專利名稱：生物活性提高的人粒細胞集落刺激因子的Fc融合蛋白的制作方法
背景技術：
粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是20千道爾頓的糖蛋白，其促進祖細胞的增生并誘導它們分化成嗜中性白細胞。另外，G-CSF延長成熟嗜中性白細胞的存活并激活它們的功能。人G-CSF(hG-CSF)是由單核細胞、巨噬細胞、成纖維母細胞和內皮細胞產生的(參見，如Moore，Annu.Rev.Immunol.，9159-191，1991；Nicola，Annu.Rev.Biochem.，5845-77，1991)。G-CSF的生物作用受其與骨髓造血祖細胞和骨髓系的細胞表面上表達的G-CSF受體(G-CSF-Rc)的相互作用的介導。與G-CSF結合后，受體被激活并經歷同源二聚，隨后磷酸化酪氨酸激酶的Janus家族。隨后，發生一系列細胞內的信號轉導，從而增加祖細胞的數量，祖細胞成熟為嗜中性白細胞，從而在成熟的嗜中性白細胞中進一步激活因子的功能(參見，如Demetri等人.，Blood，782791-2808，1991)。因此，G-CSF不僅在血細胞生成中起調節和維持的關鍵作用，而且在宿主對感染和炎癥的抵抗中也起重要作用。
在因接受化療而中性白細胞減少的患者的治療中廣泛使用重組人G-CSF(rhG-CSF)。施用rhG-CSF能有效地恢復這些患者中性白細胞的功能，使與感染相關的事件減少。使用rhG-CSF能強化劑量或調節對癌癥患者有益的化療劑。除化療引發的中性白細胞減少以外，rhG-CSF還可用于治療骨髓移植后的骨髓抑制、急性白血病、再生障礙性貧血、骨髓發育不良綜合癥、嚴重慢性中性粒細胞減少癥、和移植時外周血祖細胞的轉移(參見，如Welte等人.，Blood，881907-1929，1996)。
靜脈內或皮下給藥后，rhG-CSF血清濃度的消除半衰期約為3-4小時。rhG-CSF的安全性及患者對rhG-CSF的耐受性良好，僅有髓骨痛為常見和明顯的副作用。rhG-CSF相對較低的毒性，使得可以開發長效作用的衍生物以減少每天一次或每天兩次注射安排的不便。已有報道說將聚乙二醇(PEG)連接于各種蛋白質(包括G-CSF)，能得到因半衰期長而體內效力較高的衍生物(參見，如Zalipsky等人，“PEG化學生物技術和生物醫藥的應用”，第347-370頁，1992)。通常PEG綴合的蛋白質比它們未經修飾的親代蛋白質的體外生物活性低(Eliason等人，Stem Cells，1840-45，2000)。而這些經修飾的蛋白質體內效力的增加至少部分是因為按其分子量的增加而降低了腎的清除作用(Yamaoda等人，J.Pharmaceut.Sci.，83601-606，1994)。我們出乎意料地發現，如本發明所述地將人IgG衍生的Fc區域連接于hG-CSF的C末端，可以提供延長hG-CSF的半衰期而增加它的效力同時提高它的生物活性。
IgG類的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質。它們的半衰期可高達21天。已有報道說融合蛋白可將IgG的Fc區域與其它蛋白質(如各種細胞因子和可溶性受體)的區域結合(參見，如Capon等人，Nature，337525-531，1989；Chamow等人，Trends Biotechnol.，1452-60，1996；美國專利No.5,116,964和5,541,087)。原型融合蛋白是通過IgG Fc絞鏈區中的半胱氨酸殘基連接的同源二聚體蛋白質，形成類似于IgG分子但無CH1區域和輕鏈。由于結構上的同源，Fc融合蛋白表現出與類似同種型的人IgG相當的體外藥物動力學特性。這種方法已被用于一些臨床上很重要的細胞因子(如IL-2和IFN-α2a)和可溶性受體(如TNF-Rc和IL-5-Rc)(參見，如美國專利No.5,349,053和6,224,867)。通過如本發明所公開的和/或所述，將含有G-CSF的融合蛋白連接于人IgG蛋白質的Fc區域，可延長G-CSF的循環半衰期和/或增加它的生物活性。
已有人報道了促紅細胞生成素(EPO)衍生物(如二聚物)。與EPO單體相比，含有2個的完整EPO區域(相隔3到7氨基酸肽接頭)的融合蛋白表現出減弱的活性(Qiu等人，J.Biol.Chem.，27311173-11176，1998)。然而，當這兩個EPO區域間的肽接頭的長度為17個氨基酸時，二聚體EPO分子表現出提高相當多的體外和體內的活性(參見，如Sytkowski等人，J.Biol.Chem.，27424773-24778，1999；美國專利No.6,187,564)。兩個造血生長因子間的肽接頭的長度非常重要，可能是因為其對這些分子形式的柔韌性的作用，但也不限于這個解釋。我們發現本方法可應用于其它治療性蛋白質(包括G-CSF)。我們還用其于如柔性肽接頭。
