCCTGCCCAGCCCTAGCAGACTGCCTGGGCCCTCCGACACACCAATCCTGCCACAGAGCAGCTCCTCTAAGGCCCCTCCTCCATCCCTGCCATCCCCCTCCCGGCTGCCAGGCCCCTCTGACACCCCTATCCTGCCTCAGTGATGAAGGTCTGGATCCGCGGCCGC(SEQ ID NO : 14) ·在另ー個實施方案中，因子VII-CTP-CTP (附著于羧基末端)的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSD⑶QCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHD⑶EQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPR LMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSL
PSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**(SEQ ID NO :15).在另ー個實施方案中，編碼因子IX的核酸序列包含如下核酸序列GCGATCGCCATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGCCTCATC
ACCATTGCCTTTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGTACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGAGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTCCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCGATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTGAACGCGGCCGC(SEQ ID NO :16).在另ー個實施方案中，因子IX的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVD⑶QCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISffGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT*(SEQ ID NO :17).在另ー個實施方案中，編碼因子IX_CTP(附著于羧基末端)的核酸序列包含如下核酸序列GCGATCGCCA TGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGCCTCATCACCATCTGCCTTTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGTACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATT
GGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGAGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAAC
CAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCGATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACT
GAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCCCCTCCCCCGAGCCTGCCCTCCCCAAGCAGGCTGCCTGGGCCCTCCGACACACCAATCCTGCCACAGTGATGAAGGTCTGGATCCGCGGCCGC(SEQ ID NO :18).在另ー個實施方案中，因子IX-CTP(附著于羧基末端)的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVD⑶QCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAATNKYNHDLALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISffGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEK
TKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**(SEQ ID NO :19).在另ー個實施方案中，編碼因子IX-CTP-CTP(附著于羧基末端)的核酸序列包含如下核酸序列GCGATCGCCATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGCCTCATCACCATCTGCCTTTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGTACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCA A AGAGGTATAATTCAGGTAAATT
GGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAG
TTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGAGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGG
AGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCGATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCCCCTCCCCCGAGCCTGCCCTCCCCAAGCAGGCTGCCTGGGCCCTCCGACACACCAATCCTGCCACAGAGCAGCTCCTCTAAGGCCCCTCCTCCATCCCTGCCATCCCCCTCCCGGCTGCCTGGCCCCTCTGACACCCCTATCCTGCCTCAGTGATGAAGGTCTGGATCCGCGGCCGC(SEQ ID NO :20).在另ー個實施方案中，因子IX-CTP-CTP(附著于羧基末端)的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVD⑶QCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVV
GGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISffGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**
(SEQ ID NO :21).在另ー個實施方案中，將弗林蛋白酶(furin)加入到表達本發明凝固因子-CTP的細胞中。在另ー個實施方案中，弗林蛋白酶提高細胞中本發明凝固因子-CTP的生產效率。在另ー個實施方案中，將弗林蛋白酶與包含本發明凝固因子-CTP的編碼序列的載體共轉染。在另ー個實施方案中，弗林蛋白酶由單獨載體編碼。在另ー個實施方案中，弗林蛋白酶和凝固因子-CTP由一個載體編碼。在另ー個實施方案中，弗林蛋白酶的編碼序列被插入PCI-DHFR中。在另ー個實施方案中，弗林蛋白酶的編碼序列被改造至pCI-dhfr/smal+Notl、Furin/AsisI F. I. +NotI 中。在另ー個實施方案中，編碼弗林蛋白酶的核酸序列包含如下核酸序列tctagagtcgacccCGCCATGGAGCTGAGGCCCTGGTTGCTATGGGTGGTAGCAGCAACA
GGAACCTTGGTCCTGCTAGCAGCTGATGCTCAGGGCCAGAAGGTCTTCACCAACACGTGGGCTGTGCGCATCCCTGGAGGCCCAGCGGTGGCCAACAGTGTGGCACGGAAGCATGGGTTCCTCAACCTGGGCCAGATCTTCGGGGACTATTACCACTTCTGGCATCGAGGAGTGACGAAGCGGTCCCTGTCGCCTCACCGCCCGCGGCACAGCCGGCTGCAGAGGGAGCCTCAAGTACAGTGGCTGGAACAGCAGGTGGCAAAGCGACGGACTAAACGGGACGTGTACCAGGAGCCCACAGACCCCAAGTTTCCTCAGCAGTGGTACCTGTCTGGTGTCACTCAGCGGGACCTGAATGTGAAGGCGGCCTGGGCGCAGGGCTACACAGGGCACGGCATTGTGGTCTCCATTCTGGACGATGGCATCGAGAAGAACCACCCGGACTTGGCAGGCAATTATGATCCTGGGGCCAGTTTTGATGTCAATGACCAGGACCCTGACCCCCAGCCTCGGTACACACAGATGAATGACAACAGGCACGGCACACGGTGTGCGGGGGAAGTGGCTGCGGTGGCCAACAACGGTGTCTGTGGTGTAGGTGTGGCCTACAACGCCCGCATTGGAGGGGTGCGCATGCTGGATGGCGAGGTGACAGATGCAGTGGAGGCACGCTCGCTGGGCCTGAACCCCAACCACATCCACATCTACAGTGCCAGCTGGGGCCCCGAGGATGACGGCAAGACAGTGGATGGGCCAGCCCGCCTCGCCGAGGAGGCCTTCTTCCGTGGGGTTAGCCAGGGCCGAGGGGGGCTGGGCTCCATCTTTGTCTGGGCCTCGGGGAACGGGGGCCGGGAACATGACAGCTGCAACTGCGACGGCTACACCAACAGTATCTACACGCTGTCCATCAGCAGCGCCACGCAGTTTGGCAACGTGCCGTGGTACAGCGAGGCCTGCTCGTCCACACTGGCCACGACCTACAGCAGTGGCAACCAGAATGAGAAGCAGATCGTGACGACTGACTTGCGGCAGAAGTGCACGGAGTCTCACACGGGCACCTCAGCCTCTGCCCCCTTAGCAGCCG
GCATCATTGCTCTCACCCTGGAGGCCAATAAGAACCTCACATGGCGGGACATGCAACACCTGGTGGTACAGACCTCGAAGCCAGCCCACCTCAATGCCAACGACTGGGCCACCAATGGTGTGGGCCGGAAAGTGAGCCACTCATATGGCTACGGGCTTTTGGACGCAGGCGCCATGGTGGCCCTGGCCCAGAATTGGACCACAGTGGCCCCCCAGC
GGAAGTGCATCATCGACATCCTCACCGAGCCCAAAGACATCGGGAAACGGCTCGAGGTGCGGAAGACCGTGACCGCGTGCCTGGGCGAGCCCAACCACATCACTCGGCTGGAGCACGCTCAGGCGCGGCTCACCCTGTCCTATAATCGCCGTGGCGACCTGGC
CATCCACCTGGTCAGCCCCATGGGCACCCGCTCCACCCTGCTGGCAGCCAGGCCACATGACTACTCCGCAGATGGGTTTAATGACTGGGCCTTCATGACAACTCATTCCTGGGATGAGGATCCCTCTGGCGAGTGGGTCCTAGAGATTGAAAACACCAGCGAAG
CCAACAACTATGGGACGCTGACCAAGTTCACCCTCGTACTCTATGGCACCGCCCCTGAGGGGCTGCCCGTACCTCCAGAAAGCAGTGGCTGCAAGACCCTCACGTCCAGTCAGGCCTGTGTGGTGTGCGAGGAAGGCTTCTCCCTGCACCAGAAGAGCTGTGTCCAGCACTGCCCTCCAGGCTTCGCCCCCCAAGTCCTCGATACGCACTATAGCACCGAGAATGACGTGGAGACCATCCGGGCCAGCGTCTGCGCCCCCTGCCACGCCTCATGTGCCACATGCCAGGGGCCGGCCCTGACAGACTGCCTCAGCTGCCCCAGCCACGCCTCCTTGGACCCTGTGGAGCAGACTTGCTCCCGGCAAAGCCAGAGCAGCCGAGAGTCCCCGCCACAGCAGCAGCCACCTCGGCTGCCCCCGGAGGTGGAGGCGGGGCAACGGCTGCGGGCAGGGCTGCTGCCCTCACACCTGCCTGAGGTGGTGGCCGGCCTCAGCTGCGCCTTCATCGTGCTGGTCTTCGTCACTGTCTTCCTGGTCCTGCAGCTG
