專利名稱：一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法
技術領域：
本發明涉及一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法。屬于蛋白質純化領域，是簡 單高效地制備高純度，高收率的藥用rhG-CSF原液的方法。
背景技術：
rhG-CSF是調節骨髓中粒系造血的主要細胞因子之一，選擇性作用于粒系造 血祖細胞，促進其增殖、分化，并可增加粒系終末分化細胞的功能。人G-CSF的氨基酸 序列為TPLGPASSLP QSFLLKCLEQVRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLL GHSLGIPWAP LSSCPSQALQLAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELG PTLDTLQLDV ADFATTIWQQMEELGMAPAL QPTQGAMPAF ASAFQRRAGG VLVASHLQSF LEVSYRVLRHLAQP1991年，第一個通過大腸桿菌表達系統生產的rhG-CSF藥物 Filgrastim(Neupogen，r-metHuG-CSF，Amgen Inc)在美國上市，1993 年，通過 CH0 表達系統
W^C N"irnW rhG-CSF Lenograstim(Granocyte,Chugai Pharmaceutical
Co. Ltd.)在歐洲上市。此后，國內外又有多家公司的rhG-CSF藥物上市。目前報道的關于G-CSF的專利，其主要的研究方向以下幾種情況(1)通過改變表 達體系，提高表達量如中國專利申請200810113138. 7報道了 G-CSF連接信號肽，目的蛋白 在工程菌周質腔表達；(2)改進發酵工藝，如通過高密培養，改變培養基配方，培養條件等 手段，實現工程菌的高表達，但這些方面目前并無實質性的突破，而只是作為與生產工藝的 一部分被提及；(3)優化復性工藝、純化步驟，如中國專利96106418.8報道了使用中空纖維 超濾透析復性方法，中國專利申請200410027943. x報道了通過2次復性以及超濾處理樣品 對純化過程進行優化；中國專利申請200410007171. 3報道了一步法純化rhG-CSF，純化產 物純度達到95%以上，可用于G-CSF的進一步修飾；中國專利申請200510045388. 8報道了 先對G-CSF進行初步純化，再進行復性，使原液細菌內毒素殘留量水平明顯降低，復性率提 高。中國專利申請200810064653報道了使用反相色譜法精細純化G-CSF的專利。以上專利報道中對于檢測方法的描述往往比較含糊或不提及，這樣就很難對純化 后樣品的純度究竟達到何程度有明確的認識，給評價不同專利中提到的純化方法帶來了困 難。以達到95%的純度為例，電泳純度與液相色譜純度可能有極大的區別；基于不同分離 原理的液相色譜純度檢測方法來評價同一樣品，得到的結果也大相徑庭；同一種型號的柱 子，當檢測條件不同時，對雜質的檢出率也有明顯區別。

發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在于提供了一種重組人粒細胞刺激因子的純化 方法，本發明具有工藝簡便快速，步驟少，收率高，純度高，樣品各項指標均符合歐洲藥典要 求，在兼顧環保的同時，提高藥品的安全性、可控性和有效性的特點。為達到上述的目的，本發明采用如下技術方案一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法，采用的大腸桿菌表達重組人粒細胞刺激因子rhG-CSF為包涵體形式，包括下述純化步驟(1)采用優化的包涵體洗滌液配方進行洗滌，獲得高純度的包涵體；(2)對洗滌后的包涵體樣品進行超濾復性；(3)復性后樣品通過Capto ViralQ柱層析；(4)然后通過Superdex 75凝膠過濾柱層析，得到純化后的重組人粒細胞刺激因 子rhG-CSF原液。所述的步驟(1)中包涵體洗滌液配制如下EDTA ImM ；鹽酸胍2M ；pH8. 5士0. 