專利名稱：糖基化的人粒細胞集落刺激因子(g－csf)同種型的制作方法
技術領域：
本發明總體上涉及人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的同種型。更具體地講，本發明涉及具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型，它在本發明的一個或多個特殊的氨基酸位置處包含糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)，因此改善了人G-CSF的體內穩定性。本發明還涉及它們的糖基化形式。
背景技術：
集落刺激因子(CSFs)是調節造血祖細胞的增殖和分化以及成熟的血細胞的功能的細胞因子。在CFSs中，人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)被認為是人嗜中性粒細胞產生的主要刺激劑。
G-CSF是在單核細胞、成纖維細胞和內皮細胞中生產的糖蛋白。純化的G-CSF能刺激由骨髓祖細胞形成嗜中性粒細胞集落，誘導終極分化(Nicola等，JBC，Vol.258，No.149017-23，1983)，并且抑制白細胞的自我復制和增殖(Metcalf和Nicola，Leukemia Research，Vol.9，135-50，1985)。人G-CSF(hG-CSF)最初是從人鱗狀癌細胞系CHU-2(Nomura等，EMBO J.，Vol.5，No.5871-76，1986)中純化的，然后，又從人膀胱癌細胞系5637(Welte等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，821526-30，1985；和Strife等，Blood，Vol.69，No.51508-1523，1987)中純化出來了，其中，檢測到了所述細胞系促進人粒細胞集落形成的活性。純化的hG-CSF被鑒定的分子量為18,000-19,000Da，pI值為6.1(根據糖基化程度，pI值在5.5-6.1之間波動(Nomura等，EMBO J.，Vol.5，No.5871-76，1986)。
通過G-CSF刺激產生的嗜中性粒細胞的直徑為10-20μm，占白細胞的70％以上，并且，在保護動物免受細菌感染方面發揮重要作用。不過，由于它的半衰期比巨噬細胞和單核細胞短，嗜中性粒細胞必須由骨髓中的多能干細胞連續生產。
從人膀胱癌5637細胞中分離的hG-CSF最初被稱為多能集落刺激因子或GM-CSF，這基于的是以下發現除了嗜中性粒細胞之外，它還能刺激紅細胞、巨核細胞和巨噬細胞的生成(Welte等，Proc.Narl.Acad.Sci.U.S.A.，821526-30，1985；Platzer等，J.Exp Med，1621788-1801，1985；and Nicola等，Nature，314625-28，1985)，并且影響多能祖細胞，例如，誘導人髓細胞性白血病細胞系HL-60和鼠粒-單核細胞性白血病細胞系WEHI-3B(D+)增殖。不過，在排除骨髓細胞和淋巴細胞的研究中，發現分離的蛋白能強烈刺激嗜中性粒細胞集落形成，并因此被命名為G-CSF(Welte等，Proc.Narl.Acad.Sci.U.S.A.，821526-30，1985；Metcalf，Science，22916-22，1985；Metcalf，Blood，Vol.67，No.2257-67，1986；Metcalf，Proc.R.Soc.Lond.B.，230389-423，1987；和Sachs，Science，2381374-79，1987)。用分離的hG-CSF處理源于人骨髓細胞的缺乏貼壁細胞和T-淋巴細胞的造血集落形成祖細胞混合物，7天之后觀察到了嗜中性粒細胞集落形成(Welte等，Proc.Narl.Acad.Sci.U.S.A.，821526-30，1985；和Platzer等，J.，Exp.Med.，1621788-1801，1985)。另外，分離的hG-CSF能刺激WEHI-3B(D+)細胞的分化。
鼠G-CSF(mG-CSF)具有類似于hG-CSF的生物學活性。就是說，在CFU-GM測定中，mG-CSF能產生嗜中性粒細胞集落，并且誘導WEHI-3B(D+)細胞的終極分化。另外，hG-CSF不僅在人骨髓細胞中起作用，而且還在鼠骨髓細胞中起作用。相反，mG-CSF能對人和鼠骨髓細胞起作用。
在施用G-CSF的動物中，G-CSF的體內作用受它的給藥量的調控，并且，在終止G-CSF治療時，嗜中性粒細胞的血液水平保持在正常水平上。不過，缺乏G-CSF受體的血細胞的血液含量，即紅細胞、單核細胞和淋巴細胞沒有改變。
在骨髓細胞和脾細胞中，G-CSF受體是骨髓前體細胞分化成嗜中性粒細胞所必需的。另外，成熟的嗜中性粒細胞攜帶G-CSF受體這一事實表明，G-CSF激活了所述成熟細胞。每個細胞的受體數量在50-500個之間。半數最大刺激所需要的G-CSF的濃度為大約10pM，而對于G-CSF受體結合來說，G-CSF的平衡解離常數(Kd)大約為60-80pM。這一事實表明，由G-CSF誘導的增殖在存在低水平G-CSF受體的情況下也發生。
除了成熟的嗜中性粒細胞之外，G-CSF能影響嗜中性粒細胞祖細胞。就是說，G-CSF能增強成熟的嗜中性粒細胞的存活(Begley等，Blood，Vol.68，No.1162-66，1986)，并且不會誘導急性原始粒細胞性白血病細胞分化成成熟細胞，導致嗜中性粒細胞的特異活化(Lopez等，J.Immunol.Vol 131 No62983-2988，1983；和Platzer等，J.Exp.Med.，1621788-1801，1985)。