CGCTCTGGCTTTAGTTTTCGGGGGGTGAAGGTGTACACCATGGACCGTGGCCTCATCTCCTACAAGGGGCTGCCCCCTGAAGCCTGGCAGGAGGAGTGCCCGTCTGACTCAGAAGAGGACGAGGGCCGGGGCGAGAGGACCGCCTTTATCAAAGACCAGAGCGCCCTCTGAACGCGGCCGC(SEQID NO :22).在另ー個實施方案中，弗林蛋白酶的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVARKHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVAKRRTKRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIVVSILDDGIEKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRMLDGEVTDAVEARSLGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCNCDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQKCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPAHLNANDWATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCIIDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSGEWVLEIENTSEANNYGTLTKFTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQACVVCEEGFSLHQKSCVQHCPPGFAPQVLDTHYSTENDVETIRASVCAPCHASCATCQGPALTDCLSCPSHASLDPVEQTCSRQSQSSRESPPQQQPPRLPPEVEAGQRLRAGLLPSHLPEVVAGLSCAFIVLVFVTVFLVLQLRSGFSFRGVKVYTMDRGLISYKGLPPEAWQEECPSDSEEDEGRGERTAFIKDQSAL* (SEQ ID NO : 23).在一些實施方案中，術語凝固因子還包括具有凝固活性的已知凝固因子的同源物。在一些實施方案中，本發明的同源性還涵蓋缺失、插入或者取代變體，包括其氨基酸取代，及其生物活性多肽片段。
在另ー個實施方案中，本發明包括具有凝固活性的凝固因子同源物。在另ー個實施方案中，本發明包括本文所述的具有凝固活性的凝固因子同源物。在另ー個實施方案中，同源物例如是使用國立生物技術信息中心(NCBI)的BlastP軟件以默認參數確定的與凝固因子具有至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少87 %、至少89 %、至少91%、至少93 %、至少95 %或者99 %以上同源性的多肽。在另ー個實施方案中，本發明包括弗林蛋白酶的同源物。在另ー個實施方案中，同源物例如是使用國立生物技術信息中心(NCBI)的BlastP軟件以默認參數確定的與弗林蛋白酶具有至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少87 %、至少89 %、至少91%、至少93 %、至少95 %或者99 %以上同源性的多肽。在另ー個實施方案中，本發明提供了多肽，所述多肽包含凝固因子及附著于所述凝固因子的羧基末端的1-10個促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另ー個實施方案中，本發明提供了多肽，所述多肽包含凝固因子及附著于所述凝固因子的羧基末端的2-8個促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另ー個實施方案中，本發明提供了多肽，其包含凝固因子及附著 于所述凝固因子的羧基末端的1-3個促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另ー個實施方案中，本發明提供了多肽，所述多肽包含凝固因子及附著于所述凝固因子的羧基末端的1-5個促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另ー個實施方案中，本發明提供了多肽，所述多肽由凝固因子及附著于所述凝固因子的羧基末端的1-5個促性腺激素羧基末端肽(CTP)組成。在另ー個實施方案中，本發明提供了多肽，所述多肽包含凝固因子及附著于所述凝固因子的羧基末端的1-5個CTP。在另ー個實施方案中，本發明提供了多肽，所述多肽包含在凝固因子的氨基末端無CTP的凝固因子。在另ー個實施方案中，本發明提供了多肽，所述多肽包含在凝固因子的羧基末端具有至少ー個CTP的凝固因子。在另ー個實施方案中，本發明提供了多肽，所述多肽包含在凝固因子的羧基末端具有至少ー個CTP而在氨基末端無CTP的凝固因子。在其它實施方案中，改造的凝固因子是這樣的多肽，其包含在羧基末端具有至少ー個CTP的凝固因子。在其它實施方案中，改造的凝固因子是這樣的多肽，其包含在羧基末端具有ー個CTP的凝固因子。在其它實施方案中，改造的凝固因子是這樣的多肽，其由在羧基末端具有ー個CTP的凝固因子組成。在其它實施方案中，改造的凝固因子包含兩個以串聯形式附著于羧基末端的CTP肽。在另ー個實施方案中，本文所述的改造的凝固因子與非CTP修飾的凝固因子在生物活性方面是等價的。在另ー個實施方案中，本文所述的改造的凝固因子與非CTP修飾的凝固因子在藥學測量如藥物動力學和/或藥效學方面至少是等價的。在其它實施方案中，改造的凝固因子要用于治療B型血友病患者。在另ー個實施方案中，在羧基末端包含串聯的2個CTP的凝固因子IX(M0D-3012)要用于治療B型血友病患者。在另ー個實施方案中，在羧基末端包含I個CTP重復的凝固因子IX(M0D-3011)要用于治療B型血友病患者。在其它實施方案中，改造的凝固因子可以降低輸注速度、降低所需劑量或者其組合。在另ー個實施方案中，在羧基末端包含串聯的2個CTP的凝固因子IX(M0D_3012)與FIX-CTP收獲物或者rhFIX相比呈現出改善的PK譜(profile)，同時保留其凝固活性。在另ー個實施方案中，在羧基末端包含串聯的2個CTP的凝固因子IX(M0D-3012)與rhFIX相比呈現出半衰期提高3倍及AUC提高4. 5倍。在另ー個實施方案中，術語“CTP肽”、“羧基末端肽”和“CTP序列”在本文可互換使用。在另ー個實施方案中，所述羧基末端肽是全長CTP。在另ー個實施方案中，所述羧基末端肽是截短的CTP。每種可能性均代表本發明單獨 的實施方案。在其它實施方案中，術語改造的凝固因子包含成熟凝固因子的氨基酸序列。在其它實施方案中，術語改造的凝固因子包含凝固因子的氨基酸序列，包括其信號序列或者信號肽。在另ー個實施方案中，“信號序列”和“信號肽”在本文可互換使用。在另ー個實施方案中，“序列”當用于多核苷酸分子時可以是指編碼部分。每種可能性均代表本發明單獨的實施方案。在另ー個實施方案中，如本文所述包含至少ー個CTP的改造的凝固因子與不具有至少ー個CTP的凝固因子相比具有增強的體內生物學活性。在一些實施方案中，在凝固因子羧基末端的至少ー個CTP序列提供了針對凝固因子降解的增強的保護作用。在一些實施方案中，在凝固因子羧基末端的至少ー個CTP序列提供了對抗清除的增強的保護作用。在一些實施方案中，在凝固因子羧基末端的至少ー個CTP提供了延長的清除時間。在一些實施方案中，在凝固因子羧基末端的至少ー個CTP序列増加其cmax。在一些實施方案中，在凝固因子羧基末端的至少ー個CTP提供了提高的保護作用對抗提高其!1-。在一些實施方案中，在凝固因子羧基末端的至少ー個CTP序列延長其T1/2。在另ー個實施方案中，本發明的綴合的凝固因子以與未修飾的綴合凝固因子相同的方式應用。在另ー個實施方案中，本發明的綴合的凝固因子具有延長的循環半衰期和血漿保留時間、降低的清除率以及提高的體內臨床活性。在另ー個實施方案中，由于本文所述綴合的凝固因子的改善的性質，此綴合物與未修飾形式的相同凝固因子相比以較低的頻率施用。在另ー個實施方案中，降低的施用頻率使得患者順應性改善，導致了治療結果的改善以及患者生存質量的改善。在另ー個實施方案中，與常規凝固因子綴合物相比，發現具有本發明綴合物的分子量和接頭序列的綴合物具有改善的效力、改善的穩定性、提高的AUC水平以及延長的循環半衰期。在另ー個實施方案中，本發明提供了包含本文所述的綴合凝固因子的組合物。在另ー個實施方案中，本發明提供了藥物組合物，其包含本文所述的綴合凝固因子。在另ー個實施方案中，綴合的凝固因子的治療有效量根據治療的病癥的精確類型、治療的患者的狀況以及該組合物中的其它成分等因素確定。在另ー個實施方案中，綴合的凝固因子的治療有效量在50-500IU每kg體重之間，一天一次至一周一次施用。在另ー個實施方案中，綴合的凝固因子的治療有效量為150-250IU/kg體重，一天一次施用。在另ー個實施方案中，包含綴合的凝固因子的藥物組合物以強效配制用以通過各種方式向人類患者施用。在另ー個實施方案中，如本文所述的綴合的凝固因子可用于治療患有血友病的對象。在另ー個實施方案中，如本文所述的綴合的凝固因子可用于預防性治療血友病，因此降低出血及相關并發癥的風險。在另ー個實施方案中，如本文所述的綴合的凝固因子可用于治療患有血友病的對象，同時降低產生針對外源施用的凝固因子的抑制性抗體的風險。在另ー個實施方案中，如本文所述的綴合的凝固因子可用于治療患有血友病的對象，因此誘導內穩態(homeostasis)。在另ー個實施方案中，如本文所述的綴合的凝固因子可用于治療經歷過量出血或者瘀傷(bruising)或者具有的凝血酶原時間(PT)或者部分促凝血酶原激酶時間(PartialThromboplastin Time7PTT)的對象。在另ー個實施方案中，如本文所述的綴合的凝固因子可用于治療具有導致出血的獲得性病癥如維生素K缺乏癥或者肝臟疾病的對象。在另ー個實施方案中，如本文所述的綴合的凝固因子可用于治療凝固因子缺乏的對象，所述凝固因子缺乏是獲得性的(由于其它疾病所致)或者遺傳性的、輕度或者嚴重的、長期或者暫時的。在另ー個實施方案中，如本文所述的綴合的凝固因子可用于治療患有A型血友病的對 象。在另ー個實施方案中，如本文所述的綴合的凝固因子可用于治療患有B型血友病的對象。在另ー個實施方案中，如本文所述的綴合的凝固因子可用于治療具有獲得性缺陷的對象，所述獲得性缺陷是由于慢性疾病如肝病或者癌癥所致；由于急性病癥如彌散性血管內凝血(DIC)所致，其迅速用光凝血因子；或者由于維生素K缺乏或者使用維生素K拮抗劑如華法林(warfarin)(因子II、VII、IX和X的產生需要維生素K)進行治療所致。在另ー個實施方案中，如本文所述的綴合的凝固因子可用于治療患有導致凝血失衡的疾病的對象，例如但不限于肝病、尿毒癥、癌癥、骨髄病、暴露于蛇毒、維生素K缺乏、抗凝治療、抗凝劑華法林的意外攝取、多次輸血(貯存的血單位喪失ー些凝血因子)。在另ー個實施方案中，本文所用對象是人。在另ー個實施方案中，對象是寵物(pet)。在另ー個實施方案中，對象是哺乳動物。在另ー個實施方案中，對象是農畜動物。在另ー個實施方案中，對象是猴子。在另ー個實施方案中，對象是馬。在另ー個實施方案中，對象是牛。在另ー個實施方案中，對象是小鼠。在另ー個實施方案中，對象是大鼠。在另ー個實施方案中，如本文所述[(CTP)n>1_凝固因子]包含全長凝固因子或者其活性片段，在其羧基末端通過肽鍵連接至少ー個CTP単位，在其氨基末端無CTP。在另ー個實施方案中，如本文所述[(CTP)n>1-凝固因子]包含凝固因子或者其活性片段，其通過肽鍵結合至少ー個CTP單位，在其氨基末端無CTP，所述CTP單位通過肽鍵與另ー CTP單位連接。在另ー個實施方案中，ー種核酸分子編碼改造的凝固因子，所述凝固因子包含在其C末端附著的至少ー個CTP而在其氨基末端無CTP。在另ー個實施方案中，所述CTP通過接頭附著至凝固因子。在另ー個實施方案中，連接CTP序列與凝固因子的接頭是共價鍵。在另ー個實施方案中，連接CTP序列與凝固因子的接頭是肽鍵。在另ー個實施方案中，連接CTP序列與凝固因子的接頭是取代的肽鍵。在另ー個實施方案中，所述CTP序列包含選自SEQ ID NO :I和SEQ ID NO 2中所列的氨基酸序列。在另ー個實施方案中，SEQ ID NO :I包含如下氨基酸(AA)序列DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO :1)。在另ー個實施方案中，SEQ ID NO :2包含如下氨基酸(AA)序列SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO :2)。在另ー個實施方案中，本發明的羧基末端肽(CTP)包含人絨毛膜促性腺激素的第112至145位的氨基酸序列，如SEQ ID N0:1所示。在另ー個實施方案中，本發明的CTP序列包含人絨毛膜促性腺激素的第118至145位氨基酸序列，如SEQ ID N0:2所示。