一種高效表達重組八因子的灌注培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種高效表達重組八因子的灌注培養方 法。
【背景技術】
[0002] 凝血八因子是目前治療血友病A (Hemophilia A, HA)的唯一治療方法，HA患者因 基因缺陷導致FVIII表達降低或功能缺陷，表現為凝血功能障礙和自發性出血。目前市售 有人血FVIII以及基因重組FVIII。但是人血FVIII產品仍然存在傳播不明血源性病原體 的可能，因此，在重組DNA技術的日益發展進步下，重組FVIII產品越來越受到重視。
[0003] 重組FVIII是利用基因重組技術，將編碼FVIII蛋白的基因片段插入質粒載體中， 而后將其質粒轉入能夠表達FVIII蛋白的哺乳動物細胞內。由于FVIII蛋白結構復雜，因 此必須選擇哺乳動物宿主細胞作為FVIII的表達載體。與細菌或酵母細胞不同，哺乳動物 細胞具有翻譯后修飾功能，例如溶蛋白性裂解、糖基化作用、羥基化作用及硫酸鹽化作用， 這些功能是形成具有活性的FVIII蛋白二、三級結構所必須的。但是由于FVIII是個特殊 的蛋白，糖基化比較復雜，蛋白不穩定，在培養過程中受溫度等培養條件影響很大，為了在 發酵過程中保證rFVIII的濃度以及質量，需要采用灌注培養的方式。
[0004] 灌注培養是指把細胞和培養基一起加入生物反應器后，在細胞增長和產物形成的 過程中，不斷地將部分培養基取出，同時又連續不斷地灌入新的培養基的細胞培養方式。連 續的灌注培養可以提供給細胞充分的營養成分，同時帶走代謝副產物，給細胞的生長提供 優良的環境，維持較高的細胞密度，使得細胞表達時間延長，可以大幅度提高生產產率。
[0005] 實現細胞灌注培養的核心技術是如果有效地對細胞進行截留，即在保證細胞密度 和活力的基礎上更換培養基。目前，常用的利用細胞截留裝置達到細胞灌注培養的方法主 要有：傾斜式重力沉降設備、離心細胞分離裝置、旋轉過濾灌注設備（Spin filter)、聲頻灌 流裝置、中空纖維柱細胞截留裝置等。雖然能夠適用的方法種類較多，但是這些方法均有非 常明顯的缺陷。

【發明內容】

[0006] 如上所述，現有技術中的各種方法均有非常明顯的缺陷。所以鑒于以上所述現有 技術的缺點，本發明的目的在于提供一種高效表達重組八因子的灌注培養方法，用于解決 現有技術中的問題。本發明所提供的高效表達重組八因子的灌注培養方法能夠同時充分發 揮截留方法和重組FVIII的灌注培養生產工藝的優勢，達到提高并維持細胞生長密度、延 長生產周期、增加 FVIII的產量、并保證FVIII的質量的效果。
[0007] 為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種高效表達重組八因子 的灌注培養方法，包括如下步驟：
[0008] 1)將重組FVIII細胞株的種子接種于反應器中進行批培養；
[0009] 2)當培養體系中葡萄糖含量為0. 5-1. 5g/L時，使用旋轉過濾灌注方法進入灌注 培養模式；
[0010] 3)當反應器內的細胞處于一個穩態階段，使用聲頻灌流方法和旋轉過濾灌注方法 同時進行灌注培養，維持細胞密度在2-3*10 7個/ml。
[0011] 本領域技術人員可根據重組FVIII細胞株的種類和具體實驗需求，選取合適的條 件對重組FVIII細胞株的種子進行擴增，并進一步將擴增所得的產物用于步驟1的接種過 程中。
[0012] 所述旋轉過濾灌注方法具體指：將一個旋轉過濾器（旋轉過濾灌注設備、Spin filter)按放在反應器的旋轉軸上，進行灌注培養。
[0013] 所述旋轉過濾灌注方法培養過程中培養基從篩面通過，細胞位于篩面外，在旋轉 過濾籠內有吸取管，能夠將籠內的培養液栗出，從而達到調整培養液參數的目的。
[0014] 所述使用聲頻灌流方法和旋轉過濾灌注方法同時進行灌注培養具體指：將一個旋 轉過濾器（旋轉過濾灌注設備、Spin filter)按放在反應器的旋轉軸上，同時在反應器上 安裝聲頻灌流裝置，進行灌注培養。
[0015] 所述使用聲頻灌流方法和旋轉過濾灌注方法同時進行灌注培養的過程中，培養基 從篩面通過，細胞位于篩面外，在旋轉過濾籠內有吸取管，能夠將籠內的培養液栗出，同時 基于聲頻引起細胞聚集的新型細胞截留裝置，是利用聲頻使細胞聚集后沉淀，促使胞液分 離，不僅截留效率高，而且不易堵塞，易于清洗和滅菌，而且在培養過程中，可以將部分細胞 碎片與上清液一起分離出反應器。
[0016] 本發明所提供的灌注培養方法可使用各種市售的旋轉過濾灌注設備和/或聲頻 灌流裝置，本領域技術人員可根據反應體系的具體參數選擇合適的旋轉過濾灌注設備和/ 或聲頻灌流裝置用于灌注培養。
[0017] 優選的，所述步驟1中，批培養的培養體系體積為4. 9-5. 1L。
[0018] 優選的，所述步驟1中，接種后培養體系中的細胞密度為0. 6-1. 0*106個/ml。
[0019] 本領域技術人員可根據重組FVIII細胞株的種類選擇合適的培養條件進行批培 養，在本發明一實施例中，批培養的具體條件為溫度37°C、pH 6.9、溶氧（D0)30-50%、初始 轉速90轉/min。
[0020] 優選的，所述步驟2中，當培養體系中葡萄糖含量為0. 8-1. 2g/L時，使用旋轉過濾 灌注方法進入灌注培養模式。
