專利名稱：一種重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法。
背景技術：
粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulatingfactor，G-CSF)具有促進粒系造血干細胞增殖分化及增強成熟粒細胞功能的作用，對于骨髓移植時促進中性白細胞增加、癌癥化療時引起的嚴重中性粒細胞缺乏癥、以及再生障礙性貧血伴隨的中性白細胞缺乏癥均有明顯療效。
基因工程重組G-CSF的生物學活性與天然的相似，可大規模生產，以滿足臨床需要。現有的生產方法中大腸桿菌表達外源蛋白，多數以不溶性包涵體的形式存在，包涵體是不具有生物學活性的，在生產過程中需要經過變性、復性處理，恢復其生物學活性。普遍存在的問題是復性率低，文獻報道的生產工藝多數是用包涵體直接復性的，復性率在20％左右。

發明內容
為了克服現有生產方法存在的重組人粒細胞集落刺激因子復性率低和生產成本高的缺陷，本發明提供了一種重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法。
本發明一種重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法，生產步驟包括發酵→破菌、提取包涵體→分子篩層析→復性→陰離子交換→陽離子交換→原液，是一種簡便、穩定、高效的生產方法。
選用BL21作為表達G-CSF的宿主菌G-CSF基因采用化學合成法，按照其基因序列，將編碼N端幾個氨基酸的密碼子改為大腸桿菌偏愛的密碼子，全基因合成后重組于表達載體PBV220中，轉化不同類型的大腸桿菌，對其表達量和傳代穩定性進行考察，篩選出高效表達且傳代穩定的菌種，作為工程菌的菌種。重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)生產所用的工程菌等選用大腸桿菌BL21作宿主菌，重組質粒PBV220-G-CSF在其中傳代穩定且可實現高效表達。最突出的特點是發酵過程中升溫誘導后菌體仍可繼續繁殖，使其菌體密度進一步提高。通過比較發現G-CSF在BL21中傳代穩定、表達量高且生長繁殖較快。表1為用DH5α和BL21表達G-CSF的比較。
表1.兩種宿主菌表達G-CSF的比較

在發酵過程中工程菌菌種接種于搖瓶的LB液體培養基中30℃振蕩培養，擴增獲得一級種子液，再按1％轉種擴大培養獲得二級種子液，然后按10％轉種于發酵罐中已滅菌的LB+M9培養基中，30℃培養，并通過通氣量和攪拌速度控制溶氧、用堿調pH值，適當補料，進一步增菌至OD600在2.5-3.0時，升溫至42℃熱誘導，誘導4h表達目的蛋白。通過發酵參數的控制，使細菌生長旺盛，并在對數生長期內升溫誘導，實現高密度高效表達。
G-CSF在大腸桿菌中以不溶性包涵體的形式表達，離心收集菌體后，用溶菌酶和超聲的方法破菌、提取包涵體，并進行洗滌，包涵體用8mol/L的脲變性處理，溶解后的包涵體rhG-CSF純度可達70％以上，通過包涵體的提取和洗滌，G-CSF得到了初步純化。
為了提高復性效果，在復性之前用分子篩層析進行了進一步純化，除去了部分大分子雜質。
rhG-CSF在原核細胞大腸桿菌中表達是以不溶性包涵體的形式存在的，需要變性、復性處理恢復其生物學活性。復性采用透析的復性方法，緩慢降低變性劑的濃度，并加入G-SH/GSSG，促進二硫鍵的形成，使變性蛋白恢復其空間構象，提高了復性率。
通過陰離子交換層析進一步純化，去除殘留的雜質和聚合體，并且復性液直接上陰離子交換柱純化，不需要濃縮。
純化工藝在分子篩層析和陰離子交換層析兩步純化的基礎上，進一步陽離子交換，使得原液的細菌內毒素殘留量水平明顯降低，比活有較大幅度的提高，可得到高純度、高比活的G-CSF原液。純化后的原液SDS-PAGE純度分析上呈現單一條帶，HPLC純度分析呈現單一峰，細菌內毒素按＜3EU/300μg(國家標準10EU/300μg)標準檢查仍合格，菌體蛋白殘留量＜0.01％(國家標準是0.1％)。陰離子交換柱后的比活為1.1×108U/mg，陽離子交換柱后的比活達1.5×108U/mg。從包涵體到原液的總回收率在20％以上。