在另ー個實施方案中，所述CTP序列也從在人絨毛膜促性腺激素第112-118位之間任何位置開始并在第145位結束。在一些實施方案中，所述CTP序列肽的長度為28、29、30、31、32、33或者34個氨基酸，并從CTP氨基酸序列的第112、113、114、115、116、117或者118位開始。在另ー 個實施方案中，所述CTP肽是絨毛膜促性腺激素CTP的變體，其與天然CTP相比因1-5個保守氨基酸取代而不同，如并入本文作參考的美國專利No. 5，712，122所述。在另ー個實施方案中，所述CTP肽是絨毛膜促性腺激素CTP的變體，其與天然CTP相比因I個保守氨基酸取代而不同。在另ー個實施方案中，所述CTP肽是絨毛膜促性腺激素CTP的變體，其與天然CTP相比因2個保守氨基酸取代而不同。在另ー個實施方案中，所述CTP肽是絨毛膜促性腺激素CTP的變體，其與天然CTP相比因3個保守氨基酸取代而不同。在另一個實施方案中，所述CTP肽是絨毛膜促性腺激素CTP的變體，其與天然CTP相比因4個保守氨基酸取代而不同。在另ー個實施方案中，所述CTP肽是絨毛膜促性腺激素CTP的變體，其與天然CTP相比因5個保守氨基酸取代而不同。在另ー個實施方案中，本發明的CTP肽氨基酸序列與天然CTP氨基酸序列或者其肽具有至少70%同源性。在另ー個實施方案中，本發明的CTP肽氨基酸序列與天然CTP氨基酸序列或者其肽具有至少80%同源性。在另ー個實施方案中，本發明的CTP肽氨基酸序列與天然CTP氨基酸序列或者其肽具有至少90%同源性。另ー個實施方案中，本發明的CTP肽氨基酸序列與天然CTP氨基酸序列或者其肽具有至少95%同源性。在另ー個實施方案中，本發明的CTP肽DNA序列與天然人CTP DNA序列或者其肽具有至少70%同源性。在另ー個實施方案中，本發明的CTP肽DNA序列與天然人CTP DNA序列或者其肽具有至少80%同源性。在另ー個實施方案中，本發明的CTP肽DNA序列與天然人CTP DNA序列或者其肽具有至少90%同源性。在另ー個實施方案中，本發明的CTP肽DNA序列與天然人CTP DNA序列或者其肽具有至少95%同源性。在一個實施方案中，至少ー個絨毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列是截短的。在另一個實施方案中，兩個絨毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列均是截短的。在另ー個實施方案中，有2個絨毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列是截短的。在另ー個實施方案中，有2或多個絨毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列是截短的。在另ー個實施方案中，所有絨毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列均是截短的。在一個實施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO :3的前10個氨基酸。在另ー個實施方案中，SEQ ID NO :3包含如下氨基酸(AA)序列SSSSKAPPPSLP。在一個實施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO :4的前10個氨基酸。在另ー個實施方案中，SEQ ID NO :4包含如下氨基酸(AA)序列SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ。在一個實施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO 4的前11個氨基酸。在一個實施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO :4的前12個氨基酸。在一個實施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :3的前8個氨基酸。在一個實施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO :4的前13個氨基酸。在一個實施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO :4的前14個氨基酸。在一個實施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO 4或者SEQ ID NO 3的前6個氨基酸。在一個實施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO 4或者SEQ ID NO 3的前5個氨基酸。在一個實施方案中，至少ー個絨毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列是糖基化的。在另ー個實施方案中，兩個絨毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列均是糖基化的。在另ー個實施方案中，有2個絨毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列是糖基化的。在另ー個實施方案中，有2或多個絨毛膜 促性腺激素CTP氨基酸序列是糖基化的。在另ー個實施方案中，所有絨毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列均是糖基化的。在一個實施方案中，本發明的CTP序列包含至少ー個糖基化位點。在一個實施方案中，本發明的CTP序列包含2個糖基化位點。在ー個實施方案中，本發明的CTP序列包含3個糖基化位點。在一個實施方案中，本發明的CTP序列包含4個糖基化位點。在一些實施方案中，所述CTP序列修飾在允許以較低劑量使用方面是有利的。在一些實施方案中，所述CTP序列修飾在允許以較少給藥方面是有利的。在一些實施方案中，所述CTP序列修飾在允許安全長效作用方面是有利的。在一些實施方案中，如本文所用“多肽”、“改造的凝固因子(engineereedcoagulation factor) ”或者“蛋白質”涵蓋了天然多肽(降解產物、合成的多肽或者重組多肽)和肽模擬物(典型為合成的多肽)、以及是多肽類似物的類肽(peptoid)和半類肽(semipeptoid)，其在一些實施方案中具有修飾使得所述含凝固因子的多肽在體內更穩定或者更加能夠進入細胞。在一些實施方案中，修飾包括但不限于C末端修飾，多肽鍵修飾，包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S = O、O = C-NH、CH2-0、CH2-CH2、S = C-NH、CH = CH 或者 CF = CH,主鏈修飾，以及殘基修飾。制備肽模擬化合物的方法為本領域熟知，例如在QuantitativeDrug Design,C. A. Ramsden Gd. , Chapter 17.2,F. Choplin Pergamon Press (1992)中有具體描述，所述文獻以其全部內容并入本文作參考。關于這方面的進ー步詳述在后文提供。在一些實施方案中，多肽內的多肽鍵(-C0-NH-)被取代。在一些實施方案中，所述多肽鍵由N-甲基化鍵(-N(CH3)-C0_)取代。在一些實施方案中，所述多肽鍵由酯鍵(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)取代。在一些實施方案中，所述多肽鍵由酮甲基鍵(ketomethylen bond)(-C0-CH2-)取代。在一些實施方案中，所述多肽鍵由α-氮雜鍵(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R是任何烷基，例如甲基，carba鍵(-CH2-NH-)。在一些實施方案中，所述多肽鍵由羥基こ烯鍵(-CH(OH)-CH2-)取代。在一些實施方案中，所述多肽鍵由硫代酰胺鍵(-CS-NH-)取代。在一些實施方案中，所述多肽鍵由烯烴(olefinic)雙鍵(-CH = CH-)取代。在ー些實施方案中，所述多肽鍵由反酰胺(retix) amide)鍵(-NH-C0-)取代。在一些實施方案中，所述多肽鍵由多肽衍生物(_N(R)-CH2-C0-)取代，其中R是“正常的”側鏈，天然存在于碳原子上。在一些實施方案中，這些修飾發生在沿多肽鏈的任何鍵，甚至同時在幾個鍵(2-3個鍵)發生。在一些實施方案中，所述多肽的天然芳族氨基酸如Trp、Tyr和Phe由合成的非天然氨基酸取代，所述合成的非天然氨基酸如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的環-甲基化衍生物、Phe的鹵化衍生物或者ο-甲基-Tyr。在一些實施方案中，本發明的多肽包括一或多個修飾的氨基酸或者一或多個非氨基酸單體(例如脂肪酸、復合的碳水化合物等)。在一個實施方案中，“氨基酸”或者“氨基酸序列”應被理解為包括20種天然發生的氨基酸；通常在體內翻譯后修飾的那些氨基酸，包括例如羥基脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨；以及其它非尋常氨基酸包括但不限于2-氨基脂肪酸、羥基賴氨酸、異鎖鏈賴氨素(isodesmosine)、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。在一個實施方案中，“氨基酸”既包括D-氨基酸也包括L-氨基酸。
在一些實施方案中，本發明的多肽用于治療中，其要求所述多肽包含溶解形式的凝固因子。在一些實施方案中，本發明的多肽包括一或多個非天然或者天然的極性氨基酸，包括但不限于絲氨酸和蘇氨酸，由于其包含羥基的側鏈而能増加所述多肽的溶解性。在一些實施方案中，本發明的改造的凝固因子以線性形式使用，但是本領域技術人員意識到在環化不明顯干擾改造的凝固因子特性的情況中也可以使用環狀形式的改造凝固因子。
在一些實施方案中，本發明的改造的凝固因子是經生物化學方式合成的，例如通過使用標準固相技術合成。在一些實施方案中，這些生物化學方法包括全(exclusive)固相合成法、部分固相合成法、片段縮合法，或者傳統的溶液合成法。在一些實施方案中，重組蛋白質技術用于產生本發明的改造的凝固因子。在ー些實施方案中，重組蛋白質技術用于產生相對較長的多肽(例如長于18-25個氨基酸)。在一些實施方案中，重組蛋白質技術用于產生大量的本發明的改造的凝固因子。在一些實施方案中，重組技術由 Bitter et al. , (1987)Methods in Enzymol. 153 516-544> Studier etal. (1990)Methods in Enzymol. 185 :60-89、Brisson et al. (1984)Nature 310 :511_514、Takamatsu et al. (1987)EMBO J. 6 :307_311、Coruzzi et al. (1984)EMBO J. 3 :1671-1680及Brogli et al.，(1984)Science 224 :838-843,Gurley et al. (1986)Mol. Cell. Biol. 6 :559-565 以及 Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463 描述。在另ー個實施方案中，本發明提供了包含編碼多肽的編碼部分的多核苷酸分子，所述多肽包含凝固因子及附著于所述凝固因子羧基末端的ι- ο個促性腺激素羧基末端肽。在另ー個實施方案中，本發明提供了包含編碼多肽的編碼部分的多核苷酸分子，所述多肽由凝固因子及附著于所述凝固因子的羧基末端的1-10個促性腺激素羧基末端肽組成。在另ー個實施方案中，本發明提供了包含編碼多肽的編碼部分的多核苷酸分子，所述多肽由凝固因子及附著于所述凝固因子羧基末端的1-7個促性腺激素羧基末端肽組成。在另ー個實施方案中，本發明提供了包含編碼多肽的編碼部分的多核苷酸分子，所述多肽由凝固因子及附著于所述凝固因子羧基末端的2-8個促性腺激素羧基末端肽組成。在另ー個實施方案中，本發明提供了包含編碼多肽的編碼部分的多核苷酸分子，所述多肽由凝固因子及附著于所述凝固因子羧基末端的1-5個促性腺激素羧基末端肽組成。在另ー個實施方案中，本發明提供了包含如本文所述多核苷酸分子的表達載體。在另ー個實施方案中，本發明提供了包含如本文所述表達載體的細胞。在另ー個實施方案中，本發明提供了包含如本文所述表達載體的組合物。在另ー個實施方案中，本發明提供了包含如本文所述細胞的組合物。在另ー個實施方案中，所述細胞是真核細胞。在另ー個實施方案中，所述細胞是原核細胞。在另ー個實施方案中，本發明的改造的凝固因子是使用編碼本發明多肽的多核苷酸分子合成的。在一些實施方案中，編碼本發明改造的凝固因子的多核苷酸分子被連接進表達載體中，所述載體包含順式調節序列的轉錄控制(例如啟動子序列)。在一些實施方案中，所述順式調節序列適于指導本發明改造的凝固因子的組成型表達。在一些實施方案中，所述順式調節序列適于指導本發明改造的凝固因子的組織特異性表達。在一些實施方案中，所述順式調節序列適于指導本發明改造的凝固因子的可誘導表達。