在大部分已報道的Fc融合蛋白分子中，絞鏈區作為Fc區域與細胞因子或可溶性受體間的間隔，使這分子的這兩部分能分別行使功能(參見，如Ashkenazi等人，Current Opinion in Immunology，9195-200，1997)。在hG-CSF和Fc部分間帶有合適肽接頭的人G-CSF融合蛋白(hG-CSF-L-Fc)比rhG-CSF的活性高，其體外活性至少是rhG-CSF的2倍(以摩爾計)。本發明發現，在人G-CSF和人IgG Fc變體間添加的肽接頭以兩種方式提高hG-CSF-L-Fc的體外生物活性(1)保持Fc區域與G-CSF上G-CSF-Rc結合位點的距離，和(2)保持一個G-CSF和另一個G-CSF區域的距離，從而使G-CSF區域能分別與粒細胞祖細胞上的G-CSF-Rc反應。對本發明而言，優選長度為約20個或更少氨基酸的柔性肽接頭。更優選的是長度至少為2個氨基酸的肽接頭。另外，甚至優選使用包含兩個或多個選自以下氨基酸的肽接頭甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。
人免疫球蛋白的Fc區域在消滅病原體的免疫防御中起重要作用。IgG的效應子功能由Fc介導通過兩種主要機制(1)與細胞表面Fc受體(FcγRs)的結合，由吞噬作用或裂解作用或殺傷細胞通過抗體-依賴性細胞毒性(ADCC)途徑消化病原體，或(2)與第一補體成分C1的C1q部分的結合，引發依賴于補體的細胞毒性(CDC)途徑，從而裂解病原體。在四種人IgG同種型中，IgG1和IgG3能有效地結合FcγR。IgG4與FcγR的結合親和力比IgG1或IgG3的低一個數量級，而IgG2與FcγR的結合低得難以測定。人IgG1和IgG3還能有效地結合C1q，并激活補體級聯反應。人IgG2對補體的固定很弱，而IgG4表現極端缺乏激活補體級聯的能力(參見，如Jefferis等人，Immunol.Rev.，16359-76，1998)。對應用于人的治療而言，當hG-CSF-L-Fc結合于祖細胞或骨髓系的其它細胞表面上的G-CSF-Rc時，融合蛋白的Fc區域必須不會介導不良效應子功能而裂解或除去這些細胞。因此，hG-CSF-L-Fc的Fc區域必須是非裂解性的，即在結合FcγRs和C1q而觸發效應子功能方面，Fc必須是無活性的。顯然，沒有一種天然的IgG同種型適合產生hG-CSF-L-Fc融合蛋白。為了得到非裂解性的Fc，必須使天然Fc區域中的一些氨基酸突變，以減少其效應子功能。
通過比較人和鼠的IgG同種型的氨基酸序列，CH2區域氨基末端附近的Fc部分顯示在IgG Fc與FcγRs的結合中起作用。已用基因工程抗體證明在234位到237位基序的重要性(參見，如Duncan等人，Nature，332563-564，1988)。按Kabat等人(Seguences of Proteins of ImmunologicalInterest，，第5版，United States Department of Health and Human Services，1991)所述的EU編號體系將氨基酸殘基編號。在四種人IgG同種型中，IgG1和IgG3與FcγRs的結合最好，且具有相同的序列Leu234-Leu-Gly-Gly237(

圖1僅顯示了IgG)。在以低親和力與FcγRs結合的IgG4中，其序列含有單個氨基酸取代，Phe取代234位的Leu。在不結合FcγRs的IgG2中，兩個取代和一個缺失形成Val234-Ala-Gly237(圖1)。為了減少Fc與FcγR的結合和ADCC活性，用Ala替代IgG4中的Leu235(參見，如Hutchins等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9211980-11984，1995)。在此基序中已用IgG2序列中的Pro233-Val-Ala235替代Glu233-Leu-Leu235來改變IgG1。這種替代使IgG1變體缺失了在小鼠中由FcγR-介導清除靶細胞的能力(參見，如Isaacs等人，J.Immunol.，1613862-3869，1998)。
對FcγR與C1q結合非常重要的第二部分位于人IgG的CH2區域羧基端附近(參見，如Duncan等人，Nature，332738-740，1988)。在四種人IgG同種型中，這部分中僅有一個位點顯示取代用IgG1、IgG2和IgG3中的Ala330和Pro331替代IgG4中的Ser330和Ser331(圖1)。Ser330的存在不影響FcγR與C1q的結合。用Ser替代Pro331使IgG1失去了與C1q的結合親和力，而用Pro替代Ser331部分保留了IgG4的補體固定活性(參見，如Tao等人，J.Exp.Med.，178661-667，1993；Xu等人，J.Biol.Chem.，2693469-3474，1994)。
我們發現可以設計至少三種Fc變體(vFc)和/或用于產生hG-CSF-L-vFc融合蛋白(圖1)。人IgG2不結合FcγR，但顯示出極弱的補體活性。具有Pro331Ser突變的Fcγ2變體應比天然Fcγ2的補體活性更低，而且依舊是FcγR非結合子。IgG4 Fc在激活補體級聯中有缺陷，且它與FcγR的結合親和力比最高活性的同種型(IgG1)的低約一個數量級。與天然Fcγ4相比，具有Leu235Ala突變的Fcγ4變體應表現出最小的效應子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的Fcγ1也表現出比天然Fcγ1低的效應子功能。這些Fc變體都比天然人IgG Fc更適于制備G-CSF融合蛋白。在非裂解Fc的制備中也可引入其它替換，而不影響循環半衰期或導致不良的構型變化。
