專利名稱：一種純化重組人粒細胞集落刺激因子的方法
技術領域：
本發明涉及生物制藥領域，尤其涉及藥用重組人粒細胞集落刺激因子蛋白 的純化，特別涉及反相填料層析方法在重組人粒細胞集落剌激因子的純化方法。
技術背景粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,簡稱重組人粒 細胞集落刺激因子)具有促進粒細胞造血干細胞增殖分化及增強成熟細胞功能 的作用，對于骨髓移植時促進中性白細胞增加、癌癥化療時引起的嚴重的中性 粒細胞缺乏癥、以及再生障礙性貧血伴隨的中性白細胞缺乏癥均有明顯的療效， 但其天然產物來源非常有限，而基因工程的重組重組人粒細胞集落刺激因子的 生物學活性與天然的相似，且可大規模生產。重組人粒細胞集落刺激因子主要來源于巨噬細胞、內皮細胞及纖維母細胞。 能高度特異性的刺激中性白細胞系的前體細胞存活、增殖和分化，同時也是成 熟的中性白細胞的功能活化因子。重組人粒細胞集落刺激因子是糖蛋白，它的 分子量是19.6KD，等電點為約為6.0，分子中含有5個半胱氨酸殘基，可形成 兩個二硫鍵。基因定位在染色體17，它的基因含有5個外顯子和4個內含子， 現已成功地分離出兩個cDNA，分別編碼177個和174個氨基酸的蛋白質。分析 表明兩種形式的重組人粒細胞集落刺激因子都有生物活性，但作用上可能有所 差別。1993年，瞿成奎等人在國內首先克隆了人重組人粒細胞集落剌激因子 cDNA，并在大腸桿菌中獲得表達。由于原核細胞表達系統缺乏糖基化等翻譯后 的加工能力，生產的重組人粒細胞集落刺激因子在體內會部分降解而降低藥效， 所以研究人員在真核細胞表達系統中進行了重組人粒細胞集落刺激因子基因的構建，均成功地實現了重組人粒細胞集落刺激因子的表達。為了使重組人粒細 胞集落刺激因子的產量有進一步的提高，研究人員還進行了將重組人粒細胞集 落刺激因子與其它細胞因子融合表達的研究，崔立斌等人成功的獲得了重組人 粒細胞集落刺激因子-硫氧還原蛋白融合蛋白的可溶性表達，表達水平為總細胞 可溶蛋白的41%。目前，有關重組人粒細胞集落刺激因子分離純化的方法己有許多相關報道。 冃前，大多釆用"離子交換色譜一排阻色譜"純化法來純化重組人粒細胞集落刺激因子。先純化重組人粒細胞集落刺激因子的包含體，可得到含量為90%重組人粒細胞集落刺激因子的包含體，然后進行復性和一歩離子交換層析，可使最終蛋白純度達到95%,回收率為35%。通過"離子交換色譜一疏水層析"純 化重組人粒細胞集落刺激因子，比活可達到6.1Xl(^U/mg，蛋白純度為98%， 回收率為13.2%。采用稀釋法復性蛋白，之后經SP-seharoseFF陽離子層析純化 至純度95%，重組人粒細胞集落刺激因子的比活可達到2.3 X 108 U/mg。反相液相色譜(reverse - phase liquid chromato2graphy ， RPLC)是目前液相 色譜分離中使用最為廣泛的一種模式，其特點是固定相的極性比流動相弱。 RPLC與其他色譜方法相比具有分辨率和回收率高、重復性好、操作簡便等優 勢。由于RPLC可使用揮發性體系如水溶三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)等，純 化產物不必進行洗脫，因此大大簡化了操作步驟。另外，在RPLC中，蛋白質 分子通過色譜柱時會發生或多或少的去折疊，內部某些疏水殘基暴露并與固定 相相互作用，從而表現出與其他色譜及電泳方法不同的選擇性，提供其他方法不 能提供的信息，這成為RPLC在蛋白質分離分析中的又一有利因素。因此，RPLC 己成為目前廣泛使用的一種分離模式，普遍用于蛋白質的分離分析。Chlenov等 用RPLC對甲狀腺刺激激素進行了純化，Chertov等對T-淋巴細胞趨化因子進行了RPLC純化分析。傳統方法復性和純化重組人粒細胞集落刺激因子主要遇到的問題是重組 人粒細胞集落刺激因子的疏水性很強，在稀釋復性時，大量的蛋白聚集沉淀， 僅有少量的蛋白在溶液中復性，進而才能繼續被分離純化。針對重組人粒細胞 集落剌激因子的這一特點，本發明采用反相色譜填料對重組人粒細胞集落刺激 因子液進行了純化，不僅使重組人粒細胞集落剌激因子的純度和比活達到滿意 的結果，而且大大簡化了操作步驟、縮短了生產周期。 發明內容本發明可解決現有重組人粒細胞集落刺激因子純化技術的不足，是對基因工程蛋白分離純化手段的創新，大幅度提高重組人粒細胞集落刺激因子分離純 化后的蛋白純度、比活和穩定性。本發明解決的技術問題所采用的技術方案是在純化工藝中采用了反相填料 的精細分離純化步驟。包括步驟a、 將工程菌進行發酵培養；b、 對發酵培養所得菌體進行包涵體的分離和洗滌，得到粗品包涵體；c、 對粗品包涵體進行復性，獲得復性產物；d、 對復性產物進行離子柱層析處理，得到離子柱層析產物；e、 離子柱層析產物進行精細分離，采用反相填料柱層析處理，得到蛋白。 同現有技術相比較，采用本專利的反相填料精細分離，重組人粒細胞集落刺激因子電泳純度由90%提高到99%， HPLC純度由90X提高到99X，其比活由 6.1X107U/mg提高到2.3X108U/mg。可見，采用本發明的重組人粒細胞集落刺 激因子的純化工藝，可以大幅度的提高重組人粒細胞集落刺激因子的純度、比 活、穩定性。降低在臨床中的副作用。