在一些實施方案中，適用于本發明的組織特異性啟動子包括在特定細胞群中起作用的序列，例如包括但不限于如肝特異性的白蛋白的啟動子[Pinkert et al. , (1987)Genes Dev. I :268-277]、淋巴特異性啟動子[Calame et al. , (1988) Adv. Immunol. 43 235-275];特別是 T 細胞受體的啟動子[ffinoto et al.，(1989)EMBO J. 8 =729-733]及免疫球蛋白的啟動子[Banerji et al. (1983) Cell33729_740]，神經元特異性啟動子如神經絲啟動子[Byrne et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :5473-5477]，胰腺特異性啟云カ子[Edlunch et al. (1985) Science 230 :912-916]或者乳腺特異性啟動子如乳清蛋白啟動子(美國專利 No. 4，873，316 和 European Application Publication No. 264，166)。適用于本發明的可誘導啟動子包括例如四環素可誘導啟動子(Srour, M. A. , et al. ,2003.Thromb. Haemost. 90 :398-405)。 在一個實施方案中，短語“多核苷酸分子”是指單鏈或者雙鏈核酸序列，其是分離的或者以RNA序列、互補多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或組合的多核苷酸序列(例如上述形式的組合)形式提供。在一個實施方案中，“互補多核苷酸序列”是指使用逆轉錄酶或者任何其它RNA依賴性DNA聚合酶得自信使RNA的逆轉錄的序列。在一個實施方案中，上述序列隨后可以在體內或者體外使用DNA聚合酶擴增。在一個實施方案中，“基因組多核苷酸序列”是指衍生自染色體及因此表示染色體ー連續部分的序列。在一個實施方案中，“組合的(composite)多核苷酸序列”是指這樣的序列，其至少是部分互補的及至少部分基因組的。在一個實施方案中，組合的序列可包括編碼本發明多肽所需的一些外顯子序列，以及插入之間的ー些內含子序列。在一個實施方案中，所述內含子序列可以是任何來源的，包括源于其它基因，典型包括保守剪接的信號序列。在一個實施方案中，內含子序列包括順式作用表達調節元件。在一個實施方案中，在表達和分泌之后，信號肽被從前體改造凝固因子中切除，獲得成熟的改造凝固因子。在一些實施方案中，本發明的多核苷酸是使用PCR技術或者本領域技術人員已知的任何其它方法或程序制備的。在一些實施方案中，所述程序包括連接兩個不同的DNA序列(見例如“ Current Protocols in MolecularBiologyeds. Ausubel et al. ,John Wiley& Sons,1992)。在一個實施方案中，編碼所述改造的凝固因子的本發明的多核苷酸被插入表達載體(即核酸構建體)中，以使得重組多肽表達。在一個實施方案中，本發明的表達載體包括額外的序列，該序列使得這個載體適于在原核生物中復制和整合。在一個實施方案中，本發明的表達載體包括額外的序列，該序列使得這個載體適于在真核生物中復制和整合。在一個實施方案中，本發明的表達載體包括穿梭載體，其使得這個載體在原核生物和真核生物中均適于復制和整合。在一些實施方案中，克隆載體包含轉錄和翻譯起始序列(例如啟動子、增強子)及轉錄和翻譯終止子(例如聚腺苷酸化信號)。在一個實施方案中，許多原核細胞或者真核細胞均可用作宿主表達系統，以表達本發明的凝固因子。在一些實施方案中，這些宿主表達系統包括但不限于微生物，如用含有所述多肽編碼序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA或者粘粒DNA表達載體轉化的細菌，用含有所述多肽編碼序列的重組酵母表達系統轉化的酵母，用重組病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒CaMV、煙草花葉病毒TMV)感染的或者用含有所述多肽編碼序列的重組質粒表達載體如Ti質粒轉化的植物細胞系統。在一些實施方案中，使用非細菌表達系統(例如哺乳動物表達系統如CHO細胞)，以表達本發明凝固因子。在一個實施方案中，用于在哺乳動物細胞中表達本發明多核苷酸的表達載體是pCI-DHFR載體，其包含CMV啟動子和新霉素抗性基因。pCI-dhfr載體的構建根據實施例I所述實施方案進行。在一些實施方案中，在本發明的細菌系統中，根據希望表達的多肽的用途而可以有利地選擇許多表達載體。在一個實施方案中，需要大量的多肽。在一個實施方案中，需要指導蛋白質產物高水平表達的載體，可以是作為與疏水性信號序列的融合體，其指導表達產物進入細菌或者培養基的外周，在此蛋白質產物易于被純化。在一個實施方案中，用特異性裂解位點改造的某融合蛋白有助于所述多肽的回收。在一個實施方案中，適合這種操作的載體包括但不限于pET系列大腸桿菌表達載體[Studier et al. , Methods inEnzymol. 185 :60-89(1990)]。在一個實施方案中，使用酵母表達系統。在一個實施方案中，含有組成型或者可誘導啟動子的許多載體可用于酵母中，如美國專利申請No :5，932，447所掲示的。在另ー個實施方案中，使用促進外源DNA序列整合進酵母染色體中的載體。在一個實施方案中，本發明的表達載體可進ー步包括額外的多核苷酸序列，如內部核糖體進入位點(IRES)及用于啟動子嵌合多肽的基因組整合的序列，其使得例如從單個mRNA中翻譯ー些蛋白質。在一些實施方案中，哺乳動物表達載體包括但不限于pcDNA3、pcDNA3. I (+/-)、pGL3、pZeoSV2 (+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3. I、pSinR印5、DH26S、DHBB, pNMTl、pNMT41、pNMT81,這些載體可得自 Invitrogen ;及 pCI，其可得自 Promega ;pMbac、pPbac、pBK-RSV 和 pBK-CMV,其可得自 Strategene ；以及 pTRES,其可得自Clontech ;以及這些載體的衍生物。在一些實施方案中，本發明使用含有來自真核病毒如逆轉錄病毒的調節元件的表達載體。SV40載體包括pSVT7和pMT2。在一些實施方案中，衍生自牛乳頭狀瘤病毒的載體包括pBV-lMTHA，衍生自Epstein Bar病毒的載體包括pHEBO和p205。其它舉例的載體包括pMSG、pAV009/A+、pMT010/A+、pMAMneo-5、桿狀病毒pDSVE，以及使得蛋白質在啟動子指導下表達的任何其它載體，所述啟動子是SV-40早期啟動子、SV-40晩期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、Rous肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子,或者示出在真核細胞中有效表達的其它啟動子。在一些實施方案中，重組病毒載體可用于在體內表達本發明的凝固因子，因為其呈現出如橫向(lateral)感染和祀向特異性等優勢。在一個實施方案中，橫向感染是如逆轉錄病毒生命周期中固有的，是單個感染的細胞產生許多后代病毒顆粒及其出芽及感染相鄰細胞的過程。在一個實施方案中，結果是大面積被迅速感染，其中大部分最初不是被原始病毒顆粒感染的。在一個實施方案中，產生不能橫向傳播的病毒載體。在一個實施方案中， 如果希望的目的是將指定基因導入僅局限數目的靶細胞，則可以使用這個特性。在一個實施方案中，可以使用不同方法將本發明表達載體導入細胞中。這種方法通Vf在 Sambrook et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold SpringsHarbor Laboratory, New York(1989,1992)、Ausubel et al. , Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley and Sons,Baltimore,Md. (1989)、Chang et al. , SomaticGene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)、Vega et al. , Gene Targeting, CRCPress,Ann Arbor Mich. (1995)、Vectors A Survey of Molecular Cloning Vectors andTheir Uses,Butterworths,Boston Mass. (1988)及Gilboa et at. [Biotechniques 4(6)504-512,1986]中描述，包括例如穩定或者瞬時轉染、脂染、電穿孔以及用重組病毒載體感染。此外，見美國專利No. 5，464，764和5，487，992所述關于陽性_陰性選擇方法。在一些實施方案中，通過病毒感染導入核酸呈現出優于其它方法如脂染和電穿孔方法的優勢，優于病毒的感染性質可以獲得較高的轉染效率。在一個實施方案中，意識到本發明的改造凝固因子也可以從核酸構建體中表達， 所述核酸構建體通過使用任何合適的施用模式來提供給個體，如上文所述(即體內基因治療方法)。在一個實施方案中，所述核酸構建體通過適當的基因輸送載體/方法(轉染、轉導、同源重組等)并且在需要時的表達系統被導入合適細胞中，然后使修飾的細胞培養擴增并重新輸送至所述個體中(即離體基因治療方法)。在一個實施方案中，使用植物表達載體。在一個實施方案中，多肽編碼序列的表達通過許多啟動子驅動。在一些實施方案中，使用病毒啟動子如CaMV的35S RNA和19S RNA 啟動子[Brisson et al. , Nature 310 :511-514 (1984)]，或者使用 TMV 的外殼蛋白啟動子[Takamatsu et al.，EMBO J. 6 :307-311 (1987)]。在另ー個實施方案中，使用植物啟動子，如 RUBISC0 的小亞基[Coruzzi et al.，EMBO J. 3 :1671-1680 (1984);Brogli et al.，Science224 :838-843 (1984)]，或者熱休克啟動子，例如大豆 hspl7. 5-E或 hspl7. 3-B[Gurley et al.，Mol. Cell. Biol. 6 :559-565 (1986)]。在一個實施方案中，使用如下方式方法將構建體導入植物細胞中，如使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電穿孔及本領域技術人員熟知的其它技術。見例如Weissbach &WeissDach[Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY,Section VIII,PP 421-463(1988)]。本領域熟知的其它表達系統如昆蟲和哺乳動物宿主細胞系統也可以用于本發明中。應意識到除了含有插入的編碼序列(編碼所述多肽)轉錄和翻譯的必需元件之夕卜，本發明的表達構建體也可以包含改造為優化表達的多肽的穩定性、產生、純化、產量或者活性的序列。在一些實施方案中，可以使用不同方法將本發明的表達載體導入宿主細胞系統中。在一些實施方案中，這種方法通常在Sambrook et al. , Molecular Cloning ALaboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989,1992)、Ausube丄et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore,Md. (1989)、Chang et al. , Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)、Vega et al. , Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)、Vectors A Surveyof Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass. (1988)以及Gilboa et at. [Biotechniques 4(6) :504-512,1986]中描述,包括例如穩定或者瞬時轉染、脂染、電穿孔及重組病毒載體感染。此外，見美國專利No. 5，464，764和5，487，992所述陽性-陰性選擇方法。在一些實施方案中，轉化的細胞在有效條件下培養，所述條件使得重組改造凝固因子以較高量表達。在一些實施方案中，有效培養條件包括但不限于允許蛋白質產生的有效的培養基、生物反應器、溫度、PH和氧條件。在一個實施方案中，有效培養基是指在其中培養細胞以產生本發明重組多肽的任何培養基。在一些實施方案中，培養基典型包括水溶液，其具有可同化的碳、氮和磷酸鹽來源，以及合適的鹽、礦物質、金屬及其它營養素如維生素。在一些實施方案中，本發明的細胞可以在常規發酵生物反應器、搖瓶、試管、微滴定平板和培養皿中培養。在一些實施方案中，培養是在適合重組細胞的溫度、pH和氧含量條件下進行。在一些實施方案中，培養條件在本領域技術人員專業范圍內。在一些實施方案中，根據用于生產的載體和宿主系統，所得的本發明的改造的凝固因子保留在所述重組細胞內、分泌進發酵培養基中、分泌進兩個細胞膜之間的空間如大腸桿菌壁膜間隙內，或者保留在細胞或者病毒膜外表面上。