另外，對用5-氟尿嘧啶和環磷酰胺處理已誘導了嗜中性白血球減少癥的動物服用G-CSF時，發現嗜中性粒細胞的增殖顯著增強。在基于這一發現的臨床實驗中，在將G-CSF對接受化療的惡性腫瘤患者給藥(Bronchud等，Br.J.Cancer，56809-13，1987；Gabrilove等，New England J.Med.，Vol.318，No.221414-22，1988；和Morstyn等，Lancet，March26667-71，1988)，以及對經放射性同位素或環磷酰胺處理之后進行骨髓細胞移植的患者給藥(Kodo等，Lancet，July238-39，1988)時，患者僅僅感到略微有點疼，G-CSF很少導致副作用，并且在這兩種情況下，G-CSF都能誘導嗜中性粒細胞增加。以上結果表明，服用G-CSF，有利于保護接受化療或骨髓移植的患者免于在嗜中性粒細胞水平恢復到正常水平被延遲的情況下發生的細菌或真菌感染。這些成功的臨床實驗使得能夠將G-CSF應用于多種患有嗜中性白血球減少癥的患者。
通過重組DNA技術鑒定了G-CSF的分子和遺傳學特征(Clark和Kamen，Science，2361229-37，1987)，并且使用重組G-CSF在體內和體外對G-CSF的功能進行了多種研究。人G-CSF是從cDNA文庫中克隆的，該文庫是使用從CHU-2細胞和人膀胱癌5637細胞制備的mRNA構建的(Nagata等，Nature，319415-18，1986；Nagata等，EMBO J.，Vol.5，No.3575-81，1986；和Souza等，Science，23261-65，1986)。在本研究中，分離了人G-CSF的兩種不同的cDNAs。對這兩種cDNAs的核苷酸序列分析表明，它們分別編碼由207和204個氨基酸組成的多肽，并且它們的翻譯產物在N-末端具有30個氨基酸的前序列(分泌前導序列)，由所述cDNAs編碼的兩種多肽在35號位置處不同，其中，缺失/插入了三個氨基酸(Val-Ser-Glu)。因此，成熟的G-CSF蛋白由174個氨基酸(MW 18，671Da)或177個氨基酸(MW 18，987Da)組成。
具有174個氨基酸的G-CSF活性比具有177個氨基酸的G-CSF的活性強20倍以上。不過，仍然不清楚這兩種不同的形式是否在人體中表達。人G-CSF不具備N-糖基化序列(Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T))，但是在Thr-133號位置處具有O-糖基化位點。當在大腸桿菌(Souza等，Science，23261-65，1986；Delvin等，Gene，6513-22，1988)和動物細胞(Tsuchiya等，EMBO J.，Vol.6，No.3611-16，1987)中生產由人G-CSF的cDNA制備的重組人G-CSF時，發現在大腸桿菌中生產的重組人G-CSF的活性與天然形式以及在動物細胞中表達的形式的活性相同。以上結果表明，對于G-CSF活性來說，糖基化是不重要的。人G-CSF與GM-CSF、白介素-3和M-CSF沒有氨基酸序列同源性，并且具有由5個半胱氨酸殘基中的4個形成的兩個二硫鍵(Cys36-Cys42和Cys64-Cys74)。
由于它們的體內穩定性低，被用作藥物的大部分具有生理學活性的蛋白需要過量或頻繁地給患者施用，以便保持能夠提供令人滿意的治療效果的合適濃度。這種給藥方式導致了患者的疼痛和不便。因此，有必要開發具有改善了的體內穩定性、并因此解決了現有技術的上述問題的、具有生理學活性的蛋白質。
為了改善具有生理學活性的蛋白質的體內穩定性，可以將干擾素-α和聚乙二醇綴合，正如在國際專利公開號WO9848840中所披露的；并且可以將人生長激素微膠囊化，正如在美國專利號6,399,103中所披露的。不過，上述方法的缺陷在于，在微生物中生產并且純化目標蛋白之后，需要進行額外。另外，可能在不希望的位置處形成交聯。而且，所述生產過程不能確保最終產品的均一性。
另一種方法使用糖基化。在真核細胞中生產的細胞表面蛋白和分泌蛋白通過糖基化受到修飾。除了它們的生理學特性之外，已知糖基化修飾能影響蛋白質的體內穩定性和功能。

發明內容
的公開因此，本發明的目的是制備具有改善了的體內穩定性并且能夠通過采用重組DNA技術在細胞系中生產糖基化狀態下的人G-CSF而方便地生產的人G-CSF。
在本發明的一方面，提供了具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型，它在下面的一個或多個氨基酸位置處包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)；-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)；和-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
在本發明的另一方面，提供了編碼具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型的基因，它在上述一個或多個氨基酸位置處包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)。