05的 Tris-HCl 50mM ；Nacl 50mM。所述的步驟(2)中超濾復性條件為包涵體溶于包涵體溶解液中，溶解后的包涵 體樣品，采用10mM/L的DTT還原劑，充氮避光2小時后，加入復性液中混勻后開始超濾，采 用恒體積透析，在超濾系統內保持體積和濃度恒定，跨膜壓力(TMP)不大于50psig，使流加 的洗濾液速度與透出液速度相同，共稀釋復性45 80分鐘。所述的包涵體溶解液配方為鹽酸胍6M ；pH8. 5士0. 05的Tris_HC150mM ； Nacl40mMo所述的復性液配方為鹽酸胍4M ；pH8. 5士0. 05Tris_HC150mM ；Nacl20mM。所述的步驟(3)中的Capto ViralQ柱層析采用的洗脫液為pH7. 5 士0. 05的50mM 磷酸鹽和0. 23M Nacl。所述的步驟(4)中的Superdex 75凝膠過濾層析采用的洗脫液為50mM醋酸鹽緩 沖液。本發明的有益效果是(1)獨特的包涵體洗滌步驟，為后續的純化奠定了基礎。(2)工藝簡單，步驟少。復性后樣品的純度已達到90%以上；1步柱層析將樣品純 化至藥用要求；樣品只經過2步純化，即可得到原液。(3)原液質量超過中國藥典要求，符合歐洲藥典EP6. 3版的標準，反相色譜純度 (CP法)達到99%以上，排阻色譜純度達到99%以上，反相色譜純度(EP)法達到98%以 上，殘余工程菌蛋白含量低于0. 005%，低于國家標準的10分之1，細菌內毒素每毫克低于 0. 25EU，僅相當于國家標準的120分之1 (標準為10EU/300 u g)。(4)高載量、高流速處理大體積樣品，大大縮短工藝時間，可進行大規模生產工 藝單批規模可達到100g以上。本發明緊密結合先進的質量檢測手段，確證純化效果達到要求。包涵體洗滌前后 進行了電泳考察對比；2步層析柱后樣品均進行了電泳和液相雙檢測；對于原液的檢測不 僅使用了電泳和液相色譜法同時檢測，而且僅針對反相色譜，就同時使用了歐洲藥典方法 和中國藥典方法的同時檢測。本工藝實現了以下幾個目的獨特的樣品預處理；柱層析步 驟少；工藝收率高，規模大；樣品質量高，用目前已知的最嚴格的藥用國際標準來控制樣品 質量。本發明的另一個明顯優勢是完全避免了強有機溶劑在生產工藝中的使用。乙腈 和甲醇是一種常見的純化用試劑，以達到蛋白質精細純化，獲得高純度的目的。當在規模化 生產中使用反相色譜方法進行蛋白的純化時，乙腈和甲醇等有機溶劑的用量很大，它們都 屬于有毒性的溶劑，大量使用有機溶劑帶來一系列的問題不僅價格昂貴，生產成本過高；樣品中的殘余溶劑可能帶來安全性隱患；廢水的處理會產生大量的環保處理費用；如排放 到環境中，將對環境帶來污染。本工藝在不降低任何收率和純度指標的情況下，避免使用有 機溶劑，優點突出。


圖1是本發明包涵體洗滌前后SDS-PAGE電泳圖譜；圖2是本發明復性樣品和純化中間體SDS-PAGE電泳圖譜；圖3是本發明復性后樣品的HPLC圖譜；圖4是本發明樣品通過Capto ViralQ柱后樣品的HPLC圖譜；圖5是本發明樣品通過Superdex 75凝膠過濾后樣品的HPLC圖譜；
圖6是本發明rhG-CSF原液SDS-PAGE電泳圖譜；圖7是本發明rhG-CSF原液HPLC-RPC圖譜(中國藥典法)；圖8是本發明rhG-CSF原液HPLC-RPC圖譜(歐洲藥典法)。
具體實施例方式下面通過具體實施例，對本發明作進一步的描述。本實施例采用的大腸桿菌表達重組人粒細胞刺激因子rhG-CSF為包涵體形式，首 先采用優化的包涵體洗滌液配方進行洗滌，獲得高純度的包涵體；包涵體洗滌液采用lmM EDTA ；2M鹽酸胍；50mM Tris_HClpH8. 5士0. 05 ；50mM Nacl。然后對洗滌前后的包涵體取樣 做電泳(SDS-PAGE0)，得到如圖1所示的電泳圖譜，如圖1所示，洗滌后包涵體的雜質量顯著 減少，尤其高分子區的雜質大大減少，經嚴格控制復性中采用的還原和氧化條件后可使復 性后樣品的純度提高。高分子區的雜帶明顯減少。然后對洗滌后的包涵體樣品進行超濾復性，包括以下步驟①取洗滌后的包涵體 (1000g 左右)溶于包涵體溶解液(鹽酸胍 6M ；pH8. 5士0. 05 的 Tris_HC150mM ；Nacl40mM) 中，加10mM/L的DTT還原劑，充氮避光2小時后備用。