在一個實施方案中，在預定培養時間之后，進行重組改造凝固因子的回收。在一個實施方案中，本文所用短語“回收重組改造凝固因子”是指收集含有所述多肽的全部發酵培養基而無需包括額外的分離或者純化步驟。在一個實施方案中，使用多種標準蛋白質純化技術純化本發明的改造凝固因子，所述技術例如但不限于親和性層析、離子交換層析、過濾、電泳、疏水性相互作用層析、凝膠過濾層析、反向層析、伴刀豆球蛋白A層析、色譜聚焦以及不同溶解度。在一個實施方案中，為了便于回收，所述表達的編碼序列可以被改造為編碼本發明的改造凝固因子及融合的可裂解部分。在一個實施方案中，可以設計融合蛋白以便所述多肽可易于通過親和性層析分離，例如通過固定在特異于所述可裂解部分的柱上。在一個實施方案中，裂解位點改造在所述改造凝固因子與可裂解部分之間，所述多肽通過用合適的酶或者在此位點特異性裂解所述融合蛋白的物質處理而從層析柱中釋放[例如見Booth et al. , Immunol. Lett. 19 :65-70 (1988)以及 Gardella et al. , J. Biol. Chem. 265 15854-15859(1990)]ο在一個實施方案中，本發明的改造凝固因子是以“基本純的”形式回收的。在一個實施方案中，短語“基本純的”是指所述蛋白質在本文所述的應用中可以有效使用的純度。在一個實施方案中，本發明的改造凝固因子也可以通過使用體外表達系統合成。在一個實施方案中，體外合成方法為本領域熟知，所述系統的成分可以商購。在一些實施方案中，所述重組的改造凝固因子是合成及純化的，其治療效カ可以在體內或者體外測定。在一個實施方案中，本發明的重組改造凝固因子可以使用本領域技術人員已知的各種測定法確定。在另ー個實施方案中，本發明的改造凝固因子可以提供給個體。在一個實施方案中，本發明的改造凝固因子可以作為藥物組合物的一部分提供給個體，其在所述藥物混合物中與藥物可接受的載體混合。在另ー個實施方案中，“藥物組合物”是指ー或多種本文所述活性成分與其它化學成分如生理學合適的載體和賦形劑的制備物。藥物組合物的目的是便于將化合物施用給生物體。
在另一個實施方案中，“活性成分”是指感興趣的多肽序列，其可以發揮相應生物學作用。在另一個實施方案中，本發明的任何組合物將包含至少一個CTP序列，所述序列以任何形式僅結合感興趣的改造凝固因子的羧基末端。在一個實施方案中，本發明提供了組合的制備物。在一個實施方案中，“組合的制備物”特別是指“試劑盒部分”，其中上述 組合成分可以單獨施用或者通過使用與不同量的組合成分的不同的固定組合施用，即同時施用、單獨或者相繼施用。在一些實施方案中，試劑盒部分可以同時或者相繼交錯施用，即在不同時間點及與所述試劑盒的其它任何部分以相等或不同時間間隔施用。在一些實施方案中，所述組合成分的總量的比率可以在所述組合制備物中施用。在一個實施方案中，所述組合的制備物可以變化，例如以應付治療的患者亞群的需要或者由于特殊疾病、疾病的嚴重程度、年齡、性別或者體重等而有不同需要的單個患者的需要，這些改變可以由本領域技術人員實現。在另一個實施方案中，短語“生理學可接受的載體”和“藥物可接受的載體”可互換使用，是指對于生物體不引起明顯刺激作用且不削弱所施用的化合物的生物學活性和性質的載體或者稀釋劑。佐劑包含在這些短語范疇內。在一個實施方案中，所述藥物可接受的載體中包含的成分之一可以例如是聚乙二醇(PEG)，這是在有機和水溶液介質中均具有廣泛溶解性的生物相容聚合物(Mutter et al. (1979)。在另一個實施方案中，“賦形劑”是指加入藥物組合物中以進一步便于施用活性成分的惰性物質。在一個實施方案中，賦形劑包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖以及淀粉、纖維素衍生物、凝膠、植物油及聚乙二醇。配制和施用藥物的技術可見于最新版本的"Remington’ sPharmaceuticalSciences, " Mack Publishing Co. , Easton, PA,所述文獻并入本文作參考。在另一個實施方案中，合適的施用途徑例如包括口服、經直腸、經粘膜、經鼻、腸道或者腸道外施用，包括肌內、皮下和骨髓內注射，以及鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或者眼內注射。在另一個實施方案中，所述制備物是以局部而不是全身方式施用，例如通過將所述制備物直接注射進患者身體的指定區域。本發明涵蓋各種不同的施用劑量實施方案。在一個實施方案中，本發明的改造凝固因子的劑量是在O. 005-100mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在O. 005-5mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量在O. 01-50mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在O. l_20mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在O. I-IOmg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在O. 01-5mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在O. 001-0. Olmg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在O. 001-0. Img/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在O. l-5mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在O. 5-50mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在O. 2-15mg/天的范圍。在另一個實施方案中,所述劑量是在O. 8-65mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在l_50mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在5-1Omg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在8-15mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在10-20mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在20-40mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在60-120mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在12-40mg/天的范圍在另一個實施方案中，所述劑量是在40-60mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在50-100mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在l_60mg/天的范圍。在另一個實施方案中,所 述劑量是在15-25mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在5-10mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在55-65mg/天的范圍。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以鼻內施用形式配制。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以注射形式配制。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以O. OOOlmg-O. 6mg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以
O.00lmg-o. 005mg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以O. 005mg-0. Olmg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以O. Olmg-O. 3mg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以O. 2mg-0. 6mg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，凝固因子的氨基末端沒有CTP。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以I-IOOyg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以IO-SOyg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以20-60劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以10-50 yg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以40-80 yg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以KKBOyg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以30-60 μ g劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以O. 2mg_2mg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以2mg-6mg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以4mg-10mg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽以5mg-15mg劑量范圍施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽被注射進肌肉中(肌肉注射)。在另一個實施方案中，包含凝固因子及至少一個CTP單位的多肽被注射至皮下(皮下注射)。在另一個實施方案中，包含IFN蛋白及CTP單位的多肽被注射進肌肉中。在另一個實施方案中，包含IFN蛋白和CTP單位的多肽被注射至皮下。在另一個實施方案中，本發明的方法包括增加凝固因子治療應用的順應性，包括為需要治療的對象提供多肽，所述多肽包含凝固因子、附著于所述凝固因子氨基末端的一個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)以及附著于所述凝固因子羧基末端的兩個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽，從而增加凝固因子治療應用的順應性。在另一個實施方案中，本發明的方法包括增加患有慢性疾病的需要凝固因子治療的患者的順應性。在另一個實施方案中，本發明的方法使得可以降低凝固因子的施用頻率，通過如上述用CTP修飾所述凝固因子而實現。在另一個實施方案中，術語順應性(compliance)包括堅持性(adherence)。在另一個實施方案中，本發明的方法包括通過降低凝固因子的施用頻率而增加需要凝固因子治療的患者的順應性。在另一個實施方案中，所述凝固因子的施用頻率的降低是通過CTP修飾實現的，所述修飾使得CTP修飾的凝固因子更穩定。在另一個實施方案中，所述凝固因子的施用頻率的降低作為延長所述凝固因子T1/2的結果而實現。在另一個實施方案中，降低所述凝固因子的施用頻率是增加所述凝固因子的清除時間的結果。在另一個實施方案中，所述凝固因子的施用頻率的降低作為增加所述凝固因子的AUC量度的結果而實現。在另一個實施方案中，提供了降低凝固因子給藥頻率的方法，所述方法包括將1-10個CTP附著至凝固因子羧基末端的步驟，由此降低凝固因子的給藥頻率。在另一個實施方案中，提供了降低凝固因子給藥頻率的方法，所述方法包括將1-5個CTP附著至凝固因子羧基末端的步驟，從而降低凝固因子的給藥頻率。