具體實施方式
以下通過實施例、實驗例詳細說明本發明的內容，但這些實施例并不構成 對本發明的限制。 實施例1使用半制備型MKF-RP柱。樣品陽離子層析產物200ml，蛋白濃度2mg/ml。配制洗脫液A為含50mmolNaCl和20mmol Tris-HCl緩沖液(pH 8)，洗脫液 B為含50mmolNaCl溶液20mmol Tris-HCl 60。/。乙腈(pH 8)。先用洗脫液A洗脫，再用梯度洗脫15X-90X洗脫液B洗脫，10-55分鐘收集樣品峰。被收集的樣品經低溫蒸發，除去有機物質，然后透析濃縮后保存在4'C條件下。實施例2使用XK 50/30柱，用SBC MCL GEL型反相制備液相色譜填料裝柱。 樣品陰離子層析產物500ml，蛋白濃度2.2mg/ml。洗脫液A為20%磷酸鹽緩沖液，洗脫液B為含0.02%tween80的30%甲醇 溶液，流速為15ml /min 。梯度洗脫，在10-80分鐘20X-75。/。洗脫液B洗脫，收集樣品峰。收集樣品 時，收集中間部分。被收集的樣品經低溫蒸發，除去有機物質，然后透析濃縮 后保存在4"C條件下。實施例3使用Butyl-Sepharose 4Fast Flow， XK50H16層析柱。樣品陰離子層析產物500ml，蛋白濃度1.5mg/ml。添加硫酸銨到0.8M。平衡液20mmol/mlTris-HCl， PH8.0， 0.8M硫酸銨 預洗脫液20mmol/mlTris-HCl， PH8.0, 0.5M硫酸銨 洗脫液20mmol/mlTris-HCl， PH8.0， 0.2M硫酸銨收集洗脫液洗脫部分，透析除鹽即得。在4。C條件下對實施例1、 2、 3的樣品進行穩定考察，考察結果如下:0月批號比活電泳純度HPLC純度內毒素蛋白濃度實施例12. 3X10Wmg99%99%符合規定1. 3mg/ml實施例22. 1 X 108U/mg99%99%符合規定1. 3mg/ml實施例30. 6X108U/mg92%92%符合規定1. 2mg/ml3月批號比活電泳純度HPLC純度內毒素蛋白濃度實施例12. 3X108U/mg99%99%符合規定1. 3mg/ml實施例22. 1 X 108U/mg99%99%符合規定1. 3mg/ml實施例30. 6X108U/mg91%92%符合規定1. 2mg/ml6月批號比活電泳純度HPLC純度內毒素蛋白濃度實施例12. 2X108U/mg98%98%符合規定1. 3mg/ml實施例22.0XlOWmg98%97%符合規定1. 2mg/ml實施例30. 5X108U/mg89%88%符合規定1. lmg/ml12月批號比活電泳純度HPLC純度內毒素蛋白濃度實施例12. 0X詢/mg98%98%符合規定1. 2mg/ml實施例21. 9X 108U/mg97%97%符合規定1. 2mg/ml實施例30. 4X108U/mg86%85%符合規定1. Omg/ml以上數據說明，通過反向填料方法獲得的實施例1、 2樣品較實施例3，電泳純度與HPLC純度在12個月內均大于97%，比活達到2.0X 108U/mg以上，其他各項指標也符合藥典要求，實施例l、 2樣品可在4。C條件下放置12個月， 實施例3樣品在考察6個月時出現比活降低，蛋白純度下降的現象。說明通過 反向填料方法獲得重組人粒細胞集落刺激因子蛋白更加穩定。 '
權利要求
1、一種純化重組人粒細胞集落刺激因子的工藝方法。其特征在于采用了反相填料層析分離。
2、 根據權利要求1所述的反相填料層析分離前的樣品要求，其特征在于經過初 步的分離純化。
3、 根據權利要求2所述的初步分離純化，其特征在于經過陰離子或陽離子柱層 析處理。
4、 根據權利要求1所述的反相填料柱，其特征在采用預裝型柱和制備型杵。
5、 根據權利要求1所述的反相填料層析，其特征在采用反相色譜預裝柱或反相 填料預裝柱。
全文摘要
本發明涉及一種純化重組人粒細胞集落刺激因子的方法。本發明首次將反相填料的精細分離步驟應用于重組人粒細胞集落刺激因子的純化工藝中。同現有技術相比較，本發明首次采用反相填料精細分離重組人粒細胞集落刺激因子，電泳純度由90％提高到99％，HPLC純度由90％提高到99％，其比活由6.1×10⁷U/mg提高到2.3×10⁸U/mg。采用本發明的重組人粒細胞集落刺激因子的純化工藝，可以大幅度的提高重組人粒細胞集落刺激因子的純度、比活、穩定性，將有效降低其在臨床中的副作用。
文檔編號C07K1/20GK101597319SQ20081006465
公開日2009年12月9日 申請日期2008年6月3日 優先權日2008年6月3日
發明者淼 于, 冷國慶, 睿 龐, 李會成, 李鄭武, 梁秋波, 趙華南, 靜 陳, 陳玉軍 申請人:哈藥集團生物工程有限公司