圖1發酵過程中誘導不同時間時的表達量
1分子量Marker(分子量分別是94、67、43、30、21、14.4KD，以下的Marker相同)2、3、4、5分別是42℃誘導1h、2h、3h、4h時G-CSF的表達量圖2rhG-CSF的分子篩層析曲線圖3.rhG-CSF的分子篩層析的SDS-PAGE分析結果1分子量Marker 2純化前 3純化后 4層析曲線中的第一個峰 5第2個峰的上升支 6第二個峰的下降支圖4DEAE-Sepharose FF離子交換層析曲線及SDS-PAGE分析結果1.上樣峰；2.0.1mol/L NaCl洗脫峰；3.1mol/L NaCl洗脫峰；4.分子量marker圖5.CM-Sepharose FF離子交換層析曲線圖6.rhG-CSF純化過程中的SDS-PAGE分析1包涵體 2分子篩純化后 3陰離子柱純化后 4陽離子柱純化后 5分子量Marker圖7.rhG-CSF原液的SDS-PAGE純度檢測結果具體實施方式
實施例1發酵將工程菌菌種接種于LA平板中，30℃培養，長成菌落后，挑取單菌落接種于10mlLA液體培養液中，30℃振蕩培養獲得一級種子液，按1％轉種于LA液體培養基，振蕩培養獲得二級種子液。
配制發酵培養基，能耐高壓的部分加入發酵罐中高壓滅菌，將不耐高壓的成分過濾除菌，等發酵罐中的液體降溫后補加進去，并將新培養的種子液按10％的比例接種于發酵罐中進行發酵。控制培養溫度為30℃、用氨水調pH值使pH穩定在6.8和7.4之間、通過調節通氣量和轉速控制溶氧＞70％，并適當補料。增菌至OD600在2.5-3.0時，升高溫度至42℃進行熱誘導，誘導不同時間時的表達量見圖1。誘導4h結束發酵，離心收集菌體，-70℃凍存備用。每升可得濕菌體10g以上，表達量達50％。
實施例2破菌、洗滌包涵體將濕菌體用TE(50mmol/LTris-Cl、5mmol/LEDTA)按1∶10(g/ml)的比例懸浮菌體，加溶菌酶至終濃度1mg/ml，4℃放置4h，冰浴中超聲破碎，6min/次，歇間3min，共7次。4℃、8500rpm離心15min，棄上清，沉淀重懸于T E緩沖液中，重復上述過程兩次，沉淀用2mol/L脲洗滌二遍。
沉淀用8mmol/L脲，2mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，50mmol/LTris-HCl pH 8.0的液體溶解，4℃、8500rpm離心15min，上清即包涵體溶出液。
實施例3分子篩層析取上述包涵體溶出液，加DTT至終濃度5mmol/L，30℃水浴30min上柱，流動相為8mmol/L脲，2mmol/L EDTA，1mmol/LDTT，50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，流速約0.7ml/min，分部收集洗脫峰。層析曲線見圖2，目的蛋白位于第二個峰中，經分子篩純化，可去掉分子量大于30KD的雜蛋白，見圖3。
實施例4復性初步純化后的樣品用8mmol/L脲、1mmol/L EDTA，1mmol/LDTT，50mmol/L Tris-HCl pH 8.0稀釋至OD280＝0.25，裝于透析袋中，對4倍體積的4mmol/L脲、20mmol/L Tris-HCl pH8.0，4mmol/LG-SH/1mmol/LGSSG透析過液，換1mmol/L脲、20mmol/L Tris-HCL，pH8.0，透析24h，換同樣體積的20mmol/LTris-HCl，pH8.0透析8h以上。將樣品溶液經孔徑0.45um濾膜過濾，準備上DEAE層析柱。
實施例5DEAE-SepharoseFF柱純化平衡緩沖液20mmol/L Tris-HCl pH8.0，目的蛋白在0.1mol/L NaCl的鹽濃度下被洗脫，1mol/L NaCl濃脫變性蛋白和雜蛋白，層析曲線和SDS-PAGE見圖4。
實施例6CM-SephroseFF陽離子交換柱純化平衡緩沖液20mmol/L NaAc-HCL PH4.0先用含0.3M NaCL的20mM NaAc-HAc PH4.0洗柱，再用含0.45M NaCL的20mM NaAc-HAc pH4.0緩沖液洗脫目的蛋白見圖5。
實施例7G-CSF純度分析采用SDS-PAGE和HPLC兩種方法進行，結果見圖6、圖7，分別呈現單一條帶和單一峰。
權利要求
1.一種重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法，其特征在于操作步驟如下發酵→破菌、提取包涵體→分子篩層析→復性→陰離子交換→陽離子交換→原液。
2.如權利要求1所述重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法，其特征在于選用BL21作為表達G-CSF的宿主菌。
3.如權利要求1所述重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法，其特征在于發酵過程中，工程菌菌種接種于搖瓶的LB液體培養基中30℃振蕩培養，擴增獲得一級種子液，再按1％轉種擴大培養獲得二級種子液，然后按10％轉種于發酵罐中已滅菌的LB+M9培養基中，30℃培養，并通過通氣量和攪拌速度控制溶氧、用堿調pH值，適當補料，進一步增菌至OD600在2.5-3.0時，升溫至42℃熱誘導，誘導4h表達目的蛋白，通過發酵參數的控制，使細菌生長旺盛，并在對數生長期內升溫誘導。
4.如權利要求1所述重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法，其特征在于破菌、提取包涵體的步驟中采用溶菌酶和超聲的方法破菌、提取包涵體，并進行洗滌，包涵體用8mol/L的脲變性處理。
5.如權利要求1所述重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法，其特征在于復性步驟中采用透析的方法，緩慢降低變性劑的濃度，并加入G-SH/GSSG，促進二硫鍵的形成。
6.如權利要求1所述重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法，其特征在于陰離子交換采用DEAE-SepharoseFF柱純化。
7.如權利要求1所述重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法，其特征在于陽離子交換采用CM-SephroseFF陽離子交換柱純化。
全文摘要
本發明一種重組人粒細胞集落刺激因子的生產方法，涉及生物技術領域。生產工藝發酵→破菌、提取包涵體→分子篩層析→復性→陰離子交換→陽離子交換→原液。選用BL21作宿主菌，獲得繁殖速度快，傳代穩定，表達量高的工程菌菌種；幾個純化步驟使得原液的細菌內毒素殘留量水平明顯降低，比活有較大幅度的提高。包涵體先進行初步純化后再進行復性，復性采用透析法，緩慢降低變性劑的濃度，使復性率保持在較高水平。本發明的方法能夠達到穩定、高效、批量生產的要求。
文檔編號C07K1/00GK1814779SQ200510045388
公開日2006年8月9日 申請日期2005年12月20日 優先權日2005年12月20日
發明者陳文芳, 宋磊, 劉紅軍 申請人:山東泉港藥業有限公司