在另一個實施方案中，提供了在使用凝固因子治療中提高順應性的方法，所述方法包括為需要治療的對象提供多肽，所述多肽包含凝固因子及附著于所述凝固因子羧基末端的1-10個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽，從而在使用凝固因子治療中提高順應性。在另一個實施方案中，提供了在使用凝固因子治療中提高順應性的方法，所述方法包括為需要治療的對象提供多肽，所述多肽包含凝固因子及附著于所述凝固因子羧基末端的1-5個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽，從而在使用凝固因子治療中提高順應性。在另一個實施方案中，包含凝固因子和至少一個CTP單位的多肽每天一次施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子和至少一個CTP單位的多肽每兩天一次施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子和至少一個CTP單位的多肽每三天一次施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子和至少一個CTP單位的多肽每四天一次施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子和至少一個CTP單位的多肽每五天一次施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子和至少一個CTP單位的多肽每六天一次施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子和至少一個CTP單位的多肽每周一次施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子和至少一個CTP單位的多肽每7-14天一次施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子和至少一個CTP單位的多肽每10-20天一次施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子和至少一個CTP單位的多肽每5-15天一次施用給對象。在另一個實施方案中，包含凝固因子和至少一個CTP單位的多肽每15-30天一次施用給對象。在另一個實施方案中，所述劑量是在50_500mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在50-150mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在100-200mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在150-250mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在200-300mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在250-400mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在300-500mg/天的范圍。在另一個實施方案中，所述劑量是在350-500mg/天的范圍。在一個實施方案中，所述劑量是20mg/天。在一個實施方案中，所述劑量是30mg/天。在一個實施方案中，所述劑量是40mg/天。在一個實施方案中,所述劑量是50mg/天。在一個實施方案中，所述劑量是O. Olmg/天。在另一個實施方案中,所述劑量是O. Img/天。在另一個實施方案中，所述劑量是Img/天。在另一個實施方案中，所述劑量是O. 530mg/天。在另一個實施方案中，所述劑量是O. 05mg/天。在另一個實施方案中,所述劑量是50mg/天。在另一個實施方案中，所述劑量是IOmg/天。在另一個實施方案中，所述劑量是20-70mg/天。在另一個實施方案中，所述劑量是5mg/天。
在另一個實施方案中,所述劑量是l_90mg/天。在另一個實施方案中,所述劑量是l-90mg/2天。在另一個實施方案中，所述劑量是l_90mg/3天。在另一個實施方案中，所述劑量是l-90mg/4天。在另一個實施方案中，所述劑量是l_90mg/5天。在另一個實施方案中，所述劑量是l-90mg/6天。在另一個實施方案中，所述劑量是l_90mg/周。在另一個實施方案中，所述劑量是l-90mg/9天。在另一個實施方案中，所述劑量是l_90mg/ll天。在另一個實施方案中，所述劑量是l_90mg/14天。在另一個實施方案中，所述凝固因子的劑量是10_50mg/天。在另一個實施方案中，所述劑量是10-50mg/2天。在另一個實施方案中，所述劑量是10-50mg/3天。在另一個實施方案中，所述劑量是10_50mg/4天。在另一個實施方案中，所述劑量是10-50mg/5天。在另一個實施方案中，所述劑量是10-50mg/6天。在另一個實施方案中，所述劑量是10-50mg/周。在另一個實施方案中，所述劑量是10-50mg/9天。在另一個實施方案中，所述劑量是10-50mg/ll天。在另一個實施方案中，所述劑量是10-50mg/14天。在一個實施方案中，口服施用包括單位劑量形式，包括片劑、膠囊劑、錠劑、咀嚼片齊U、懸浮劑、乳劑(emulsion)等。這種單位劑量形式包含安全且有效量的希望的本發明的凝固因子，在一個實施方案中，其劑量從大約O. 7或3. 5mg至大約280mg/70kg，或者在另一個實施方案中，其劑量為大約O. 5或IOmg至大約210mg/70kg。適于口服單位劑量形式制備的藥物可接受的載體為本領域熟知。在一些實施方案中，片劑典型包含常規制藥學相容的佐劑如惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、甘露醇、乳糖和纖維素；結合劑如淀粉、凝膠和蔗糖；崩解劑如淀粉、褐藻酸和交聯羧甲纖維素(croscarmelose);潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸和滑石。在一個實施方案中，助流劑如二氧化硅可用于改善粉末混合物的流動特性。在一個實施方案中，從外觀而言可以加入著色劑如FD&C染料。甜味劑和香味劑如天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、甲醇、薄荷及果味調料可用于咀嚼片劑的佐劑。膠囊劑典型包含上述一或多種固體稀釋劑。在一些實施方案中，載體成分的選擇依賴于接下來的考慮事項，如味道、成本和貯存穩定性，其對于本發明的目的不是關鍵因素，可由本領域技術人員選擇。在一個實施方案中，口服劑型包含預定的釋放模式。在一個實施方案中，本發明的口服劑型包含持續釋放片劑、膠囊劑、錠劑或者咀嚼片劑。在一個實施方案中，本發明的口服劑型包含緩釋片劑、膠囊劑、錠劑或者咀嚼片劑。在一個實施方案中，本發明的口服劑型包含立即釋放片劑、膠囊劑、錠劑或者咀嚼片劑。在一個實施方案中，所述口服劑型根據所述藥物活性成分的希望釋放模式配制，如本領域技術人員已知。在一些實施方案中，口服組合物包含液體溶液、乳劑、懸浮劑等。在一些實施方案中，適于制備這種組合物的藥物可接受的載體為本領域熟知。在一些實施方案中，液體口服組合物包含大約O. 001%至大約O. 933%的希望的化合物，或者在另一個實施方案中，包含大約O. 01%至大約10%的希望的化合物。在一些實施方案中，用于本發明方法中的組合物包含溶液或者乳劑，在一些實施方案中是包含安全且有效量的本發明化合物的水性溶液或者乳劑，及任選含有用于局部鼻內施用的其它化合物。在一些實施方案中，所述組合物包含大約O. 001%至大約10. 0% w/V的所述化合物，更優選包含大約00. 1%至大約2. O %的所述化合物，用于通過鼻內途徑系統性輸送所述化合物。在另一個實施方案中，所述藥物組合物通過靜脈內、動脈內或者肌內注射液體制備物的方式施用。在一些實施方案中，液體配制物包括溶液、懸浮劑、分散劑、乳劑、油劑等。在一個實施方案中，所述藥物組合物經靜脈內施用，因此配制成適于靜脈內施用的形式。在另一個實施方案中，所述藥物組合物經動脈內施用，因此配制成適于動脈內施用的形式。在另一個實施方案中，所述藥物組合物經肌內施用，因此配制成適于肌施用的形式。進一步地，在另一個實施方案中，所述藥物組合物局部施用于身體表面，因此配制成適于局部施用的形式。合適的局部配制物包括凝膠、軟膏(ointments)、乳膏(creams)、洗劑(lotions)、滴劑(drops)等。對于局部施用，本發明的化合物與另外的適當治療劑組 合、制備及作為在有或無藥物載體的生理學可接受的稀釋劑中的溶液、懸浮劑或者乳劑形式應用。在一個實施方案中，本發明的藥物組合物通過本領域熟知的方法生產，例如通過常規混合、溶解、粒化(granulating)、包衣(dragee-making)、水磨(levigating)、乳化、膠囊化、包入(entrapping)或者凍干等方法。在一個實施方案中，用于本發明中的藥物組合物以常規方式配制，配制時使用一或多種生理學可接受的載體，包括賦形劑和輔助劑，其便于將所述活性成分加工成可以藥物學應用的制備物。在一個實施方案中，配制依賴于選擇的施用途徑。在一個實施方案中，本發明的注射劑在水溶液中配制。在一個實施方案中，本發明的注射劑在生理學相容的緩沖液如中Hank' s溶液、Ringer' s溶液或者生理鹽水緩沖液中配制。在一些實施方案中，對于經粘膜施用，在配制中使用適于滲透通過屏障的滲透劑。這種滲透劑為本領域已知。在一個實施方案中，本文所述制備物配制為腸道外施用形式，例如通過推注(bolus injection)或者連續輸注形式。在一些實施方案中，注射用配制物是單位劑量形式，例如在安瓿或者在多劑量容器中，任選具有加入的防腐劑。在一些實施方案中，組合物是在油相或者水溶液載體中的懸浮劑、溶液或者乳劑，且含有配制劑如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。在一些實施方案中，所述組合物還包含防腐劑，如苯扎氯銨(benzalkoniumchloride)和硫柳萊(thimerosal)等；螯合劑如乙二胺四乙酸鈉(edetate sodium)等；緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽和乙酸鹽緩沖液；張度劑如氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇等；抗氧化劑如抗壞血酸、乙酰半胱氨酸、焦亞硫酸鈉等；芳香劑、粘性調節劑如聚合物，包括纖維素及其衍生物；以及聚乙烯醇和酸及堿，以根據需要調節這些水相組合物的PH值。在一些實施方案中，所述組合物還包含局部麻醉劑或者其它活性成分。所述組合物可用作噴霧劑、合劑(mist)、滴劑等。在一些實施方案中，腸道外施用的藥物組合物包括水溶性形式的活性制備物的水溶液。此外，在一些實施方案中，活性成分的懸浮液制備成適當的基于油或水的注射懸浮液。在一些實施方案中，合適的親脂性溶劑或運載體包括脂肪油如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酸酯或者脂質體。在一些實施方案中，水相注射懸浮液含有增加該懸浮液粘性的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或者葡聚糖。在另一個實施方案中，所述懸浮液含有合適的穩定劑或者增加活性成分溶解性的制劑，以使得可以制備高濃縮的溶液。在另一個實施方案中，所述活性化合物可以在運載體、特別是在脂質體中輸送(見 Langer, Science 249:1527-1533(1990) ；Treat et al. , in Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.),Liss,New York,pp. 353-365(1989) ；Lopez-Berestein,ibid. ,pp. 317-327 ；see generallyibid)。 在另一個實施方案中，在控制釋放系統中輸送的藥物組合物配制成靜脈內輸注、可植入的滲透泵、透皮貼劑、脂質體或者其它施用模式。在一個實施方案中，使用泵(見Langer, supra ;Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14201 (1987) ；Buchwald et al.,Surgery 88:507(1980) ；Saudek et al.，N. Engl. J. Med. 321 :574 (1989)。在另一個實施方案中，可以使用聚合材料。在另一實施方案中，可以將控制釋放系統置于治療靶位的附近，即腦部，因此僅需要全身劑量的一部分(見例如Goodson, in Medical Applicationsof Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)。