本發明有許多優點。血清中hG-CSF-L-cFc融合蛋白增高的活性和存在時間的延長，能減低劑量以及減少注射的頻率。藥物血清濃度的波動的減少意味著安全性和耐受性的改善。注射頻率的減低能使患者有更好的順應性和生活質量。因此具有非裂解Fc變體的hG-CSF-L-vFc融合蛋白能顯著也有益于各種與免疫系統或造血系統相關的病癥的治療，包括癌癥的化療、白血病、貧血、AIDS、骨髓移植和慢性中性白細胞減少癥。
發明概述本發明的一方面涉及一種hG-CSF-L-vFc融合蛋白。這種hG-CSF-L-vFc融合蛋白含有人G-CSF、肽接頭(以L表示)和人IgG Fc變體(以vFc表示)。較佳地，使用約20或更小(較佳地為約2)氨基酸長度的柔性肽和含有或由以下2個或多個氨基酸構成的柔性肽接頭甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。IgG Fc變體是無裂解性的，且與天然IgG Fc相比含有氨基酸突變。
本發明的另一實施例為人Ig Fc，它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的絞鏈區、CH2和HC3區域。這種CH2區域在228、234、235和331位(由EU計數系統確定)含有氨基酸突變。據信這些氨基酸突變能降低Fc的效應子功能。
在本發明的另一實施例中，公開了一種從哺乳動物細胞系如CHO-衍生的細胞系制備或生產這種重組融合蛋白的方法。用讓重組融合蛋白在其生長培養基中超過10(較佳地為30)μg/106細胞的條件下培養轉染的細胞系24小時。這些hG-CSF-L-vFc融合蛋白的特征為且表現出增加的/提高的生物活性，較佳地其體外活性至少是rhG-CSF的2倍(2X)(摩爾基礎)，而且延長其血清半衰期而無不良副作用，改善了藥物動力學和藥效，從而降低了實現類似藥效所需的劑量和注射次數。
本發明的另一方面提供了一種制備含有人G-CSF、柔性肽接頭和人IgG Fc變體的重組融合蛋白的方法，這種方法包括(a)生成CHO-衍生的細胞系；(b)用讓重組融合蛋白在其生長培養基中每24小時期間內，每106個細胞表達超過10μg(較佳地為30μg)的條件下培養這種細胞系；和(c)純化步驟(b)表達的蛋白質，其中重組融合蛋白的特征為且表現出增加的/提高的生物活性，較佳地其體外活性至少是rhG-CSF的2倍(2X)(摩爾基礎)。當較佳地在人G-CSF和人IgG Fc變體間存在柔性肽接頭，而此柔性肽接頭含有或由約20個或更少(但不能少于2個)氨基酸；且柔性肽接頭由2個或更多選自以下的氨基酸構成甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸；且其中人IgG Fc變體含有絞鏈區、CH2和CH3區域，它們選自具有Pro331Ser突變的人IgG2、具有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4、和具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgG1。
附圖簡述圖1顯示了人IgG1、IgG2、IgG4和它們變體的絞鏈區和CH2區域的氨基酸序列。比較這三個部分氨基酸區域228、234-237和330-331。用粗斜體顯示這些變體的氨基酸突變。將EU計數系統用于氨基酸殘基。
圖2顯示了分別用于phGFP表達載體作為HindIII-EcoRI片段的(A)hG-CSF-L-vFcγ2、(B)hG-CSF-L-vFcγ4和(C)hG-CSF-L-vFcγ1的核苷酸序列及它們演繹的氨基酸序列。氨基酸殘基-30到-1是人G-CSF的前導肽。成熟的蛋白質含有人G-CSF(氨基酸殘基1-174)、肽接頭(氨基酸殘基175到190)和Fc變體(vFcγ2的氨基酸殘基191到418，vFcγ4的氨基酸殘基191到419，和vFcγ1的氨基酸殘基191到417)。在Fc區域中，粗體的核苷酸和相應的氨基酸突變還用下劃線標出。
發明詳述1.構建編碼hG-CSF-L-vFcγ2融合蛋白的基因融合蛋白是用數個DNA片段構建而成的。用從人膀胱癌5637細胞系制備的RNA，通過逆轉錄和聚合酶鏈式反應(PCR)得到編碼人G-CSF的前導肽和成熟蛋白質的基因。為了便于克隆，將引入限制性酶內切位點(HindIII)的SEQ ID NO1用作5’寡核苷酸的引物。表1列出了用于克隆hG-CSF-L-vFc融合蛋白的寡核苷酸序列。3’引物(SEQ ID NO2)除去了G-CSF末端密碼子并引入了BamHI位點。將如此獲得的長度約為600bp的DNA片段插入到接受載體(如pUC19)的HindIII和BamHI位點，得到phGCS質粒。由DNA測序驗證人G-CSF基因的序列。