在本發明的另一方面，提供了攜帶編碼具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型的基因的表達載體，它在上述一個或多個氨基酸位置處包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)。
在本發明的另一方面，提供了用攜帶編碼具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型的基因的表達載體轉化或轉染的宿主細胞，所述氨基酸序列在上述一個或多個氨基酸位置處包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)。
在本發明的另一方面，提供了制備糖基化的人G-CSF同種型的方法，包括以下步驟培養被攜帶編碼具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型的基因的表達載體轉化或轉染過的真核宿主細胞，所述氨基酸序列在上述一個或多個氨基酸位置處包含糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)，和從所述培養上清液或培養裂解液中分離所述氨基酸序列糖基化的人G-CSF同種型。
在本發明的另一方面，提供了通過對具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型進行糖基化而制備的糖基化人G-CSF同種型，所述氨基酸序列在上述一個或多個氨基酸位置處包含糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)。
在本發明的另一方面，提供了包括通過對具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型進行糖基化而制備的糖基化的人G-CSF同種型的藥物組合物，所述氨基酸序列在上述一個或多個氨基酸位置處包含糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)，和藥用可接受的載體。
在本發明的另一方面，提供了在PCR中被用作引物以便在人G-CSF上產生糖基化位點的合成的寡聚脫氧核苷酸。
附圖的簡要說明通過以下詳細說明，并結合附圖，可以更清楚地理解本發明的上述以及其他目的、特征和其他優點，其中

圖1表示天然人G-CSF的核苷酸序列和氨基酸序列，其中，核苷酸序列上方的箭頭或直線表示在人G-CSF蛋白的三級結構中包含螺旋結構的區域，箭頭的方向表示所述螺旋沿氨基酸序列的方向，并且，天然成熟的人G-CSF在第133位蘇氨酸殘基處具有O-連接的糖基化位點，能在人或任何真核細胞中發揮作用；圖2表示本發明的人G-CSF蛋白的被修飾的氨基酸位置，其中，前序列位于N-末端；圖3表示用天冬酰胺修飾天然人G-CSF的第51位甘氨酸殘基的過程；圖4表示用天冬酰胺修飾天然人G-CSF第94位甘氨酸殘基的過程；圖5表示用天冬酰胺修飾天然人G-CSF的第51和94位甘氨酸殘基二者的過程；圖6表示分別用天冬酰胺和絲氨酸修飾天然人G-CSF的第133位蘇氨酸和第135位甘氨酸殘基的過程；圖7表示分別用天冬酰胺、天冬酰胺和絲氨酸修飾天然人G-CSF的Gly-51，Thr-133和Gly-135的過程；圖8表示人G-CSF同種型的Western印跡結果的照片(泳道1野生型人G-CSF；泳道2G51N同種型；泳道3G51N/G94N同種型；泳道4G94N同種型；泳道5G51N/T133NG135S同種型；泳道6T133NG135S同種型；和泳道7分子量大小標記)，其中，將抗人G-CSF的山羊多克隆抗體用作一抗，并且用HRP綴合的小鼠抗山羊多克隆抗體用作二抗；和圖9表示在大鼠中人G-CSF同種型的血液含量隨時間變化的曲線圖。
本發明的最佳實施方式本文所使用的術語“人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的同種型”表示在天然人G-CSF蛋白的一個或多個氨基酸位置處具有一個或多個氨基酸修飾、同時保持了天然的生物學活性的類似物或突變體。
在本文中所使用的表示氨基酸的單個大寫字母，按照國際生物化學聯合會規定的標準縮略語表示以下氨基酸A丙氨酸；B天冬酰胺或天冬氨酸；C半胱氨酸；D天冬氨酸；E谷氨酸；F苯丙氨酸；G甘氨酸；H組氨酸；I異亮氨酸；K賴氨酸；L亮氨酸；
M甲硫氨酸；N天冬酰胺；P脯氨酸；Q谷氨酰胺；R精氨酸；S絲氨酸；T蘇氨酸；V纈氨酸；W色氨酸；Y酪氨酸；和Z谷氨酰胺或谷氨酸。
本文所使用的短語“(氨基酸的一個大寫字母)(氨基酸位置)(另一個氨基酸的一個大寫字母)”，表示在指定的人G-CSF的氨基酸位置處，前一個氨基酸被后一個氨基酸所取代。例如，G51N表示天然人G-CSF的第51位的甘氨酸殘基被天冬酰胺所取代。
在本發明中用于導入糖基化基序的引物被命名為“(氨基酸的一個大寫字母)(氨基酸位置)(另一個氨基酸的一個大寫字母)1或2”，其中，1表示互補于雙鏈核苷酸的5′→3′-方向的單鏈模板的引物，而2表示互補于所述雙鏈核苷酸的3′→5′-方向的單鏈模板的引物。
通過添加一個或多個寡糖部分，修飾在真核宿主細胞中生產的分泌蛋白。這種修飾被稱為糖基化，已知它能顯著影響蛋白的生理學特性，并且對蛋白的穩定性，分泌和細胞內定位來說是重要的。正確的糖基化可能是某些蛋白的生物學活性所必需的。實際上，當源于真核細胞的基因在缺乏負責蛋白糖基化的細胞內過程的細菌中表達時，未糖基化的翻譯產物通常具活性降低。