用0. 5N NaOH溶液清洗MaxCell UFP-5-C-85超濾系統30min，清洗后用注射水沖洗至中性。②稀釋復性將①中備用的包涵體溶解液加入復性液(鹽酸胍4M ； pH8. 5士0. 05Tris-HC150mM ；Nacl20mM)中混勻后，泵入超濾系統儲罐中開始超濾，采用恒 體積透析，在超濾系統內保持體積和濃度恒定，跨膜壓力(TMP)不大于50psig，使流加的洗 濾液速度與透出液速度相同，(洗濾液為PH 8. 5士0. 05Tris-HCl 50mM ；恒體積透析一邊 超濾流出超濾透出液，一邊往復性罐中流加等體積的洗濾液，目的是緩慢地降低復性液中 鹽酸胍、DTT還原劑等的濃度)共稀釋復性45 80分鐘。③收樣稀釋完畢濃縮收樣，按10ml/L加5M醋酸鹽調pH4. 0 4. 8。lOOOOrpm、 10°C離心30min，收集上清，取樣送檢掃描，電泳(SDS-PAGE)和液相色譜檢測。如圖2，圖3 所示，復性樣電泳圖譜中的4條雜質帶均小于2%的控制帶，液相純度為91. 68%。本步驟 得到的復性液電泳純度已達到90%以上。反相色譜純度達到90%以上。復性液收率蛋白 總量(掃描計)已不低于包涵體重量的10%，以包涵體干重計算，復性率不低于60%。再是通過G I層析柱層析① 100G I柱層析用0. 5NNa0H按200 士 10% cm/h流速清洗30min，用注射用水按相同流速洗至中性，后用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 5士0.05)，按350士 10% cm/h流速平 衡I柱約10倍柱體積。②復性液中加Tris-HCl緩沖液調pH7. 5士0. 05，并按350士 10% cm/h流速上樣， 上樣完畢，用50mM磷酸鹽+0.23M Nacl (pH7. 5 士 0. 05)液按相同流速洗脫，收集目標峰，按 4ml/L加5M醋酸鹽調pH4. 0 4. 8后，超濾濃縮，取樣送檢掃描，電泳(SDS-PAGE)和液相 色譜檢測，如圖2，圖4所示，I柱后樣電泳圖譜中的雜質量小于2%的控制帶，液相純度為 97. 12%。得出本步驟得到的I柱后樣，電泳及液相色譜純度均達到95%以上。最后是進行GII柱層析①(j5200GII 柱層析用 0. 5NNa0H 按 20士 10% cm/h 流速清洗 30min，用 50mM 醋酸 鹽緩沖液按20士 10% cm/h流速平衡II柱4倍柱體積。以相同流速上樣。②上樣完畢，用50mM醋酸鹽緩沖液按相同流速洗脫，收集目標峰，取樣并送檢。掃 描，電泳(SDS-PAGE)和液相色譜檢測，如圖2，圖5所示，II柱后樣電泳圖譜中的雜質量小 于2%的控制帶，液相純度為98. 54%。得出本步驟得到的II柱后樣，電泳及液相色譜純度 均達到98%以上。通過本步驟后得到純化后的重組人粒細胞刺激因子rhG-CSF原液，對其進行掃 描，電泳(SDS-PAGE)和液相色譜檢測，如圖6所示，原液電泳(SDS-PAGE)的雜質小于控 制帶，原液的電泳(SDS-PAGE)純度達到99%以上。然后將純化后的重組人粒細胞刺激因子 rhG-CSF原液進行反相色譜純度檢測，如圖7所示，(中國藥典CP法)達到99%以上，排阻色 譜純度達到99%以上，再將純化后的重組人粒細胞刺激因子rhG-CSF原液進行反相色譜純 度檢測，如圖8所示，(歐洲藥典EP)法達到98%以上，殘余工程菌蛋白含量低于0. 005%, 低于國家標準的10分之1，細菌內毒素每毫克低于0. 25EU，僅相當于國家標準的120分之 1。本實施例旨在建立一種優化的rhG-CSF的純化工藝，工藝簡便快速，步驟少，收率 高，純度高。尤其重要的是，本發明改進了包涵體的洗滌方法，使包涵體中的雜質，尤其是高 分子區的雜質大大減少；嚴格控制復性中采用的還原和氧化條件，使復性后樣品的純度達 到90%以上；樣品經過第一步柱層析(Capto ViralQ柱)后，電泳純度和HPLC純度已經達 到95%以上，殘余菌體蛋白和殘余細菌內毒素含量大大低于藥典標準要求，也就是說，一步 柱層析即可符合中國藥典規定的藥用要求；經過第二步層析(Superdex 75凝膠過濾)，樣 品各項指標均符合歐洲藥典要求。本實施例優化柱層析前的樣品處理，僅通過2步層析步驟即可獲得收率和純度均 極高的原液，特別適合用于rhG-CSF相關藥品的規模化生產及作為進一步進行PEG化等修 飾的rhG-CSF原料制備工藝。由于產品的純度顯著提高，制備工藝得到簡化，用到的有機溶 劑量減少，極大提高藥品的安全性、可控性和有效性，同時兼顧了環境保護。