其它控制釋放系統參見Langer (Science 249:1527-1533(1990)論述。在一些實施方案中，所述活性成分是粉末形式，在使用之前用合適的運載體如無菌無熱原的基于水的溶液重建。在一些實施方案中，組合物配制成以霧化和吸入方式施用。在另一個實施方案中，組合物包含在具有附帶的霧化裝置的容器中。在一個實施方案中，本發明的制備物配制成直腸施用形式的組合物如栓劑或者保留灌腸劑，使用例如常規的栓劑基質如可可油或者其它甘油酯配制。在一些實施方案中，適用于本發明的藥物組合物包括其中包含以有效實現指定目的的量的所述活性成分。在一些實施方案中，治療有效量是指活性成分有效預防、減輕或者改善疾病癥狀或者延長治療對象生存時間的量。在一個實施方案中，治療有效量的確定為本領域技術人員熟知。可以作為藥物可接受的載體的物質或者其成分的一些實例是糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；粉末狀黃芪膠；麥芽；凝膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉花籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油及可可油(theotooma);多元醇如聚乙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露醇及聚乙二醇；褐藻酸；乳化劑，如Tween 乳化劑；濕潤劑，如十二燒基硫酸鈉；著色劑；香味劑；成片劑，穩定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽水；以及磷酸鹽緩沖溶液。與所述化合物聯合使用的藥物可接受的載體的選擇基本上由施用所述化合物的方式決定。在一個實施方案中，如果所述化合物是通過注射施用，則所述藥物可接受的載體是無菌生理鹽水，血液相容的懸浮劑，其PH已經調節為大約7. 4。此外，所述組合物進一步包含粘合劑(例如阿拉伯樹膠、玉米淀粉、凝膠、carbomer、乙基纖維素、瓜爾膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚烯吡酮)，崩解劑(例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、褐藻酸、二氧化娃、croscarmelose sodium、crospovidone、瓜爾膠、羥基乙酸淀粉鈉)，不同PH和離子濃度的緩沖液(例如Tris-HCl，乙酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液)，添加劑如白蛋白或者凝膠以防止吸附于表面，洗滌劑(例如Tween 20，Tween80, Pluronic F68,膽酸鹽)，蛋白酶抑制劑,表面活性劑(例如十二燒基硫酸鈉)，滲透增強劑，增溶劑(例如甘油、聚乙烯甘油)，抗氧化劑(例如抗壞血酸，焦亞硫酸鈉，丁基輕基苯甲醚)，穩定劑(例如輕丙基纖維素，輕丙基甲基纖維素)，增粘劑(例如carbomer,膠狀二氧化硅，乙基纖維素，瓜爾膠)，甜味劑(例如天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，檸檬酸)，防腐劑(例如Thimerosal,苯甲醇，parabens),潤滑劑(例如硬脂酸,硬脂酸鎂,聚乙二醇，十二烷基硫酸鈉)，助流劑(例如膠態二氧化硅)，增塑劑(例如鄰苯二甲酸二乙酯，檸檬酸三乙酯)，乳化劑(例如carbomer、輕丙基纖維素、十二燒基硫酸鈉,聚合物包衣(例如poloxamers或poloxamines),包衣和成膜劑(例如乙基纖維素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐劑。糖漿、酏劑、乳狀液和懸浮液的載體的典型成分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液體蔗糖、山梨糖醇和水。對于懸浮液，典型的懸浮劑包括甲基纖維素、羧 甲基纖維素鈉、纖維素(例如Avicel ，RC-591)、黃芪膠和藻酸鈉；典型的濕潤劑包括卵磷脂和聚環氧乙燒山梨聚糖(例如polysorbate 80)。典型的防腐劑包括輕苯甲酯(methyl paraben)和苯甲酸鈉。在另一個實施方案中，口服液體組合物還含有一或多種成分如上述甜味劑、香味劑及著色劑。所述組合物還包括將所述活性成分摻入在特定的聚合化合物制備物之中或之上，所述聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸(polglycolic acid)、水凝膠等，或者摻入在脂質體、微乳狀液、微團、單層(unilamellar)或多層(multilamelIar)小泡、紅細胞影(erythrocyte ghosts)或者原生質球)之上。這種組合物將影響物理狀態、溶解性、穩定性、體內釋放速率以及體內清除速率。本發明還涵蓋了用聚合物(例如poloxamers或者poloxamines)包被的特殊組合物，及與組織特異性受體、配體或者抗原的抗體結合的或者與組織特異性受體的配體結合的化合物。在一些實施方案中，通過共價附著水溶性聚合物修飾化合物，所述水溶性聚合物如聚乙二醇、聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或者聚脯氨酸。在另一個實施方案中，所述修飾的化合物呈現出與相應未修飾的化合物相比在靜脈內注射之后在血液中較長的半衰期。在一個實施方案中，修飾也增加所述化合物在水溶液中的穩定性，消除聚集，增強所述化合物的物理和化學穩定性，以及極大地降低了所述化合物的免疫原性和反應性。在另一個實施方案中，通過與未修飾的化合物相比以較低頻率或者較低劑量施用這種聚合物-化合物而實現希望的體內生物活性。在一些實施方案中，有效量或劑量的制備最初可以從體外測定中估算。在一個實施方案中，可以在動物模型中確定劑量，這種信息可用于更精確地確定在人體中的可用劑量。在一個實施方案中，如本文所述活性成分的毒性和治療效力可以通過標準制藥程序在體外、細胞培養或者實驗動物研究中確定。在一個實施方案中，得自這些體外和細胞培養測定及動物實驗研究的數據可用于配置用于人體的劑量范圍。在一個實施方案中，劑量根據使用的劑量形式和施用途徑而不同。在一個實施方案中，精確的配制物、施用途徑和劑量可以由主治醫生根據患者狀況選擇[見例如Fingl，et al.，(1975)" ThePharmacological Basis of Therapeutics" , Ch. Ip. I]。
在一個實施方案中，根據所治療的疾病的嚴重性及反應性，可以單次或者多次施用，治療時程從幾天至幾周或者直至治愈或者實現疾病狀態減輕。在一個實施方案中，組合物的施用量當然根據治療對象、疾病嚴重性、施用方式、主治醫生的判斷等因素確定。在一個實施方案中，也可以制備包含在相容的藥物載體中配制的本發明制備物的組合物，置于合適容器中，及標示治療指征。在另一個實施方案中，如本文所述凝固因子通過全身施用方式施用。在另一個實施方案中，如本文所述凝固因子通過靜脈內、肌內或者皮下注射方式施用。在另一個實施方案中，如本文所述凝固因子是凍干的(即冷凍干燥的)制備物，組合復合的有機賦形劑和穩定劑如非離子表面活性物質(即表面活性劑)、各種糖、有機多元醇和/或人血清白蛋白。在另一個實施方案中，藥物組合物包含在無菌注射水中凍干的如本文所述凝固因子。在另一個實施方案中，藥物組合物包含在注射用無菌PBS中凍干的如本文所述凝固因子。在另一 個實施方案中，藥物組合物包含在注射用無菌0.9% NaCl中凍干的如本文所述凝固因子。在另一個實施方案中，所述藥物組合物包含如本文所述凝固因子及復合載體如人血清白蛋白、多元醇、糖及陰離子表面活性穩定劑。見例如W089/10756 (Hara et al.-含有多元醇及P-羥基苯甲酸酯)。在另一個實施方案中，所述藥物組合物包含如本文所述凝固因子及乳糖酸和乙酸鹽/甘氨酸緩沖液。在另一個實施方案中，所述藥物組合物包含如本文所述凝固因子和氨基酸，如精氨酸或者谷氨酰胺，其增加干擾素成分在水中的溶解性。在另一個實施方案中，所述藥物組合物包含如本文所述凍干的凝固因子及甘氨酸或者人血清白蛋白(HSA)、緩沖液(例如乙酸鹽緩沖液)和等滲劑(例如NaCl)。在另一個實施方案中，所述藥物組合物包含如本文所述凍干的凝固因子及磷酸鹽緩沖液、甘氨酸和HAS。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物置于pH在大約4-7. 2之間的緩沖溶液中是穩定的。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物是用氨基酸作為穩定劑穩定的，在一些情況中用鹽作為穩定劑(如果所述氨基酸不含有帶電荷側鏈的情況)。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物是液體組合物，其包含重量在大約O. 3% -5%之間的穩定劑，所述穩定劑是氨基酸。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物提供了劑量準確性和產品安全性。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物提供了生物活性的穩定的液體配制物，用于注射應用中。在另一個實施方案中，所述藥物組合物包含如本文所述非凍干的凝固因子。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物提供了這樣的液體配制物，其使得可以長期以液態形式貯存，便于在施用之前貯存和運輸。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物包含固體脂質作為基質材料。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的注射用藥物組合物包含固體脂質作為基質材料。在另一個實施方案中，通過噴霧冷凝的脂質微粒的產生由Speiser (Speiser and al. , Pharm. Res. 8 (1991) 47-54)所述，隨后脂質納米球通過口服施用(Speiser EP 0167825(1990))。在另一個實施方案中，使用的脂質為機體良好耐受(例如由存在于腸道外營養乳狀液中的脂肪酸組成的甘油酯)。
在另一個實施方 案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物是脂質體形式(J. E. Diederichs and al.，Pharm. /nd. 56 (1994) 267-275)。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物包含聚合的微粒。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的注射用藥物組合物包含聚合的微粒。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物包含納米粒子。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物包含脂質體。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物包含脂質乳狀液。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物包含微球。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物包含脂質納米粒子。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物包含具有兩親性脂質的脂質納米粒子。在另一個實施方案中，包含如本文所述凝固因子的藥物組合物包含脂質納米粒子，所述脂質納米粒子包含藥物、脂質基質和表面活性劑。在另一個實施方案中，所述脂質基質具有至少50% w/w的甘油一酸酯含量。在一個實施方案中，本發明的組合物存在于包裝(pack)或者分配器(dispenser)中，如FDA批準的試劑盒，其含有一或多個單位劑量形式，所述單位劑量形式含有所述活性成分。在一個實施方案中，所述包裝例如包含金屬或者塑料薄片，如發泡包裝。在一個實施方案中，所述包裝或者分配器附帶使用說明書。在一個實施方案中，所述包裝或分配器在容器中附帶聲明，所述聲明的形式按照管理藥品制造、使用或銷售的政府機構規定，該聲明反映所述機構批準人用或獸用組合物形式。在一個實施方案中，這個聲明是由美國食品和藥品管理局批準的關于處方藥的標簽或者許可的產品插頁。在一個實施方案中，應意識到本發明的凝固因子可以與其它活性藥劑一起提供給個體，以實現與用單一藥劑自身治療相比改善的治療效力。在另一個實施方案中，測量與組合治療相關的副作用(例如互補藥劑的施用和選擇)。本發明的其它目的、優勢和新特征根據如下非限制性實施例的實驗將為本領域技術人員顯而易見。此外，如上文描述以及在下文權利要求書中所述的本發明的各個實施方案和各個方面在如下實施例中得到實驗支持。