糖基化發生在多肽主鏈的特殊位置上。存在兩種類型的糖基化。O-連接的糖基化將寡糖鏈連接在蛋白質中絲氨酸和/或蘇氨酸的羥基(-OH)上。N-連接的糖基化始于寡糖鏈與天冬酰胺殘基的酰胺基團(-NH)的連接。具體地講，N-型糖基化發生在以下特殊氨基酸序列中Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)(X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸)。N-連接的寡糖具有不同于O-連接的寡糖的結構，并且，存在于N-連接的類型中的糖基化殘基同樣不同于O-連接的類型。例如，在O-連接的寡糖上，N-乙酰半乳糖胺總是與絲氨酸或蘇氨酸連接，而在N-連接的寡糖上，N-乙酰葡糖胺與天冬酰胺連接。另外，O-連接的寡糖通常含有4個或4個以下糖殘基。相反，N-連接的寡糖包含5個或5個以上殘基，本質上包括N-乙酰葡糖胺和甘露糖。
本發明涉及具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型，它在本發明的一個或多個特殊的氨基酸位置處包含糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)，因此改善了天然人G-CSF蛋白的體內穩定性。在本發明中，確定了人G-CSF的糖基化可通過在除了螺旋結構形成區內位置外的任何氨基酸位置處插入糖基化序列而誘導。
一方面，本發明包括具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型，它在下面的一個或多個氨基酸位置處包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)；-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)；和-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
在優選方面，本發明包括具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型，它在下面的一個或多個氨基酸位置處包括糖基化序列 Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；-L92-L9 9(L92-E-G-I-S-P-E-L99)；和-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
在更優選的方面，本發明包括人G-CSF同種型，它具有以下修飾甘氨酸-51被修飾成天冬酰胺，甘氨酸-94被修飾成天冬酰胺，或蘇氨酸-133和甘氨酸-135分別被修飾成天冬酰胺和絲氨酸，或具有所有上述修飾。
在本發明中，為了獲得人G-CSF的額外的糖基化，對編碼人G-CSF的DNA序列在一個或多個核苷酸處進行修飾，并且將突變的DNA導入能夠在其中進行蛋白糖基化和表達的真核細胞。因此，人G-CSF的額外糖基化可通過修飾它的相應的DNA序列，以便在其中導入Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)而實現。
一方面，本發明包括編碼具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型的基因，所述氨基酸序列在下述一個或多個氨基酸位置處包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)；-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)；和-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
在優選方面，本發明包括編碼具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型的基因，所述氨基酸序列在下述一個或多個氨基酸位置處包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)；和-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
在優選方面，本發明包括編碼人G-CSF同種型的基因，它具有以下修飾甘氨酸-51被修飾成天冬酰胺，甘氨酸-94被修飾成天冬酰胺，或蘇氨酸-133和甘氨酸-135分別被修飾成天冬酰胺和絲氨酸，或具有所有上述修飾。
在本發明的一個方面，編碼人G-CSF的基因是從表達人G-CSF的真核細胞中獲得的。可以通過本領域公知方法克隆和分離所述基因。
按照上述方法獲得的人G-CSF基因可以在一個或多個選擇的密碼子處進行修飾。本文所使用的術語“修飾”表示用不同的密碼子取代人G-CSF-編碼基因上的一個或多個密碼子，因此導致人G-CSF的氨基酸序列改變。更具體地講，術語“修飾”表示人G-CSF的一個或多個氨基酸殘基被不同的氨基酸所取代，從而將糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)導入人G-CSF的氨基酸序列，并因此可以進行額外的N-連接的糖基化。例如，在實施例3中，當第51位甘氨酸殘基被天冬酰胺取代時，由于第53位殘基是絲氨酸，就形成了糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)。因此，可以進行人G-CSF的額外的N-連接糖基化。另外，當第94位甘氨酸殘基被天冬酰胺取代時，由于第96位氨基酸殘基是絲氨酸，就形成了Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)序列，因此可以進行人G-CSF的額外的N-連接糖基化。另外，當第133位蘇氨酸和第135位甘氨酸殘基分別被天冬酰胺和絲氨酸取代時，形成了Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)，因此，可以進行人G-CSF的額外的N-連接糖基化。