用從人白細胞制備的RNA和合適的5’(SEQ ID NO3)和3’(SEQ IDNO4)引物，通過逆轉錄和PCR得到編碼人IgG2的Fc區域(Fcγ2)的基因。將得到的含有IgG2的絞鏈、CH2和CH3區域完整序列的Fcγ2的DNA片段作為模板，產生Fcγ2Pro331Ser變體，其中Fcγ2中331位的Pro被Ser替代。為了引入此突變，產生兩個片段，然后用天然Fcγ2作為模板在重疊PCR中將它們裝配起來。用SEQ ID NO3作為5’引物并用SEQ ID NO5作為3’引物生成5’片段。用SEQ ID NO6作為5’引物并用SEQ ID NO4作為3’引物生成3’片段。然后用SEQ ID NO7作為5’引物和SEQ ID NO4作為3’引物，將這兩個片段在覆蓋Pro331Ser突變的區域連接起來。SEQID NO7引物含有編碼16氨基酸Gly-Ser肽接頭(包括BamHI限制性內切酶位點)的序列。將得到的長度約為700bp的DNA片段插入接受載體(如pUC19)的BamHI和EcoRI位點，得到pL-vFcγ2質粒。用DNA測序驗證該基因的序列。
為了制備hG-CSF-L-vFcγ2融合基因，用HindIII和BamHI從phGCSF質粒上切下hG-CSF片段，然后用瓊脂糖凝膠電泳純化。然后將純化的片段插入pL-vFcγ2質粒肽接頭的5’末端，得到phG-CSF-L-vFcγ2質粒。該融合基因含有hG-CSF、Gly-Ser肽接頭和Fcγ2變體基因。
在hG-CSF和Fc部分間存在的(且彼此化學結合)的肽接頭(較佳地為柔性接頭)增加了hG-CSF區域的柔性且提高了它的生物活性。對本發明而言，優選的是長度為約20個或更少氨基酸的肽接頭。當一種氨基酸在本發明的范圍之內時，優選長度約為20到2個氨基酸的柔性肽接頭。宜使用含有或由2個或更多選自以下氨基酸構成的肽接頭甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。一種肽接頭的例子含有Gly-Ser肽構件，如GlyGlyGlyGlySer。圖2A顯示了含有編碼hG-CSF序列的融合基因、16-氨基酸肽接頭(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGly GlySerGLyGlyGlyGlySer)和Fcγ2Pro331Ser變體。
然后將編碼hG-CSF-L-vFc融合蛋白的完整基因插入哺乳動物表達載體如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位點。最終的表達載體質粒(稱為phGFP2)含有在哺乳動物相比中高水平表達所需的巨細胞病毒早期基因啟動子-增強子。該質粒還含有選擇性標記物，從而在細菌中可以具有氨芐青霉素抗性，而在哺乳動物細胞中可以具有G418抗性。另外，當宿主細胞是DHFR基因表達缺陷時，phGFP2表達載體含有二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，從而存在氨甲蝶呤(MTX)時能共擴增hG-CSF-L-vFcγ2融合基因和DHFR基因(參見，如美國專利No.4,399,216)。
2.構建編碼hG-CSF-L-vFcγ2融合蛋白由于絞鏈區域中重鏈間二硫鍵的分解，人IgG4部分會形成半抗體分子。而這在其它三種人IgG同種型中卻沒有觀察到。用Pro(在IgG1和IgG2中的該位置發現的殘基)替代Ser228的單氨基酸取代，從而形成IgG4完整的抗體分子(參見，例如Angal等人，Molec.Immunol.，30105-108，1993；Owens等人，Immunotechnology，3107-116，1997；美國專利No.6,204,007)。含有Leu235Ala突變以降低FcR結合的Fcγ4變體與這種附加的Ser228Pro突變也會產生同型融合蛋白制備物。
用從人白細胞制備的RNA和合適的5’引物(SEQ ID NO8)和3’引物(SEQ ID NO9)，通過逆轉錄和PCR得到編碼人IgG4的Fc區域(Fcγ4)的基因。將得到的含有IgG4的絞鏈、CH2和CH3區域完整序列的Fcγ4的DNA片段作為模板，產生Ser228Pro和Leu235Ala突變的Fcγ4變體(vFcγ4)，其中Ser228和Leu235分別被Pro和Ala替代。用3’引物(SEQ ID NO9)和含有Leu235Ala突變的5’引物(SEQ ID NO10)擴增CH2和CH3區域。用SEQ ID NO12作為5’引物和SEQ ID NO9作為3’引物，在PCR中將這種擴增的片段與合成的長度為60個堿基(且含有Ser228Pro和Leu235Ala突變)的寡核苷酸(SEQ ID NO11)連接起來。SEQ ID NO12引物含有編碼16氨基酸Gly-Ser肽接頭(包括BamHI位點)的序列。將得到的長度約為700bp的DNA片段插入接受載體(如pUC19)的BamHI和EcoRI位點，得到pL-vFcγ4質粒。用DNA測序驗證該基因的序列。
