含油體蛋白與重組成纖維生長因子18融合蛋白的油體的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，具體涉及含油體蛋白與成纖維細胞因子18融合蛋白的油體。
【背景技術】
[0002]成纖維細胞生長因子18 (FGF18，fibroblast growth factor 18)，屬于成纖維細胞生長因子家族。人類FGF家族包含至少23個成員，分為7個亞家族，分別為FGFl亞家族、FGF4亞家族、FGF7亞家族、FGF8亞家族、FGF9亞家族、FGF19亞家族。FGF18與FGF8，FGF17同屬于FGF8亞家族。
[0003]1998年由日本科學家Ohbayashi首次從老鼠胚胎中分離得到FGF18。FGF18在骨的生長和發育中發揮著十分重要的作用。FGF18在機體整個生命過程中都有表達，在骨骼以及其他部位如肝臟、腸道、腦、四肢、胰臟、皮膚、肺也有表達。
[0004]成纖維生長因子18(Fibroblast growth factor, FGF)又被稱為肝素親和生長因子(Heparinbinding growth factor, HBGF)，是一類通過與細胞膜特異性受體結合發揮作用的多肽分子。FGF18蛋白由207個氨基酸殘基組成的多肽分子，初始的27個疏水性殘基是可以切除的信號肽。在體外重組FGF18的研究中:Eunyi Jeon等采用大腸桿菌系統表達了全長的FGF18，利用融合在FGF18的N末端的組氨酸標簽進行純化，并研究了重組FGF18在大鼠骨髓間充質干細胞分化過程中的作用；Lintao Song等在大腸桿菌系統中表達了全長的FGF18，利用FGF18與肝素親和的性質進行純化，FGF18高表達，并且對毛發生長有促進作用。
[0005]FGF18沒有亞型，因此晶體結構也只有一種。Alan Brown等人對FGF18晶體結構的研究顯示:FGF18形成的原始單斜空間群是由四個FGF18分子聚合形成的不對稱結構。最后模型由50 - 179位殘留基和一個β-三葉草核心構成，而β-三葉草核心是由三個三四個鏈連接在一起的基團構成的，這些基團總共含有10個反向平行β折疊股。來自于不同基團的兩條鏈形成一個含有6個反向平行β折疊股的β折疊桶狀結構。FGF18上的賴氨酸殘基與肝素相連，155、156、161和164位賴氨酸組成典型的肝素結合位點，而113、115、119和125位賴氨酸殘基是FGF18獨有的肝素結合位點。FGF18對FGFR2c和FGFR3c有高度親和性，對FGFRb無親和性，對其他受體有弱親和性。FGF18中，多個精氨酸參與硫酸根離子的結合，比FGF1/2肝素接口檢測到的精氨酸多，而肝素接口的精氨酸殘基提供更高的親和力，這也許就能解釋為什么FGF18有比其他FGF更低的親和力。FGF18對所有的受體的親和性都比FGF8b弱。
[0006]FGF18結構和功能特點的多樣性和復雜性，決定了其在許多領域的重要地位以及良好的應用前景，其適應癥機制的研究主要有以下幾方面:
I骨生長和發育
在促進成骨細胞和軟骨細胞的增殖方面，FGF18和FGF2發揮同樣的功效，并且能夠補償FGF2在骨骼發育的作用。
[0007]在骨骼的形成過程中，FGF18通過活化FGFR2c或FGFR3c促進成骨細胞增殖和分化，但是在軟骨形成過程中，通過FGFR3C促進軟骨細胞增殖、抑制軟骨細胞的分化(Ohbayashi et al.2002)。
[0008]軟骨形成:FGF18通過FGFR3傳導信號調節關節骨和軟骨生長板增殖、分化和基質形成。不同時期的小鼠，FGF18和FGFR3傳導的信號對其軟骨發育的作用不同。在動物模型上，胚胎發育早期，FGF18促進軟骨細胞增殖、減少分化、增加生長面肥大域，如果FGF18缺失，將減少軟骨細胞的體積和數量，抑制軟骨的增殖和推遲軟骨肥大區起始時間；胚胎發育晚期和產后發育早期，FGF18抑制軟骨細胞的增殖和分化；成年個體上FGF18刺激細胞增殖、軟骨損傷修復、鼠氣管脊柱和關節軟骨積累。然而，在Naski, M.C、Yasoda, A.和Murakami, S的研究表明，FGFR3的過表達抑制軟骨細胞分化和基質形成。FGF18也影響基質的合成，FGF18促進不成熟的軟骨細胞產生更多的蛋白多糖和II型膠原蛋白，但是在分化完全、肥大的軟骨細胞中，僅增加ALP (堿性磷酸酶)和X型膠原蛋白的生成。