在本發明的一個方面，合成了包括編碼人G-CSF中所需氨基酸修飾的密碼子的寡核苷酸。通常，用于本發明的寡核苷酸由大約25個核苷酸組成。可以采用更短的寡核苷酸，不過，最佳的寡核苷酸在被修飾密碼子的左側和右側區域均包括與模板互補的12-15個核苷酸。所述寡核苷酸可以有效地與模板DNA雜交。在實施例3表1中列舉了本發明中用于生產額外的糖基化位點的寡核苷酸。所述寡核苷酸可以通過本領域公知技術合成。
在本發明的一個方面，提供了編碼具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型的DNA序列。用人G-CSF cDNA作模板，并且用編碼修飾的寡核苷酸作引物進行PCR。引物與它們的互補的單鏈DNA雜交，這種單鏈DNA是通過加熱期間雙鏈DNA模板變性產生的。DNA聚合酶沿5′→3′方向以與模板互補的方式將核苷酸一個一個地添加到編碼修飾的引物的3′-OH上。新合成的鏈包含編碼所述修飾的引物，因此得到了編碼所需要的修飾的基因。在PCR的延伸步驟中，將新合成的鏈用作模板DNA，導致了編碼所述修飾的基因的擴增。例如，在實施例3中，為了將第51位甘氨酸殘基改變成天冬酰胺，用天然G-CSF DNA作模板，使用引物組CSF5和G51N2，或G51N1和CSF3進行PCR。結果獲得了兩種DNA片段，它們在第51位甘氨酸殘基處攜帶編碼天冬酰胺的密碼子。用這兩種DNA片段作模板，用引物對CSF5和CSF3進行第二PCR，得到了編碼G-CSF-G51N的修飾過的基因，該G-CSF-G51N因用天冬酰胺修飾了第51位氨基酸殘基而可以被額外的糖基化。
在本發明的另一方面，提供了具有兩個或兩個以上氨基酸修飾的人G-CSF同種型。具有兩個或兩個以上氨基酸修飾的突變體可以通過多種方法制備。當要修飾的兩個或兩個以上氨基酸在多肽上彼此相隔很近時，所有需要的修飾可以由一個寡核苷酸編碼，因此能同時實現。因此，可以通過與制備具有一個核苷酸修飾的突變的人G-CSF基因相同的方法，制備具有兩個或兩個以上氨基酸修飾的突變的人G-CSF蛋白，所不同的是，其中將包括兩個或兩個以上氨基酸修飾的寡核苷酸用作引物。不過，在要修飾的兩個或兩個以上氨基酸間隔較遠的情況下(若要修飾的兩個氨基酸之間存在10個以上氨基酸)，所有需要的修飾不能夠由一個寡核苷酸編碼。
相反地，要使用不同的方法。一種方法是制備用于每一種氨基酸修飾的獨立的寡核苷酸。當所述寡核苷酸與單鏈模板DNA同時退火，則新合成的二級單鏈DNA將編碼所有需要的氨基酸修飾。本發明中用于生產人G-CSF同種型的另一種方法包括兩種誘變實驗。在所述一級突變中，用天然DNA作模板，使包括一種需要的氨基酸修飾的一種寡核苷酸與所述模板退火，由此產生了雜雙螺旋DNA。在二級誘變中，將所述雜雙螺旋DNA用作模板，所述模板業已攜帶了至少一種修飾。當一種具有額外氨基酸修飾的寡核苷酸與所述模板退火時，所得到的DNA編碼這兩種修飾，并且可用作第三次誘變的模板。就是說，修飾兩個或兩個以上核苷酸的方法，就是將修飾一個核苷酸的方法重復若干次。例如，在實施例3中，為了將天然人G-CSF上的第51位甘氨酸修飾成天冬酰胺，并且將第94位甘氨酸修飾成天冬酰胺，首先修飾第94位氨基酸，并且，將所得到的DNA用作模板，修飾第51位氨基酸。結果產生了具有這兩種修飾的突變的人G-CSF基因。
可以通過本領域公知的標準方法合成本發明的編碼人G-CSF同種型的DNA序列，例如，使用自動DNA合成儀(Biosearch，AppliedBiosystemTM)。
本發明的糖基化的人G-CSF同種型通常是通過以下步驟制備的(a)將編碼人G-CSF同種型的DNA序列插入攜帶一種或多種表達控制序列的載體內，使得所述DNA序列可操作地與所述表達控制序列連接，并因此受所述表達控制序列的控制；(b)用所得到的重組表達載體轉化或轉染宿主細胞；和(c)在合適的培養基中，并且在適合表達所述人G-CSF同種型DNA序列的條件下培養所述轉化體或轉染體，并且分離糖基化的人G-CSF同種型。
在這一方面，本發明提供了被這種攜帶編碼人G-CSF同種型的DNA序列的重組表達載體轉化或轉染了的宿主細胞。
當然，可以理解的是，所有載體和表達控制序列在表達本發明的核苷酸序列方面并不會相同地發揮功能。類似地，所有類型的宿主細胞在相同的表達系統中也不會相同地發揮功能。不過，在本發明的范圍內，在不進行過多的實驗的情況下，本領域普通技術人員可以選擇合適的載體、表達控制序列和宿主細胞。例如，在選擇載體時，應當考慮宿主，因為載體必須在該宿主中復制。另外，所述載體的拷貝數，控制所述拷貝數的能力，以及由所述載體編碼的任何蛋白的表達，如抗生素標記，都應當考慮。在選擇表達控制序列時，還應當考慮多種因素。這些因素包括所述序列的相對強度，它的可控制性，以及它與本發明核苷酸序列的相容性，特別是在潛在的二級結構方面。另外，宿主的選擇應該考慮到它們與所選擇載體的兼容性，由所述核苷酸序列編碼的產物的毒性，它們的分泌特征，它們正確地折疊所述多肽的能力，它們的發酵或培養要求，以及純化由所述核苷酸序列編碼的產物的方便性。