為了制備hG-CSF-L-vFcγ4融合基因，用HindIII和BamHI從phGCSF質粒上切下hG-CSF片段，然后插入pL-vFcγ4質粒肽接頭的5’末端，得到phG-CSF-L-vFcγ4質粒。此融合基因含有hG-CSF，一種16氨基酸Gly-Ser肽接頭，和Fcγ4變體基因，然后將其插入哺乳動物表達載體如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位點(如hG-CSF-L-vFcγ2融合蛋白所述)。將這種最終表達的載體質粒命名為phGFP4。圖2B顯示了融合基因，含有編碼hG-CSF、16個氨基酸肽接頭(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)、和具有Ser228Pro和Leu235Ala突變的Fcγ4變體的序列。
3.構建編碼hG-CSF-vFcγ1融合蛋白的基因人IgG1重鏈的絞鏈區域含有包括3個半胱氨酸的15氨基酸殘基(GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysPro)。在這3個半胱氨酸殘基中，第2和第3個參與兩個重鏈間二硫鍵的形成。第1個半胱氨酸殘基參與該二硫鍵與IgG輕鏈的結合。由于Fc融合蛋白分子中不存在輕鏈，該半胱氨酸殘基可能與其它半胱氨酸殘基配對，而導致非特異性二硫鍵合。可以將Fcγ1的絞鏈區域切短，以消除第1個半胱氨酸殘基(AspLysThrHisThrCysProProCys Pro)。用從人白細胞制備的RNA和合適的5’引物(SEQ ID NO13)和3’引物(SEQ ID NO4)，通過逆轉錄和PCR得到編碼Fcγ1區域的基因。將得到的含有Fcγ1截短絞鏈區域和CH2及CH3完整序列的DNA配對用作模板，產生有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變(vFcγ1)的Fcγ1變體(vFcγ1)。
一種引入這些突變的方法如下產生兩個片段，然后用天然Fcγ1作為模板在重疊PCR中將它們裝配起來。用SEQ ID NO14作為5’引物并用SEQ ID NO5作為3’引物生成5’片段。此5’引物含有Leu234Val、Leu235Ala突變，3’引物含有Pro331Ser突變。用SEQ ID NO6作為5’引物并用SEQ ID NO4作為3’引物生成3’片段。然后用SEQ ID NO14作為5’引物和SEQ ID NO4作為3’引物，將5’和3’片段在覆蓋Pro331Ser突變的區域連接起來。用SEQ ID NO16作為5’引物、SEQ ID NO4作為3’引物，用PCR將如此擴增的長度約650bp的片段和合成的55堿基的寡核苷酸(SEQ ID NO15)(含有Leu234Val和Leu235Ala)連接起來。SEQ ID NO16引物含有編碼16氨基酸Gly-Ser肽接頭(包括BamHI位點)的序列。將得到的長度約為700bp的DNA片段插入接受載體(如pUC19)的BamHI和EcoRI位點，得到pL-vFcγ1質粒。用DNA測序驗證該基因的序列。
為了制備hG-CSF-L-vFcγ1融合基因，用HindIII和BamHI從phGCSF質粒上切下hG-CSF片段，然后插入pL-vFcγ1質粒肽接頭的5’末端，得到phG-CSF-L-vFcγ1質粒。此融合基因含有hG-CSF(一種16-氨基酸Gly-Ser肽接頭)，然后將Fcγ1變體基因插入哺乳動物表達載體如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位點(如hG-CSF-L-vFcγ2融合蛋白所述)。將這種最終表達的載體質粒命名為phGFP1。圖2C顯示了融合基因，含有編碼hG-CSF、16個氨基酸的肽接頭(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)、和有Ser234Val、Leu23 5Ala和Pro331Ser突變的Fcγ1變體的序列。
4.在轉染的細胞系中融合蛋白的表達已生成了兩種不同的rhG-CSF從中國倉鼠卵巢細胞(CHO)產生的糖基化的形式和細菌細胞產生的未糖基化的形式。糖基化的rhG-CFS含有吸附于133位蘇氨酸殘基的O-連接的寡糖，約占它分子量的4％。通過抑制聚合和構象的改變，這種碳水化合物鏈起到穩定蛋白質分子的作用(Oh-eda等人，J.Biol.Chem.，26511432-11435，1990)。在用rhG-CSF進行的體外研究中，由CHO細胞產生的糖基化的形式的生物活性比細菌細胞產生的未糖基化的形式高(Nissen，Eur.J.Cancer，30A Suppl 3S12-S14，1994)。另外，從CHO細胞衍生的rhG-CSF在結構特性和生物活性上與其天然對應物沒有區別(Kubota等人，Biochem.(Tokyo)，107486-492，1990)。在健康志愿者的隨機交叉研究中，糖基化rhG-CSF的周圍血祖細胞的活動性比未糖基化的rhG-CSF強25到30％(參見，如Hoglund，Med.Oncol.，15229-233，1998；Hoglund等人，Eur.J.Haematol.，59177-183，1997)。為了得到最適合臨床使用的蛋白質，如下在CHO-細胞中產生hG-CSF-L-vFc融合蛋白。