[0009]FGF18可以直接和FGFR3結合從而調控軟骨的形成過程，也可以通過調節hedgehog信號通路的IHH信號間接調控軟骨形成。ERK和p38MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)也參與FGF18調控軟骨細胞。Buchtova M等的研究中，成纖維細胞生長因子激活MAPK通路時，使MAPK通路和Wet通路的公共受體Lrp6 (人低密度脂蛋白受體相關蛋白6)磷酸化，從而使Wet通路也參與到軟骨分化的過程中。
[0010]成骨生成:在體外胚胎細胞培養中表明，FGF18的缺失將延遲骨化。Moore et al.(2005)和Ohbayashi et al.(2002)的研究發現FGF18的缺失將造成關節發育缺陷；延遲顱蓋骨閉合；長骨發育異常，變瘦、變短。Shimoaka et al.(2002)的體外實驗表明FGF18促進成骨細胞和破骨細胞的生成，減少分化和基質合成。Eunyi Jeon等通過檢測成骨標志基因如膠原蛋白I型、骨形成蛋白4和成骨特異性轉錄因子2的轉錄水平，驗證重組FGF18對成骨分化的促進作用，從而表明FGF18可用于提高骨的修復和再生能力。
[0011]FGF18主要通過MAPK和P13K通路來誘發成骨細胞的標志基因表達，即促進骨的形成。Nagayama T的研究中，FGF18通過提高BMP2的表達加速成骨細胞分化。FGF18通過激活RANKL (破骨細胞分化因子)和Cox-2 (環氧化酶_2)刺激破骨細胞的增生。在骨骼發育過程中，經典Wnt信號也發揮著重要的作用，Wnt信號通過誘導FGF18的表達，從而調控成骨生成過程。
[0012]2癌癥(直腸癌和卵巢癌)
FGF18是癌癥的早期標記，并有潛力成為抗癌藥物靶點。在肝癌、卵巢癌、結腸癌的病理切片中發現FGF18是過表達的，因此FGF18在癌癥發生過程中發揮著重要的作用，在癌癥細胞的增殖以及迀移方面發揮了作用，因此針對FGF18在癌癥領域的研究今年也不斷開展中，具體內容如下闡述。
[0013]肝癌:肝癌(HCC)是全世界最常見的癌癥類型之一，在全球范圍內腫瘤相關性死亡因素中排名第三。FGF18的過表達可促進肝癌細胞的增殖，為惡性腫瘤細胞在不利環境(無血清和低氧)下的生存提供營養。無血清培養下的細胞，FGF18表達增加，但是FGF18蛋白的表達并不是存在于細胞內，而是被分泌到培養基上清中。上清中的FGF18有利于肝癌細胞的生存，減少細胞的凋亡，但還是不足以完全應付無血清培養引起的凋亡，而加入重組FGF18后，被饑餓細胞凋亡率下降、處于細胞周期中S期和G2/M期的細胞所占比例增加。
[0014]卵巢癌:卵巢癌是病死率最尚的婦科癌癥。在美國，大約每七十名的婦女中就有一名罹患卵巢癌；每一百個婦女中就有一位死于卵巢癌。卵巢惡性腫瘤因病理類型不同而治療方案不同，多用手術治療聯合化療等綜合治療。由于卵巢的胚胎發育、組織解剖及內分泌功能較復雜，早期癥狀不典型，所以大部份的婦女被發現是卵巢癌的時候，通常都已經擴散，成為較晚期的癌癥，盡管現在被診斷為晚期的癌癥病人5年生存率有所提高，但長期存活率仍然保持在30%。因此，尋找卵巢癌發病早期的生物標志十分必要。FGF18信號通過調整卵巢癌的攻擊性和微環境調控腫瘤進展，腫瘤的發展和轉移都依賴于血管生成，而FGF18能直接促進血管生成，或者通過增加vEGF的量間接促進血管生成，進而影響卵巢癌的發生與發展。
[0015]結腸癌:FGF18不僅能影響腫瘤細胞，而且能改變腫瘤細胞周圍的微環境。在無血清培養的結腸癌細胞中，FGF18對于結腸癌細胞的生長和生存是必須的，FGF18可以在細胞內發揮作用也可以在細胞外發揮作用。在細胞培養早期，胞內FGF18分泌充足，細胞對于外界給予的重組FGF18不敏感，但是當胞內FGF18基因被敲除，細胞對外源的FGF18敏感。FGF18首先促進血管形成基底膜，然后生成血管，進而促進腫瘤發生和轉移。FGF