本文所使用的術語“載體”表示被用作能夠將外源基因穩定地攜帶到宿主細胞中的媒介物的DNA分子。為了能夠使用，載體應當是能夠復制的，具有將它自身導入宿主細胞的系統，并且具有選擇標記。另外，本文所使用的術語“重組表達載體”表示攜帶可操作地與它連接的要在宿主細胞中表達的外源基因的環狀DNA分子。在導入宿主細胞時，重組表達質粒具有與宿主染色體DNA無關地復制的能力，以高拷貝數拷貝它自身，并且產生異源DNA。正如本領域所普通公知的，為了提高轉染基因在宿主細胞中的表達水平，所述基因應當可操作地與能夠在被選作表達系統的宿主細胞中起作用的轉錄和翻譯調控序列連接。優選的是，所述表達調控序列和外源基因可以攜帶在包括細菌選擇標記和復制起點的同一表達載體上。在真核細胞被用作表達系統時，所述表達載體還應當包括可用于所述真核宿主細胞的表達標記。
為了表達本發明的編碼人G-CSF同種型的DNA序列，可以采用各種表達載體。由于所述人G-CSF同種型應當被糖基化，應當優選使用適合真核宿主細胞的表達載體。可用于真核宿主細胞的表達載體包括源于例如SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和巨細胞病毒的表達控制序列。具體地講，所述載體的例子包括pCDNA3.1(+)/Hyg(Invitrogen，Carlsbad，Calif.，USA)和pCI-neo(Stratagen，La Jolla，Calif.，USA)。可用于酵母的表達載體包括2μ質粒以及它的同種型，POT1載體(美國專利號4,931,373)和pPICZ A，B或C(Invitrogen)。可用于昆蟲細胞的表達載體包括pVL 941，pBluebac 4.5和pMelbac(Invitrogen)。
術語“表達控制序列”表示本發明多肽表達所需要或有用的核苷酸序列。對編碼所述多肽的核苷酸序列來說，每一種控制序列可以是天然的或外源的。所述表達控制序列的非限定性例子包括前導序列，聚腺苷酸化序列，前肽序列，啟動子，增強子或上游活化序列，信號肽序列，和轉錄終止子。所述表達控制序列包括至少一個啟動子序列。
為了表達本發明的核苷酸序列，可以將多種表達控制序列中的任意一種插入用于本發明的表達載體。適用于指導哺乳動物細胞中蛋白表達的表達控制序列的例子包括SV40和腺病毒的早期和晚期啟動子，MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動子，人巨細胞病毒立即早期基因啟動子(CMV)，勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子，和人泛素C(UbC)啟動子。另外，為了提高在哺乳動物細胞中的表達水平，可以將合成內含子插入編碼所述多肽的核苷酸序列的5′-非翻譯區。適合指導昆蟲細胞中蛋白表達的表達控制序列的例子包括多角體蛋白啟動子，P10啟動子，桿狀病毒39K延遲早期基因啟動子和SV40聚腺苷酸化序列。適合在酵母中指導蛋白表達的表達控制序列的例子包括酵母α-配合系統啟動子，酵母磷酸丙糖異構酶(TPI)啟動子和ADH2-4c啟動子。適合指導真菌細胞中蛋白表達的表達控制序列的例子包括ADH3啟動子和終止子。
用于本發明的載體的另一有用的成分是信號肽序列。信號肽序列通常位于編碼蛋白的基因的5′區，并因此是在與所述蛋白的N-末端連接的狀態下翻譯的。例如，所述信號肽的存在或缺乏取決于用于生產要表達的多肽的表達宿主細胞(無論它是細胞內的或細胞外的多肽)，以及它是否需要獲得分泌。如果多肽要從表達它的細胞中分泌時，在所述多肽上就存在信號肽。如果存在所述信號肽的話，它應當能夠由被選擇用于表達所述多肽的細胞識別。信號肽可以與所述多肽同源(通常與所需要的多肽結合)或異源(源于不同的多肽)，并且可以與宿主細胞同源或異源。
當核苷酸序列以功能性關系與另一種核苷酸序列排列在一起時，這種排列被定義為“可操作地連接”。所述核苷酸序列可以是基因和控制序列，它們是以在合適的分子(例如，轉錄活化蛋白)與所述控制序列結合時能誘導基因表達的方式連接的。例如，當前序列或分泌前導序列能促進成熟蛋白分泌時，它被稱作“可操作地與所述蛋白連接”。當啟動子能調控編碼序列的轉錄時，它就是可操作地與該編碼序列連接的。當核糖體結合位點存在于允許編碼序列翻譯的位置上時，它就是與所述編碼序列可操作地連接的。通常，術語“可操作地連接”表示連接的核苷酸序列是彼此接觸的。對于分泌前導序列來說，該術語表示它與編碼序列接觸，并且存在于該編碼序列的前導框內。不過，增強子不必與編碼序列接觸。核苷酸序列的連接可以通過在方便的限制酶識別位點相連接來實現。在缺少限制酶識別位點的情況下，可以使用寡核苷酸接頭或銜接子，它們可通過常規方法合成。
包括上述成分(即表達控制序列)以及編碼所述人G-CSF同種型的基因的合適的載體可以通過常規重組DNA技術制備。為了制備需要的載體，用合適的限制酶消化分離的DNA片段，并且以獨特的順序和方向連接。
DNA分子可以用特異性的限制酶在緩沖溶液中消化。通常，用存在于20μl緩沖溶液中的大約1-2單位限制酶消化大約0.2-1μg質粒DNA或DNA片段。合適的緩沖液、DNA濃度以及溫育時間和溫度由生產限制酶的公司規定。通常，合適的溫育是在37℃下進行大約1-2小時，不過，某些限制酶需要更高的溫度。在溫育之后，通過用苯酚和氯仿的混合物提取，除去酶和其他雜質，并且通過用乙醇沉淀，從含水層中回收DNA。在這里，為了生產有功能的載體，消化的DNA片段的一端應當與另一個消化的DNA片段的一端互補。