將重組phGFP1、phGFP2或phGFP4表達載體質粒轉染入哺乳動物宿主細胞系，以表達hG-CSF-vFc融合蛋白。為了穩定高水平的表達，優選的宿主細胞系是DHFR酶缺陷型CHO-細胞(參見，例如美國專利No.4,818,679)。一種優選的轉染方法是電穿孔。也可以使用其它方法，包括磷酸鈣共沉降、脂轉染和原生質融合。在電穿孔中，用設置為250V電場和960μFd電容的Gene Pulser Electroporator(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，在比色杯內的2-5×107個細胞中加入10μg用BspCI線性化的質粒DNA。在轉染2天后，將培養基改成含0.18mg/mlG418的生長培養基。用抗人IgG Fc ELISA，測試對選擇用藥具有抗性的轉染子的融合蛋白分泌。也可用抗-hG-CSF分析的ELISA進行表達的融合蛋白的定量。通過極限稀釋96-孔組織培育板，亞克隆產生高水平Fc融合蛋白的孔。
為了實現融合蛋白較高水平的表達，宜用受MTX藥物抑制的DHFR基因進行共擴增。在含有遞增濃度MTX的生長培養基中，用DHFR基因共擴增轉染的融合蛋白基因。用極限稀釋亞克隆能在高達1μg/ml MTX培養基中生長的轉染子。測定分泌率對亞克隆的細胞系進行進一步的分析。分泌率水平超過約10(較佳地約30)μg/106(即百萬)個細胞/24小時的細胞系適應使用無血清生長培養基的懸浮培養。然后用條件培養基純化融合蛋白。
5.融合蛋白的純化和定性用1N NaOH將含有融合蛋白的條件培養基滴定到pH7到8，然后用0.45微米的硝酸纖維素過濾器過濾。將濾液加樣到磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)平衡的Prosep A柱上。待融合蛋白結合于Prosep A后，棄去流出的組分。用PBS洗滌該柱，直到280nm處的OD值低于0.01。然后用0.1MpH為3.75的檸檬酸緩沖液洗脫結合的融合蛋白。用0.4體積的1M K2HPO4中和，合并含有純化對比的組分，并用PBS透析。然后用0.22微米的硝酸纖維素過濾器過濾，并存儲在4℃。在非還原條件下，由SDS-PAGE測得純化的hG-CSF-L-vFc蛋白質的分子量范圍為90到110kDa。在還原條件下，純化的蛋白遷移至約50kDa。用BSA作為標準，通過BCA蛋白質分析定量該融合蛋白。
6.體外生物分析測得轉染子或純化蛋白質的懸浮液刺激鼠成髓細胞NFS-60細胞的增生(Shirafuji等人，Exp.Hematol.，17116-119，1989)。NFS-60細胞應答rhG-CSF，而不應答rhGM-CSF或hM-CSF。將細胞維持在生長培養基(RPMI-1640培養基，含有10％FCS和1ng/ml鼠IL-3)。收集對數期的NFS-60細胞，并用分析培養基洗滌(不含鼠IL-3的生長培養基)。將每份共1×104個細胞的NFS-60樣品(50μl)加到96孔組織培育板的各孔中。用50μl含有各種濃度hG-CSF-L-vFc融合蛋白或rhG-CSF對照(各從0.01到100nM)的分析培養基培養這些細胞。在各孔中添加10μlMTT(用PBS配制成2.5mg/ml)之前，在37℃、5％CO2濕潤培養箱中培養該平板4天。4小時后，加入每孔100μl 10％SDS的0.01N HCl溶解細胞和甲(Formazan)。然后在550nm讀取該平板(參考光束設為690nm)。OD讀數相對于rhG-CSF或融合蛋白的濃度作圖。S形曲線的拐點表示產生50％最大效果(ED50)的濃度。因此可定量地比較hG-CSF-L-vFc相對于rhG-CSF的生物活性。較佳地，在摩爾基礎上，重組融合蛋白的特性為且應表現出比rhG-CSF高至少2倍(2X)的活性。在本發明的一實施例中，hG-CSF-L-vFc融合蛋白的特異性活性范圍約為1.5到6×109單位/μmol，而rhG-CSF約為0.75到3.0×109單位/μmol(以這種細胞的增生分析為基礎)。
也可測試轉染子或純化蛋白懸浮液刺激人骨髓祖細胞增生和分化形成集落(粒細胞-巨噬細胞集落形成單位(CFU-GM))的能力。方法如下。洗滌用Ficoll-Pague離心的人骨髓的低密度細胞，并以1×106細胞/ml懸浮在含有5％FCS的Iscove改進的Dulbecco培養基(IMDM)中。37℃、5％CO2，將這些富含祖細胞的細胞在組織培育板上培養過夜，除去粘附的細胞(包括單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞和成纖維細胞)。然后用含有5％FCS的IMDM將懸浮液中的細胞調節成1×105細胞/ml。混合0.3ml細胞、15μl 20μg/ml干細胞因子、2.4ml甲基纖維素和0.3ml含若干濃度hG-CSF-L-vFc(或rhG-CSF對照)的培養基用于分析。將1ml這種細胞混合物置于35-mm培養皿上。然后將此培養皿置于37℃、5％CO2中10-14天，然后計數集落量。以rhG-CSF的濃度對hG-CSF-L-vFc濃度作劑量反應曲線圖。