實施例通常地，本文所用命名法及在本發明中使用的實驗程序包括分子學、生物化學、微生物學和重組DNA技術。這些技術在文獻中有充分闡述。見例如"Molecular Cloning A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989) ； " Current Protocols in MolecularBiology " Volumes I-III Ausubel, R. M. , ed. (1994) ；Ausubel et al. , " CurrentProtocols in Molecular Biology" , John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland (1989)；Perbal, " A Practical Guide to Molecular Cloning " , John Wiley & Sons, NewYork(1988) ；ffatson et al. , " Recombinant DNA " , Scientific American Books,New York ；Birren et al. (eds)" Genome Analysis A Laboratory Manual Series",Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998);方法學見如美國專利 No. 4，666，828 ;4，683，202 ;4，801，531 ;5，192，659 及 5，272，057 ; " Cell Biology A Laboratory Handbook " , Volumes I-III Cellis, J. E. , ed. (1994) ； " Culture ofAnimal Cells-AManual of Basic Technique" by Freshney, ffiley-Liss, N. Y. (1994),Third Edition ； " Current Protocols in Immunology " Volumes I-III ColiganJ. E. , ed. (1994) ；Stites et al. (eds), " Basic and Clinical Immunology " (8thEdition),Appleton & Lange,Norwalk,CT(1994) ；Mishell and Shiigi (eds)," SelectedMethods in Cellular Immunology " , W H. Freeman and Co. , New York(1980)；可利用的免疫測定在專利和學術論文中充分描述，見例如美國專利No. 3，791,932 ；3，839，153 ;3，850，752 ;3，850，578 ;3，853，987 ;3，867，517 ;3，879，262 ;3，901，654 ；3，935，074 ;3，984，533 ;3，996，345 ;4，034，074 ;4，098，876 ;4，879，219 ;5，011，771 和5,281,521 ； " Oligonucleotide Synthesis " Gait, M. J.，ed. (1984) ;“Nucleic AcidHybridization " Hames, B.D. , and Higgins S. J. , eds. (1985) ； " Transcriptionand Translation " Hames, B.D., and Higgins S. J. , eds. (1984) ； " Animal CellCulture " Freshney, R. I. , ed. (1986) ； " Immobilized Cells and Enzymes " IRLPress, (1986) ； " A Practical Guide to Molecular Cloning " Perbal, B. , (1984)and" Methods in Enzymology" Vol.1-317,Academic Press ； " PCR Protocols A GuideTo Methods And Applications" , Academic Press, San Diego, CA(1990) ；Marshak etal. , " Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual" CSHL Press (1996);所有這些文獻均并入本文作參考。其它一般的參考文獻在文中提供。實施例I凝固因子IX的產生和應用因子IX(FIX)是具有415個氨基酸(55KDa)的糖蛋白，其屬于與凝血系統相關的維生素K依賴型糖蛋白。FIX具有與因子FVII、因子X、蛋白質C和凝血酶原相似的結構域 組構，這些因子以前體被合成，具有N末端前肽及隨后的成熟氨基酸序列。FIX作為單鏈分子分泌，其經歷復雜的轉錄后修飾，許多修飾對于其生物化學和藥動學性質是關鍵的。在所有的轉錄后修飾中，在FIX氨基末端附近的12個谷氨酸殘基是最關鍵的殘基，其被維生素K依賴性Y羧化酶Y羧化。羧化是FIX與磷脂表面相互作用及最佳FIX活性所需的。所述氨基末端前肽作為Y羧化酶的識別位點，因此在Y羧化之后由已知稱作成對的堿性氨基酸裂解酶(Paired basic Amino acid Cleave Enzyme) (PACE/Furin)的高爾基復合體絲氨酸蛋白酶(Golgi apparatus serine protease)裂解除去。在高爾基復合體發生四個額外的轉錄后修飾，即第155位酪氨酸硫酸化、第158位絲氨酸磷酸化、第63和61位Ser的O-糖基化，及最后在第157位和16位的N-糖基化。FIX作為單鏈無活性酶原在血漿中循環(平均濃度為5 μ g/ml)。當由一或兩種生理學激活物FVIIa-TF復合物或FIXa在兩個肽鍵Arg 145和Arg 180進行蛋白酶解時，激活肽被除去，將FIX轉變為由單個二硫鍵連接的輕鏈和重鏈組成的完全活性的酶。所述N末端輕鏈含有非催化性Y-羧基谷氨酸(Gla)及兩個表皮生長因子樣結構域，而C末端重鏈含有該分子的胰蛋白酶樣催化結構域。單獨的FIXa特征在于不佳的催化活性。然而，當與FVIII復合時，其對于其天然底物FX的蛋白酶解活性增加4-5個量級。B型血友病是一種X連鎖的由因子IX(FIX)基因突變所致的出血性疾病，導致FIX的促凝固活性缺陷。B型血友病患者具有自發的軟組織出血及反復發作的關節血腫(hemarthroses),通常導致嚴重的關節病(Arthoathy)。目前治療這些患者的方法包括靜脈內施用重組FIX。然而FIX的成本及從循環中相對快速的清除的問題使得需要開發一種長效 FIX。CTP技術用于開發長效FIX。特別地，重組rFIX分子的延長的半衰期通過將至少一個人CTP與FIX融合而進行。所述重組的FIX-CTP在哺乳動物細胞中表達并在體外和體內進行鑒定。經證實rFIX-CTP的體外活性與rFIX相當。在大鼠中進行藥動學和藥效研究，證實rFIX-CTP的改善的性質。這項研究的結果證實開發具有與野生型酶相似的止血性質但半衰期延長的rFIX分子是可行的。重組FIX分子的克隆與表達將Dg44細胞鋪板于IOOmm組織培養皿中并生長至50_60%鋪滿。使用在無蛋白質培養基中的 FuGene 試劑(Roche) (Invitrogene CD Dg44)，將總共 2 μ g (微克)FIX cDNA用于轉染一個IOOmm平板。在轉染后48小時除去培養基，更換為無核苷及存在800 μ g/mlG418 (Neomycin)的無蛋白質培養基(Invitrogene CD Dg44)。14天后,將轉染的細胞群轉移至T25組織培養瓶中，持續選擇10-14天，直至細胞開始生長為穩定克隆。選擇高表達的克隆。將大約2xl07個細胞用于接種在1700cm2滾瓶(Corning,Corning NY)中的300ml生長培養基，其中補加了 5ng/ml維生素K3(甲基萘醌亞硫酸氫鈉；Sigma)。在細胞存活力迅速下降至大約70%之后，收集生產培養基(收獲物)。首先澄清所述生產培養基，然后濃縮大約20倍，使用流式過濾盒(IOKDa MWCO ；Millipore Corp.)用PBS透析。FIX抗原水平的確定FIX-CTP收獲物的抗原水平通過使用AssayMax Human FIX ELISA試劑盒(AssayPro-EF1009-l)確定,計算的蛋白質濃度是在兩個單獨實驗運轉中三個不同稀釋度的平均值(圖3A)。表I :計算的蛋白質濃度
權利要求
1.一種多肽，其由凝固因子及附著于所述凝固因子的羧基末端的1-5個促性腺激素羧基末端肽(CTP)組成。
2.權利要求I的多肽，其中所述肽由凝固因子及附著于所述凝固因子羧基末端的I或.2個促性腺激素羧基末端肽組成。
3.權利要求I的多肽，其中至少一個CTP的序列包含選自含有SEQIDNO 1和SEQ IDNO 2的組的氨基酸序列。
4.權利要求I的多肽，其中所述至少一個CTP是糖基化的。
5.權利要求I的多肽，其中所述至少一個CTP是截短的。
6.權利要求I的多肽，其中所述至少一個CTP通過接頭附著至所述凝固因子。
7.權利要求6的多肽，其中所述接頭是肽鍵。
8.權利要求I的多肽，其中所述凝固因子是維生素K依賴性糖蛋白。
9.權利要求I的多肽，其中所述凝固因子是因子IX。
10.權利要求I的多肽，其中所述凝固因子是因子VII。
11.權利要求I的多肽，其中所述凝固因子是因子Vila、因子VIII、重組B-結構域-缺失的因子 VIII (rFVIIIBDD)。
12.包含權利要求I的多肽的藥物組合物。
13.包含編碼多肽的編碼部分的多核苷酸分子，所述多肽由凝固因子及附著于所述凝固因子羧基末端的1-5個促性腺激素羧基末端肽組成。
14.權利要求13的多核苷酸分子，其中所述多肽由凝固因子及附著于所述凝固因子的羧基末端的I或2個促性腺激素羧基末端肽組成。
15.權利要求13的多核苷酸分子，其中所述至少一個CTP是截短的。
16.權利要求13的多核苷酸分子，其中至少一個CTP由選自含有SEQIDNO :1和SEQID NO 2的組的氨基酸序列編碼。
17.權利要求13的多核苷酸分子，其中所述凝固因子是維生素K依賴性糖蛋白。
18.權利要求13的多核苷酸分子，其中所述凝固因子是因子IX。
19.權利要求13的多核苷酸分子，其中所述凝固因子是因子VII。
20.權利要求13的多核苷酸分子，其中所述凝固因子是因子Vila、因子VIII、重組B-結構域-缺失的因子VIII (rFVIIIBDD)。
21.表達載體,其包含權利要求13的多核苷酸分子。
22.包含權利要求21的表達載體的細胞。
23.包含權利要求21的表達載體的組合物。
24.延長凝固因子生物學半衰期的方法，所述方法包括將至少一個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽附著至所述凝固因子羧基末端的步驟，由此改善凝固因子的生物學半衰期。
25.改善凝固因子曲線下面積(AUC)的方法，所述方法包括將至少一個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽附著至所述凝固因子羧基末端的步驟，由此改善凝固因子的曲線下面積(AUC)。
26.減少凝固因子給藥頻率的方法，所述方法包括將至少一個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽附著至所述凝固因子羧基末端的步驟，由此減少凝固因子的給藥頻率。
27.在使用凝固因子治療中提高順應性的方法，所述方法包括向有需要的對象提供一種多肽，所述多肽包含凝固因子、附著于所述凝固因子羧基末端的至少一個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽，由此在使用凝固因子治療中提高順應性。
28.治療患有血友病的對象的方法，所述方法包括向所述對象提供一種多肽，所述多肽包含凝固因子、附著于所述凝固因子羧基末端的至少一個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽，由此治療患有血友病的對象。
29.權利要求24-28的方法，包括將I或2個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽附著至所述凝固因子羧基末端的步驟。
30.權利要求24-28的方法，其中至少一個絨毛膜促性腺激素羧基末端肽的序列由選自含有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的組的氨基酸序列所編碼。
全文摘要
多肽及編碼其的多核苷酸，所述多肽包含附著至凝固因子羧基末端的至少一個絨毛膜促性腺激素的羧基末端肽(CTP)。還公開了包含本發明多肽和多核苷酸的藥物組合物以及使用其的方法。
文檔編號C07K14/59GK102639144SQ201080040296
公開日2012年8月15日 申請日期2010年7月1日 優先權日2009年7月9日
發明者G·哈特, U·E·菲馬 申請人:波洛爾生物科技有限公司