專利名稱：原核表達并純化重組人粒細胞集落刺激因子(g-csf)的簡便化工業技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及原核表達并純化重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的簡便化方法。
背景技術：
粒菌體集落刺激因子(GranulocyteColony-Stimulating Factor，G-CSF)具有促進粒系造血干細胞增殖分化及增強成熟細胞功能的作用。它能夠在骨髓移植中促進中性白細胞的增殖，并對癌癥化療時引起的嚴重的中性粒細胞缺乏癥，以及再生障礙性貧血伴隨的中性白細胞缺乏癥有明顯的療效。重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)分子在17位包含一個自由半胱氨酸，并含有兩對二硫鍵，即C S36-Cys和Cys64-Cys，這兩對二硫鍵對于其活性是必須的。然而， hG-CSF的來源是非常有限的，因此在工業中，必須用基因工程的方法來生產它。通常在 E. coli中表達重組hG-CSF(rhG-CSF)。由于細菌細胞質中的還原環境會抑制二硫鍵的形成，故含有二硫鍵的蛋白更容易聚集成包涵體。因此必須在還原劑存在的條件下，用高濃度變性劑溶解包涵體，然后再將變性蛋白進行再折疊和氧化，以得到活性蛋白。然而，由于復性過程中聚集體的形成，復性率通常很低，而且必須采用多步后續的純化步驟對復性后的蛋白進行純化，生產效率較低。

發明內容
本發明的目的在于實現重人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)在原核細胞中的大量表達，并通過簡化的復性純化步驟，獲得純度較高的目的蛋白。在工業生產中滿足生產周期短，生產成本低，產量高的總體要求。本發明通過體外PCR擴增的方法，從人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的eDNA中擴增得到G-CSF基因，并通過NdeI和EcoRI限制性酶切位點與表達載體pET_28a連接。隨后將質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)獲得高效表達。本發明由于在構建G-CSF的表達載體時，表達載體pET_28a本身在5’端帶有6個組氨酸標簽的核苷酸序列，從而使表達的重組蛋白氨基酸序列的5’端也帶有一個6個組氨酸標簽。這使得后續純化實驗中可采用在鎳親和層析柱上復性的方法，一步就可以獲得比較純的有活性的蛋白(純度>90% )，大大簡化了純化步驟，提高了蛋白的得率。同時，本發明在設計PCR擴增時的上游引物時，人為的加入了一個煙草花葉病毒蛋白酶(TEV 蛋白酶)酶切位點ENLYFQG 相應的核苷酸序列 5’ -GAGAACCTGTACTTCCAGGGA-3’。這個酶切位點的存在可以使煙草花葉病毒蛋白酶作用于該蛋白，切除重組蛋白氨基酸序列5’端帶有的6個組氨酸標簽，以獲得天然結構的人粒細胞集落刺激因子蛋白，從而滿足不同用戶的需要。


圖1是G-CSF誘導表達每小時取樣SDS-PAGE電泳分析結果圖(M為marker ；1 5分別為誘導Oh, lh, 2h，3h和4h取樣)。圖2是G-CSF鎳親和層析柱上復性SDS-PAGE電泳分析結果圖(M為marker ；FT 為流穿液；El E5為在還原情況下各部分洗脫液；E6 E9為在非還原情況下各部分洗脫液)。圖3是G-CSF經離子交換層析純化后各部分洗脫液SDS-PAGE電泳分析結果圖(M 為marker ；FT為流穿液；1 9為在還原情況下各部分洗脫液；10 18為在非還原情況下各部分洗脫液)。圖 4 是 G-CSF 經 superdex 75 純化峰5是G-CSF經superdex 75純化后的SDS-PAGE電泳分析純度結果圖，SDS-PAGE 電泳分析驗證獲得的是高純度的蛋白，蛋白純度> 90%。(MSmarker ；A5 AlO為在還原情況下各部分洗脫液；All A16為在非還原情況下各部分洗脫液)。
具體實施例方式1、人粒細胞集落刺激因子的原核表達編碼人來源的G-CSF基因通過NdeI和EcoRI限制性酶切位點與表達載體pET_28a 連接。隨后將質粒轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)。挑取單克隆并接入含有3mL LB和終濃度為100 μ g/ml卡那霉素的培養基中，搖床 37°C，250rpm培養約16小時。將上述菌液按1 100的比例接入含有IOOOmL LB和終濃度為100 μ g/ml卡那霉素的培養基中，搖床37°C，250rpm培養至0D600約為0. 6，加入IPTG 至終濃度為ImM，誘導4小時之后收菌，離心，4000rpm，20min，棄上清，菌體-80°C保存。G-CSF誘導表達SDS-PAGE電泳分析結果見附圖1結論G-CSF理論分子量為21. 8KDa，圖中條帶符合目的條帶大小。且從取樣中看出，誘導四小時后G-CSF即獲得大量表達。2、人粒細胞集落刺激因子在鎳親和層析柱上的復性將上述獲得的包涵體按1 10(m/v)比例溶解于denature buffer(20mM Tris pH 7. 5，300mMNaCl，8M urea, IOmM imidazole)中，室溫下 240rpm 搖床培養 lh。