[0021] 優選的，所述步驟2中，灌注培養的培養體系體積為4. 9-5. 1L。
[0022] 優選的，所述步驟2中，灌注培養模式期間，保持葡萄糖含量在0. 8-1. 2g/L。
[0023] 優選的，所述步驟2中，保持培養體系中的細胞密度在1-2*107個/ml。
[0024] 本領域技術人員可根據培養體系和反應情況選取合適的方法從培養體系中抽取 部分細胞，以是培養體系的細胞密度維持在目標區間。
[0025] 優選的，所述步驟2中，灌注培養模式的培養時間為10-15天。
[0026] 優選的，所述步驟3中，灌注培養的培養體系體積為4. 9-5. 1L。
[0027] 優選的，所述步驟3中，維持細胞密度在2. 0-3. 0*107個/ml。
[0028] 本領域技術人員可根據培養體系和反應情況選取合適的方法從培養體系中抽取 部分細胞，以是培養體系的細胞密度維持在目標區間。
[0029] 優選的，所述步驟3中，灌注培養的培養時間為多60天。
[0030] 本領域技術人員可根據重組FVIII細胞株的種類選擇合適的培養條件進行灌注 培養，在本發明一實施例中，灌注培養的具體條件為溫度37°C、pH 6. 9、溶氧（DO) 30-50 %。
[0031] 本發明第二方面提供所述高效表達重組八因子的灌注培養方法在凝血八因子制 備領域的用途。
[0032] 本領域技術人員可根據反應體系的具體情況選取合適的提純方法對步驟3的反 應液進行處理，制備獲得凝血八因子產品。
[0033] 如上所述，本發明所提供的高效表達重組八因子的灌注培養方法采用聲頻灌流方 法和旋轉過濾灌注方法相結合灌流培養，先將擴增所得的重組FVIII細胞株的種子接種并 進行批培養，待反應器內營養物質消耗到一定水平（以檢測葡萄糖含量為衡量標準），先打 開旋轉過濾灌注設備進入灌注培養模式，而后到達一定細胞密度后再打開聲頻灌流裝置進 行雙系統灌注培養，并在培養過程中不定期抽去部分細胞，使反應器內的細胞保持一個合 適的細胞密度。本發明所提供的灌注培養方法取兩種細胞截留方式的長處，互補不足之處， 發揮最大的灌流效率。在細胞增殖生長期，先使用旋轉過濾灌注設備進行灌注培養，可以避 免聲頻灌流裝置在低密度條件下將細胞過多的帶出反應器中，導致細胞數量有一個驟減的 過程。而后達到一定細胞密度后，打開聲頻灌流裝置，可以同時利用兩個截留系統進行灌注 培養，一方面有了旋轉過濾灌注設備，使得可以讓聲頻灌流裝置在有效范圍內達到最優的 灌注體積，并且增加了反應器內溶氧的傳遞；另一方面，培養過程中產生的細胞碎片，在聲 頻灌流裝置的作用下離開反應器，使得反應器內的細胞活率處在一個較高的水平。
【具體實施方式】
[0034] 以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書 所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離 本發明的精神下進行各種修飾或改變。
[0035] 在進一步描述本發明【具體實施方式】之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案；還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍；在本發明說明書和權利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數形式"一個"、"一"和"這個"包括復數形式。
[0036]當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和 科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本 發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實 現本發明。
[0037] 除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術 領域常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組DNA技 術及相關領域的常規技術。這些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego ；ffolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego, 1998 !METHODS IN ENZYMOLOGY， Vol. 304,Chromatin(P. M. ffassarman and A. P. ffolffe,eds. ),Academic Press,San Diego, 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol. 119, Chromatin Protocols (P.B. Becker， ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0038] 實施例1
[0039] (I)細胞的接種
[0040] 細胞庫中復蘇一支表達重組FVIII的細胞株