高親和力hiv t細胞受體的制作方法
【專利說明】高親和力HIVT細胞受體
[0001 ]本發明專利申請是第201210563915.4號中國發明專利申請的分案申請，該第 201210563915.4號申請是國際申請號為？(^/682006/001147、國際申請日為2006年3月29 日、進入中國國家階段的申請號為"200680011470.Γ、發明名稱為"高親和力HIVΤ細胞受 體"的發明專利申請的分案申請。
[0002] 本發明涉及對HIVGag多肽衍生的SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結合特性的Τ細胞 受體(TCR)。該TCR包含至少一個TCRa鏈可變區和/或至少一個TCR0鏈可變區，其對于所述 SLYNTVATL-HLA-A*0201 復合物的KD 小于或等于ΙμΜ和 / 或對SLYNTVATL-HLA-A*0201 復合物 的解離速率(kQff)為1X1 (r3S<或更慢。
[0003] 發明背景
[0004] 人免疫缺陷病毒(HIV)是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子。該病毒是屬 于慢病毒群(grOup)中的一種被膜逆轉錄病毒。SLYNTVATL(SEQIDN0:16)肽衍生自Gag基 因的gl7基因產物，Gag基因是構成人免疫缺陷病毒-l(HIV-l)的九個基因中的一個。該肽由 HLA-A*0201負載，并呈遞到HIV感染細胞的表面。因此，SLYNTVATL-HLA-A2*0201復合物提供 了一種TCR可靶向的HIV標記，例如為將細胞毒劑或免疫刺激劑遞送到感染細胞的目的。然 而，對于該目的，如果TCR對肽-HLA復合物具有高親和力和/或慢的解離速率將是有利的。
[0005] 發明概述
[0006] 本發明首次提供了對SLYNTVATL-HLA-A*0201復合物的親和力(KD)小于或等于ΙμΜ 和/或解離速率(Wf)為lxKTt1或更慢的TCR，前提是當所述TCR由細胞遞呈且包含SEQID NO: 1和2時，所述細胞不是天然T細胞。此類TCR不論單用或是與治療劑一起使用對于靶向遞 呈該復合物的HIV感染細胞都是很有利的。
[0007] 發明詳述
[0008] 本發明提供了一種T細胞受體(TCR)，其對SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結合特性， 并包含至少一個TCRa鏈可變區和/或至少一個ΤΟ?β鏈可變區，它的特征在于所述TCR對于所 述SLYNTVATL-HLA-A*0201 復合物的KD 小于或等于ΙμΜ和 / 或對于SLYNTVATL-HLA-A*0201 復 合物的解離速率(kQff)為1x10-3S-1或更慢，前提是當所述TCR由細胞遞呈且包含SEQIDN0: 1和2時，該細胞不是天然T細胞。
[0009] 可采用任何已知的方法測定KD和/或(koff)。一種優選的方法是實施例4中的表面 等離子共振(SurfacePlasmonResonance，Biacore)方法。
[0010] 為了比較，通過實施例4的基于Biacore方法測定親本HIVgagTCR(TCRa鏈見SEQ IDNO:9，TCR0鏈見SEQID勵：10)的二硫鍵連接的可溶性變體與51^階￥411-!11^-4*0201復 合物相互作用的KD約為85nM，解離速率(koff)為2.21X1(T2S-1，半衰期為0.17分鐘。
[0011] SLYNTVATL-HLA-A*0201復合物的特異性親本HIVGagTCR具有以下的Va鏈和Ve鏈 基因用途：
[0012] α鏈-TRAV12.2
[0013] β鏈-TRBV5.6
[0014]可將親本HIVGagTCR用作模板來產生本發明的其它TCR，所述其它TCR對于所述 TCR與SLYNTVATL-HLA-A*0201復合物之間的相互作用的高親和力高和/或解離速率慢。因 此，相對于親本HIVGagTCRa鏈可變區（參見圖la和SEQIDNo:l)和/或β鏈可變區（參見圖 lb和SEQIDNO:2)，本發明的TCR在其至少一個互補決定區（CDR)和/或可變區框架區發生 突變。本發明也考慮了本發明TCR可變區中的其它超變區（例如超變4(HV4)區）可在高親和 力突變TCR中發生突變。