權利要求
一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法，采用的大腸桿菌表達重組人粒細胞刺激因子rhG-CSF為包涵體形式，其特征在于包括下述純化步驟(1)采用優化的包涵體洗滌液配方進行洗滌，獲得高純度的包涵體；(2)對洗滌后的包涵體樣品進行超濾復性；(3)復性后樣品通過Capto ViralQ柱層析；(4)然后通過Superdex 75凝膠過濾柱層析，得到純化后的重組人粒細胞刺激因子rhG-CSF原液。
2.如權利要求1所述的一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法，其特征在于所述的 步驟⑴中包涵體洗滌液配制如下EDTA ImM ；鹽酸胍2M ；pH8. 5士0. 05的Tris-HCl 50mM ； Nacl 50mMo
3.如權利要求1所述的一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法，其特征在于所述 的步驟(2)中超濾復性條件為包涵體溶于包涵體溶解液中，溶解后的包涵體樣品，采用 10mM/L的DTT還原劑，充氮避光2小時后，加入復性液中混勻后開始超濾，采用恒體積透析， 跨膜壓力不大于50psig，使流加的洗濾液速度與透出液速度相同，稀釋復性45 80分鐘。
4.如權利要求3所述的一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法，其特征在于所述的 包涵體溶解液配方為鹽酸胍6M ；pH8. 5士0. 05的Tris-HCl 50mM ；Nacl 40mM。
5.如權利要求3所述的一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法，其特征在于所述的 復性液配方為鹽酸胍 4M ;pH8. 5士0. 05Tris-HCl 50mM ；Nacl 20mM。
6.如權利要求1所述的一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法，其特征在于所述的 步驟(3)中的Capto ViralQ柱層析采用的洗脫液為pH7. 5 士 0. 05的50mM磷酸鹽和0. 23M Nacl。
7.如權利要求1所述的一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法，其特征在于所述的 步驟(4)中的Superdex 75凝膠過濾層析采用的洗脫液為50mM醋酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發明公開了一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法，采用的大腸桿菌表達重組人粒細胞刺激因子rhG-CSF為包涵體形式，包括下述純化步驟(1)采用優化的包涵體洗滌液配方進行洗滌，獲得高純度的包涵體；(2)對洗滌后的包涵體樣品進行超濾復性；(3)復性后樣品通過Capto ViralQ柱層析；(4)然后通過Superdex 75凝膠過濾柱層析，得到純化后的重組人粒細胞刺激因子rhG-CSF原液。本發明具有工藝簡便快速，步驟少，收率高，純度高，樣品各項指標均符合歐洲藥典要求，在兼顧環保的同時，提高藥品的安全性、可控性和有效性的特點。
文檔編號C07K14/535GK101830977SQ201010170700
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月7日 優先權日2010年5月7日
發明者何艷, 余東新, 孫黎, 楊美花, 林崧, 蔡慧麗, 裴廣強 申請人:廈門特寶生物工程股份有限公司