應當通過電泳根據大小分離消化的DNA片段，并且選擇。DNA可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺基質電泳。基質可依據要分離的DNA片段的大小而確定。在電泳之后，通過電洗脫，或者在使用低熔點瓊脂糖時通過簡單地熔化瓊脂糖，從所述基質中提取DNA。
要連接的DNA片段應當以相同的摩爾比添加到反應溶液中。所述反應溶液包括ATP，連接酶緩沖液和每0.5μg DNA 10個單位的T4連接酶。為了將DNA片段與載體相連接，首先應當通過用合適的限制酶消化而將所述載體線性化。線性化的載體應當用堿性磷酸酶或牛腸道堿性磷酸酶處理。這種堿性磷酸酶處理防止了所述線性化載體的自我連接。然后，用制備的重組表達載體轉化或轉染宿主細胞。
通常，可以使用外源DNA導入效率高、并且具有導入基因的高表達水平的宿主細胞。具體地講，作為宿主細胞，可以使用真核細胞，它能夠使本發明的人G-CSF同種型糖基化。合適的酵母宿主細胞的例子包括酵母屬和漢遜酵母屬菌株。合適的真菌宿主細胞的例子包括木霉屬，鐮孢屬和曲霉菌。合適的昆蟲細胞的例子包括鱗翅目細胞系，如Sf9或Sf21。合適的哺乳動物細胞的例子包括CHO細胞系，COS細胞系，如COS1或COS7，動物細胞系，如BHK細胞系或小鼠細胞，以及組織培養的植物細胞和人類細胞。
可以通過在基礎實驗指南中披露的方法將多核苷酸導入宿主細胞(例如，Davis等，Basic Methods in Molecular Biology(1986)；和Sambrook，J.，等(1989)″Molecular Cloning″ALaboratory Manual 2nd edition)。例如，用于將多核苷酸導入宿主細胞的優選方法包括磷酸鈣轉染，DAEA-葡聚糖介導的轉染，縮并(transvection)，顯微注射，陽離子脂類介導的轉染，電穿孔，轉導，摩擦加載(scrape loading)，彈道導入，和感染。
在本發明的生產方法中，在適合用本領域已知的方法生產多肽的營養培養基中培養所述宿主細胞。例如，可以通過搖瓶培養法培養所述細胞，在實驗室或工業發酵罐中小規模或大規模發酵，這種培養是在合適的培養基中并且在能夠表達和/或分離所述多肽的條件下進行。所述培養在含有碳和氮源以及無機鹽的合適的營養培養基中，使用本領域公知的方法進行。合適的培養基為本領域普通技術人員所公知，并且可以通過商業渠道購買或者可以按照公開的配方配制。如果所述多肽被分泌到營養培養基中，就可以直接從該培養基中回收所述多肽。如果所述多肽未被分泌，就可以從細胞裂解液中回收。
所生產的多肽可以通過本領域公知的方法回收。例如，可以通過常規方法從所述營養培養基中回收所述多肽，包括，但不局限于離心，過濾，提取，噴霧干燥，蒸發或沉淀。所述多肽可以通過本領域公知的多種方法純化，包括，但不局限于層析(例如，離子交換，親和力，疏水，層析聚焦，和大小排阻)，電泳，溶解度差異(例如硫酸銨沉淀法)，SDS-PAGE，或提取)。
本發明提供了糖基化的人G-CSF同種型，它具有通過上述方法獲得的額外的糖基化。在本發明中，短語“具有額外糖基化的糖基化人G-CSF同種型”可以被定義為這樣一種表達產物，其因將被修飾成能夠插入一個或多個糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)的人G-CSF基因導入真核宿主細胞、然后在所述宿主細胞中表達所述基因而自發糖基化。就是說，它表示通過將糖殘基與人G-CSF同種型上的額外糖基化位點Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)的酰胺基團(-NH)共價結合而形成的異源分子。
另外，本發明提供了包括具有額外糖基化的糖基化人G-CSF同種型和藥用可接受載體的藥物組合物。用于治療性使用的所述糖基化人G-CSF同種型的治療制劑可以通過將具有所需純度的所述糖基化人G-CSF同種型與生理學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑混合，并且將該混合物制備成具有冷凍干燥塊的含水制劑而制備(Remington′sPharmaceutical Sciences，16th edition，Olso，A.，ED.，(1980))。用于腸胃外給藥的藥物制劑可以通過將本文所披露的糖基化人G-CSF同種型與藥用可接受載體混合，并且將該混合物制成可以給藥的形式(溶液，懸浮液或乳液)而制備。
所述藥用可接受載體，賦形劑或穩定劑在它們的劑量和濃度下，應當是對受體無毒的，并且與所述藥物組合物中的其他成分相容。例如，所述藥物組合物不應當包含已知對所述多肽有害的氧化劑或其他材料。
合適的載體包括磷酸，檸檬酸以及其他緩沖液，如有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸，低分子量多肽，血清白蛋白，明膠和蛋白，如免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其他多糖，如葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合因子，如EDTA；金屬離子，如鋅，鈷或銅；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，如鈉；和/或非離子型表面活性劑，如Tween，pluronic或聚乙二醇(PEG)。
在用于治療目的時，所述糖基化的人G-CSF同種型應當是無菌的。無菌化可以通過無菌過濾膜過濾而方便地實現。