7.大鼠中體內藥物動力學研究通過尾靜脈進行靜脈注射或通過皮下注射，將100單位的rhG-CSF或hG-CSF-L-vFc融合蛋白注射入平均體重約為500g的Fisher大鼠(HarlanBioproducts for Science，Indianapolis，IN)。注射相同體積的PBS作為對照。注射后，在不同時間點(0、0.2、1、4、24、48、96和168小時)從眼球后采集一系列0.5ml的樣品。每個時間點3只大鼠。將全血收集在含有抗凝劑的試管中，除去細胞，并在-70℃冷凍血漿直到進行分析。
將血漿樣品用于NFS-60細胞分析，測定hG-CSF-介導的細胞增生的活性。在96孔培育板的各孔中加入每50μl重量為1×104細胞的樣品。用50μl含有各種濃度滴定過的血液樣品的分析培養基培養這些細胞。將平板在37℃、5％CO2濕潤培養箱中放置4天。用10μlMTT(用PBS配的2.5mg/ml溶液)染色活細胞。4小時后，每孔加入100μl10％SDS的0.01NHCl溶液溶解細胞和甲(Formazan)。然后在550nm讀取該平板(參考光束是690nm)。將血清樣品的活性對時間點作圖，用于循環時間的計算。hG-CSF-L-vFc的活性比hG-CSF對照的降低慢許多，表明大鼠中融合蛋白的半衰期較長。
以上實施例僅起說明的作用。不能也不應將它們視為對本發明范圍或精神的限制。本領域技術人員可以理解可使用許多相當于本發明目的的各種變化或替代，而本發明的目的僅由本說明書和所附權利要求書定義。
表1.寡核苷酸的序列SEQ ID NO15’-cccaagcttcccagacccatggctggacct-3’SEQ ID NO25’-cggatccgggctgggcaaggtggcgta-3’SEQ ID NO35’-gagcgcaaatgttgtgtcga-3’SEQ ID NO45’-ggaattctcatttacccggagacaggga-3’SEQ ID NO55’-tggttttctcgatggaggctgggaggcct-3’SEQ ID NO65’ -aggcctcccagcctccatcgagaaaacca-3 ’SEQ ID NO75’-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagagcgcaaatgttgtgtcga-3’SEQ ID NO85’-gagtccaaatatggtccccca-3’SEQ ID NO95’-ggaattctcatttacccagagacaggga-3’SEQ ID NO105’-cctgagttcgcggggggacca-3’SEQ ID NO115’-gagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcgcggggggacca-3’SEQ ID NO125’-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagagtccaaatatggtccccca-3’SEQ ID NO135’-gacaaaactcacacatgccca-3’SEQ ID NO145’-acctgaagtcgcggggggaccgt-3’SEQ ID NO155’-gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagtcgcggggggaccgt -3’SEQ ID NO165’-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagacaaaactcacacatgccca-3’
權利要求
1.一種重組hG-CSF-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白含有人G-CSF、肽接頭和人IgG Fc變體。
2.如權利要求1所述的重組hG-CSF-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的肽接頭含有約20個或更少的氨基酸，該肽接頭存在于人G-CSF和人IgG Fc變體之間；且所述的肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸。
3.如權利要求1或2所述的重組hG-CSF-L-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgG Fc變體為含有Pro331Ser突變的人IgG2的絞鏈、CH2和CH3區域。
4.如權利要求1或2所述的重組hG-CSF-L-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgG Fc變體為含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4的絞鏈、CH2和CH3區域。
5.如權利要求1或2所述的重組hG-CSF-L-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgG Fc變體為含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgG1的絞鏈、CH2和CH3區域。