[0015] 噬菌體展示為產生TCR變體文庫提供了一種手段。（Li等，（2005)NatureBiotech 23(3) :349-354)和WO2004/04404詳述了適于噬菌體展示和隨后的TCR變體文庫篩選的方 法，所述TCR變體各含有非天然鏈間二硫鍵。
[0016] 天然TCR以異二聚化的αβ或γδ形式存在。然而，現已顯示由單條TCRTCRa或ΤΟ?β 鏈組成的重組TCR可結合肽MHC分子。
[0017]在一個實施方式中，本發明的TCR包括a鏈可變區和TCRi3鏈的可變區。
[0018] TCRa鏈序列和/或TCRi3鏈序列中的突變可為一個或多個取代、缺失或插入，這對于 本領域技術人員而言是顯而易見的。可用任何合適的方法來實現這些突變，這些方法包括 但不限于:基于聚合鏈式反應(PCR)方法、基于限制性內切酶的克隆方法、或不依賴于連接 反應的克隆(LIC)方法。這些方法在許多標準分子生物學教材中有所詳述。關于聚合酶鏈式 反應（PCR)誘變法和基于限制性內切酶的克隆法更為詳盡的描述可參見（Sambr〇〇k& Russell，（2001)MolecularCloning-ALaboratoryManual(3rdEd.)《分子克隆實驗室指 南》第三版，CSHLPress)。關于LIC法的進一步描述可見于(Rashtchian，（1995)CurrOpin Biotechnol6(1):30_6)。
[0019] 應注意到包含相似Va和νβ基因應用并由此氨基酸序列與HIVGag相似的任何αβ TCR可用來制作便利的模板TCR。然后可能將產生本發明突變的高親和力TCR所需的改變引 入編碼模板aCTCR的一個或兩個可變區的DNA中。本領域技術人員顯然知道可通過許多方 法，例如定點誘變引入所需的突變。
[0020] 與圖la和SEQIDNo:l的親本HIVGagTCRa鏈可變區序列中這些位置的氨基酸相 比，本發明TCR包含那些在對應于以下所列的一個或多個TCRa鏈可變區的氨基酸發生突變 的TCR〇
[0021] 除非另有相反陳述，本文的TCR氨基酸序列一般含有N-末端甲硫氨酸(Met或Μ)殘 基。本領域技術人員可知該殘基在重組蛋白產生過程中可以除去。本領域技術人員也顯然 知道，可將其C-末端和/或Ν-末端的序列截短1、2、3、4、5個或更多個殘基，而基本不影響該 TCR的pMHC結合性能，本發明包括所有這些不重要的變體。
[0022]本文所用的術語"可變區"應理解為包括給定TCR的不包含在由TCRa鏈的TRAC基因 或TCRi3鏈的TRBC1或TRBC2基因所編碼的恒定區內的所有氨基酸(序列）。（《T細胞受體手冊》 (TcellreceptorFactsbook)，（2001)，LeFranc和LeFranc，科學出版社，ISBN0-12-441352-8)〇
[0023] 本文所用的術語"可變域"應理解為包括給定TCR的由TCRa鏈的TRAC基因或TCRf3鏈 的TRBV基因所編碼的所有氨基酸（序列^(《T細胞受體手冊》（Tcellreceptor Factsbook)，（ 2001)，LeFranc和LeFranc，科學出版社，ISBN0-12-441352-8) 〇
[0024]本領域技術人員可知，在本文定義的可變區和恒定區之間交界處由密碼子所編 碼的氨基酸中發生變異可導致TCR庫（repertoire)的部分多樣性。例如，存在于親本HIV GagTCR序列中該交界處的密碼子(突變)導致本文可變區序列的C-末端存在組氨酸(Η)殘 基。該組氨酸取代了圖8a所示，TRAC基因編碼的Ν-末端天冬酰胺(Ν)殘基。
[0025] 本發明的實施方式中包括含有對應于以下一個或多個α鏈可變區氨基酸發生突變 的突變性TCR:95Τ、96Ν、97S、98G和100Α，例如以下氨基酸：
[0026] 95S或G
[0027] 96Α
[0028] 97Η
[0029] 98D
[0030] 100S
[0031 ] 以上的編號與圖la和SEQIDNo: 1中所示的編號一致。
[0032] 本發明的實施方案也包括對應于以下所列的一個或多個TCRi3鏈可變區氨基酸相 對于圖lb和SEQIDNo: 2的天然HIVGagTCRf3鏈可變區中這些位置的氨基酸發生突變的 TCR。所指示的可能發生突變的氨基酸是:51Y、52E、53E和54E，例如：
[0033] 51V或A
[0034] 52R或L
[0035] 53G
[0036] 54V
[0037] 以上的編號與圖lb和SEQIDNo:2中所示的編號一致。