取 5mL Ni-NTA(Qiagen)樹脂，用denature buffer平衡后，與復性后蛋白混合，搖床240rpm，4°C孵育 1 小時后上柱，收集流出液。然后用 150ml detergent buffer (20mM Tris pH8. 0, IOOmM NaCl, 1% triton-X100, IOmM β -Me)淋洗樹脂。洗滌完畢后，將樹脂與約 600mL oxidation buffer (20mM TrispH8. 0, IOOmM NaCl，5mM β-環糊精，ImM cysteine, 0. 5mM cystine)混合后，在4°C下搖床緩慢培養過夜。第二天將混合的樹脂上柱，待流出液流完后，在低溫下用IOOmL wash buffer (20mM TrispH 8. 0,500mM NaCl)淋洗柱子。最后用 elution buffer (50mM Tris pH 8. 0,300mMNaCl,500mM imidazole)洗脫復性后的蛋白。將洗脫的蛋白用稀釋至0. 3mg/ml 左右，dialysis buffer(50mM Tris pH 8.0， 20mM NaCl)在4°C下透析過夜，用于下一步純化。G-CSF柱上復性SDS-PAGE電泳分析結果見附圖2結論經過在鎳親和層析住上復性的步驟，在還原與非還原情況下的SDS-PAGE電泳結果對比可知，洗脫下來的目的蛋白分子量大小有差異，說明二硫鍵已形成。3、離子交換層析將上述透析蛋白離心，4°C，12000rpm，lOmin。取約3ml Q s印harose，經 dialysis buffer平衡后上清液緩慢上柱，收集flow through。經洗滌后，用0 IM NaCl洗脫。每管收集1ml，SDS-PAGE檢測。收集純度較高的蛋白合并為一管。G-CSF離子交換層析SDS-PAGE電泳分析結果見附圖3結論經過在Q sepharose上的離子交換層析純化步驟，G-CSF得到進一步純化。 但仍有部分雜蛋白存在，須經過進一步純化步驟得到更純的目的蛋白。4、凝膠過濾層析進一步純化目的蛋白將G-CSF 用 PEG20000 濃縮至約 0. 5mL,上 superdex 7510/300 進一步純化。上柱前先用PBS平衡柱子，上樣后用相同的緩沖液淋洗蛋白，組分收集器收集洗脫液ImL/管。洗脫后的蛋白經SDS-PAGE電泳驗證后，用PEG20000濃縮至濃度為lmg/mL，_80°C冰箱保存。G-CSF經superdex 75純化峰圖見附圖4，SDS-page分析純化純度結果見附圖5。結論經superdex 75進一步純化，SDS-page驗證獲得較高純度的蛋白，蛋白純度 > 90%。
權利要求
1.一種通過原核細胞表達并純化重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的簡便化方法，其特征在于該方法通過如下步驟通過原核細胞表達并純化重組人粒細胞集落刺激因子 (G-CSF) :1、人粒細胞集落刺激因子的原核表達，2、人粒細胞集落刺激因子在鎳親和層析柱上的，3、復性離子交換層析，4、凝膠過濾層析進一步純化目的蛋白
2.如權利要求1所述的通過原核細胞表達并純化重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 的簡便化方法，特征在于所述重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是從大腸桿菌高效表達的包涵體中進行制備純化的。
3.如權利要求1所述的通過原核細胞表達并純化重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 的簡便化方法，特征在于所述重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的表達溫度為37°C
4.如權利要求1所述的通過原核細胞表達并純化重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 的簡便化方法，特征在于所述重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的純化溫度為室溫或 4°C。
5.如權利要求1所述的通過原核細胞表達并純化重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 的簡便化方法，特征在于所述重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)液氮冷激后于-80°C保存。
全文摘要
本發明涉及原核表達并純化重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的簡便化方法。本發明的目的在于實現重人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)在原核細胞中的大量表達，并通過簡化的復性純化步驟，獲得純度較高的目的蛋白。在工業生產中滿足生產周期短，生產成本低，產量高的總體要求。
文檔編號C07K1/22GK102344931SQ20111027443
公開日2012年2月8日 申請日期2011年9月16日 優先權日2011年9月16日
發明者吳咪佳, 朱月珍, 楊宣武, 柴笑梅 申請人:江蘇普羅賽生物技術有限公司