6.如權利要求1或2所述的重組hG-CSF-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的hG-CSF-L-vFc融合蛋白的特性為且表現出在摩爾基礎比rhG-CSF高至少2倍的體外生物活性。
7.一種CHO-衍生的細胞系，其特征在于，所述的細胞系在其生長培養基中每24小時期間內產生超過10μg/百萬個細胞的如權利要求1-6任一所述的hG-CSF-L-vFc融合蛋白。
8.如權利要求7所述的CHO-衍生的細胞系，其特征在于，所述細胞系在其生長培養基中，在每24小時期間內產生超過30μg/百萬個細胞的hG-CSF-L-vFc融合蛋白。
9.一種產生權利要求1所述的hG-CSF-L-vFc融合蛋白的CHO-衍生的細胞系，其特征在于，其中人IgG Fc變體含有選自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的絞鏈、CH2和CH3區域，且IgG Fc含有降低效應子功能的氨基酸突變，在人G-CSF和人IgG Fc變體間存在含有約20個或更少氨基酸的柔性肽接頭，且hG-CSF-L-vFc融合蛋白的特性為且表現出在摩爾基礎比rhG-CSF高至少兩倍的體外生物活性。
10.一種制備含有人G-CSF、柔性肽接頭和人IgG Fc變體的重組融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)生成CHO-衍生的細胞系；(b)在用讓重組融合蛋白在其生長培養基中，每24小時期間內表達超過10μg/百萬個細胞表達的條件下培養這種細胞系；和(c)純化步驟(b)表達的蛋白質，其中重組融合蛋白的特征為且表現出提高的體外生物活性，其體外生物活性在摩爾基礎至少是rhG-CSF活性的2倍。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，在人G-CSF和人IgG Fc變體間存在含有約20或更少個氨基酸的柔性肽；且所述的柔性肽接頭含有2個或多個選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸。
12.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的人IgG Fc變體含有包括Pro331Ser突變的人IgG2的絞鏈區、CH2和CH3區域。
13.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的人IgG Fc變體含有包括Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4的絞鏈區、CH2和CH3區域。
14.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的人IgG Fc變體含有包括Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgG1的絞鏈區、CH2和CH3區域。
15.如權利要求10、11、12、13和14任一所述的方法，其特征在于，在所述的步驟(b)中在用讓重組融合蛋白在其生長培養基中每24小時期間內表達超過30μg/百萬個細胞的條件下培養這種細胞系。
16.一種制備含有人G-CSF、柔性肽接頭和人IgG Fc變體的重組融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)生成CHO-衍生的細胞系；(b)在用讓重組融合蛋白在其生長培養基中，每24小時期間內表達超過10μg/百萬個細胞的條件下培養這種細胞系；和(c)純化步驟(b)表達的蛋白質，其中重組融合蛋白的特征為且表現出提高的體外生物活性，在摩爾基礎至少是rhG-CSF體外生物活性的2倍；其中在人G-CSF和人IgG Fc變體間存在含有約20個或更少氨基酸的柔性肽接頭；和柔性肽接頭含有2個或多個選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸；和其中人IgG Fc變體含有選自以下的人IgG的絞鏈區、CH2和CH3區域具有Pro331Ser突變的人IgG2；具有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4；和具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgG1。
全文摘要
本文公開了一類在摩爾基礎上，生物活性比rhG－CSF更高的人G－CSF的Fc融合蛋白。這類hG－CSF－L－vFc融合蛋白含有人G－CSF、約20個或更少氨基酸的柔性肽接頭、和人IgG Fc變體。這種Fc變體無裂解性，且顯示極小的不良Fc－介導的副作用。本文還公開了一種高表達水平制備或產生這種融合蛋白的方法。這類hG－CSF－L－vFc融合蛋白表現出血清半衰期延長，且生物活性增加，從而改善藥物動力學和藥效，因此在一段時間內所需的注射次數較少。
文檔編號C07K14/435GK1410450SQ02126839
公開日2003年4月16日 申請日期2002年7月15日 優先權日2001年10月1日
發明者金宜慧, 孫乃超, 周若蕓 申請人:旭華(上海)生物研發中心有限公司