[0038] 本發明的其它優選實施方式是含有圖6所示突變的α鏈可變區氨基酸序列之一的 TCRJSEQIDN〇:ll到13)。這種TCR的表型沉默變體也構成本發明的一部分。
[0039] 本發明的其它優選實施方式是含有圖7所示突變的β鏈可變區氨基酸序列之一的 TCRJSEQID如：^和^穴這種^^的表型沉默變體也構成本發明的一部分。
[0040] 天然TCR存在異源二聚體αβ或γδ形式。然而，目前已顯示由αα或邱同源二聚體構 成的重組TCR能與肽MHC分子結合。因此，本發明的一個實施方式是TCRaa或TCR邱同源二聚 體。
[0041] 本發明的其它優選實施方式是含有下列α鏈可變區氨基酸序列和β鏈可變區氨基 酸序列組合的本發明的TCR，這類TCR的表型沉默變體也構成本發明的一部分：
[0043]在另一優選實施方案中，含有以上詳述的可變區組合的本發明TCR還含有圖8a所 示α鏈恒定區氨基酸序列（SEQIDN0:19)以及圖8b和8c所示β鏈氨基酸恒定區序列之一 (SEQIDΝ0:20和21)或其表型沉默變體。
[0044] 本文所用的術語"表型沉默變體"應理解為指對所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復合 物的KD小于或等于ΙμΜ和/或具有1X1(T3S4或更慢的解離速率(koff)的那些TCR。例如，本領 域技術人員已知可能產生與以上詳述的那些TCR相比，在其恒定和/或可變區中摻入了較小 變化但不改變與SLYNTVATL-HLA-A*0201復合物相互作用的親和力和/或解離速率的TCR。本 發明范圍包括這類不重要的變體。其中含有一個或多個保守取代的那些TCR也構成本發明 的一部分。
[0045] 就廣義而言，本發明TCR可以如W0 04/033685和W0 03/020763所述為單鏈TCR (scTCR)或二聚體TCR(dTCR)形式。
[0046]合適的scTCR形式包括：由對應于TCRa鏈可變區的氨基酸序列構成的第一區段，由 對應于TCRi3鏈可變區序列并與對應于TCRi3鏈恒定區胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合 的氨基酸序列構成的第二區段，和連接該第一區段C末端與該第二區段N末端的接頭序列。
[0047]或者，所述第一區段可由對應于TCRi3鏈可變區氨基酸序列構成，所述第二區段可 由對應于TCRa鏈可變區序列并與對應于TCRa鏈恒定區胞外序列的氨基酸序列的N末端相融 合的氨基酸序列構成。
[0048]以上scTCR在第一和第二鏈之間還含有二硫鍵，所述二硫鍵在天然αβΤ細胞受體中 沒有等價物，其中該接頭序列的長度和該二硫鍵的位置應使第一和第二區段的可變區序列 的相互取向基本上如天然αβΤ細胞受體中的那樣。
[0049] 更具體地說，所述第一區段可由對應于TCRa鏈可變區序列并與對應于TCRa鏈恒定 區胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構成，第二區段可由對應于TCRi3鏈 可變區序列并與對應于TCRi3鏈恒定區胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列 構成，和在第一和第二鏈之間可以存在天然αβΤ細胞受體中沒有等價物的二硫鍵。
[0050] 在以上scTCR形式中，接頭序列可連接第一區段C末端和第二區段Ν末端，其可如 式_PGGG_(SGGGG)n-P-所不，其中η是5或6，P是腫氨酸，G是甘氨酸，S是絲氨酸。
[0051] -PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQIDNO：17)
[0052] -PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQIDNO：18)
[0053] 本發明TCR的合適dTCR形式包括:第一多肽，其中對應于TCRa鏈可變區的序列的一 條序列與對應于TCRa鏈恒定區胞外序列的序列的N末端相融合;第二多肽，其中對應于TCRi3 鏈可變區序列的一條序列與對應于TCRi3鏈恒定區胞外序列的序列的N末端相融合;該第一 和第二多肽通過在天然αβΤ細胞受體中沒有等價物的二硫鍵相連。
[0054] 所述第一多肽可含有與對應于TCRa鏈恒定區胞外序列的序列的的Ν末端相融合的 TCRa鏈可變區序列，而第二多肽中對應于TCRi3鏈可變區序列的一條序列與對