所述糖基化的人G-CSF同種型的藥物組合物通常應當儲存在具有無菌入口的容器中，例如，用于靜脈注射的袋或小瓶，它具有皮下注射用的針頭能夠穿透的篩子。含水的或冷凍干燥的本發明的藥物組合物可以保存在單一劑量或多劑量容器中，如密封的小瓶或安培瓶。為了獲得冷凍干燥形式，將5ml過濾的1％(w/v)人G-CSF同種型溶液放入10-ml的小瓶中，然后冷凍干燥。可以通過使用注射用抑菌性水溶解(重建)所述冷凍干燥的人G-CSF同種型而制備可注射的溶液。
包括腸胃外給藥在內，所述糖基化的人G-CSF同種型可以通過合適的技術直接對動物給藥，并且可以局部或系統地進行給藥。例如，可以根據認識到或預計會出現人G-CSF的副作用的患者的醫學病史確定特定的給藥途徑。腸胃外給藥包括皮下，肌內，靜脈內，動脈內和腹膜內注射。最優選的是，給藥可以通過連續注射(例如微型泵，如滲透壓泵)或使用注射器通過靜脈內或皮下途徑實現。
本發明的糖基化人G-CSF同種型應當以“治療有效的”劑量對患者給藥，即相對于給藥所針對的癥狀而言足以獲得理想的治療效果的劑量。所述糖基化的人G-CSF同種型的藥物組合物應當與優選的醫學操作一致地制備和給藥，并要考慮要治療的具體狀態，患者個體的臨床狀況(特別是在僅給予人G-CSF時出現的副作用)，所述糖基化的人G-CSF同種型的投遞位置，給藥方法，給藥方案，以及本領域技術人員所公知的其他要求。可以通過考慮上述因素，確定所述糖基化的人G-CSF同種型的治療有效劑量。本發明的人G-CSF同種型的每日使用劑量通常為大約1μg-100mg，優選0.01mg-1mg。
將結合附圖通過以下實施例對本發明進行更詳細的說明。不過，提供以下實施例僅僅是為了說明本發明，本發明并不局限于這些實施例。
實施例1人G-CSF基因的制備從攜帶能夠在動物細胞中表達的人G-CSF基因的細菌菌株中獲得人G-CSF基因，該基因業已保存在我們的實驗室中。在圖1中示出了人G-CSF的核苷酸序列和氨基酸序列。
實施例2選擇人G-CSF中待修飾的位置使用Boone’s結構分析結果(J.Biol.Chem.，vol.5，8770，(1992))，在人G-CSF上選擇要進行額外糖基化的位點。首先，排除了在人G-CSF的氨基酸序列上具有螺旋結構的區域(圖1)。然后，考慮Thr-133作為O-連接的糖基化位點在人G-CSF的三級結構中的空間位置，選擇容易修飾成N-連接的糖基化基序的區域。
實施例3人G-CSF同種型的制備通過用合成的寡聚脫氧核苷酸作引物進行PCR，制備了具有一個或多個氨基酸修飾、并因此攜帶額外的糖基化位點的編碼修飾過的人G-CSF蛋白的基因。在下面的表1中列舉了所使用的合成寡聚脫氧核苷酸。
如圖2所示，為了將額外的糖基化位點導入人G-CSF，選擇出了G51，G94，T133和G135。用天冬酰胺分別修飾第51位甘氨酸和第94位甘氨酸殘基。用天冬酰胺和絲氨酸分別修飾133號蘇氨酸和135號甘氨酸殘基。在圖2中標出了用于所述修飾的合成的寡聚脫氧核苷酸。箭頭方向表示每一種寡聚脫氧核苷酸的5′→3′方向。
為了促進表達的人G-CSF蛋白的純化，將額外的氨基酸序列(HisEK)插在成熟的人G-CSF的前序列和N-末端之間。插入的氨基酸序列為M-G-G-S-H-H-H-H-H-H-G-D-D-D-D-K。該插入使得能夠通過金屬親和層析分離表達的人G-CSF同種型。用腸激酶處理通過金屬親和層析獲得的分離的蛋白，并且再次進行金屬親和層析，由此得到了高純度的人G-CSF同種型蛋白。
按以下方法將HisEK序列導入人G-CSF。使用引物對CSF5和CSF1通過PCR擴增所述前序列，用限制酶NcoI消化。首先使用引物對HisEK2和CSF3通過PCR擴增成熟的人G-CSF的編碼序列，然后用HisEK1和CSF3引物對擴增產物進行二次擴增。用NcoI消化得到的PCR產物，并且用T4 DNA連接酶連接到經NcoI-消化過的前序列上。然后，將連接產物用作模板，用CSF5和CSF3引物進行PCR。用HindIII和BamHI消化擴增的DNA產物，并且使用T4 DNA連接酶插入用相同的限制酶消化過的pcDNA3.1-Hygro(+)載體上，由此產生了表達載體。
表1用作生產額外糖基化位點的引物的合成寡聚脫氧核苷酸

(1)制備具有G51N修飾的人G-CSF同種型(圖3)使用引物對CSF5和G51N2以及另一引物對G51N1和CSF3，通過PCR擴增在實施例1中制備的人G-CSF基因。純化所得到的片段，并且用0.2M NaOH/2mM EDTA變性。將變性的DNA片段作模板，用引物對CSF5和CSF3進行PCR，以便生產突變的人G-CSF基因，它具有以下修飾51號甘氨酸殘基被修飾成天冬酰胺。如圖3所示，結果獲得了兩種DNA片段，所述片段攜帶有相當于將51號氨基酸位置處的甘氨酸修飾成天冬酰胺的密碼子。在將這兩種DNA片段添加到PCR反應混合物中之后，用引物對CSF5和CSF3進行二次PCR，生產出了修飾過的G-CSF-G51N基因，它的51號氨基酸位置被修飾成天冬酰胺，它可以進行額外的糖基化。
(2)制備具有G94N修飾的人G-CSF同種型(圖4)使用引物對CSF5和G94N2和另一引物對G94N1和CSF3，通過PCR擴增在實施例1中制備的人G-CSF基因。純化得到的DNA片段，并且用0.2M NaOH/2mM EDTA變性。用變性的DNA片段作模板，用引物對CSF5和CSF3進行PCR，以便生產突變的人G-CSF基因，它具有以下修飾94號甘氨酸殘基被修飾成天冬酰胺。如圖4所示，結果獲得了具有對應于將94號氨基酸位置處的甘氨酸修飾成天冬酰胺的密碼子的兩種DNA片段。將這兩種DNA片段添加到PCR反應混合物中，用引物對CSF5和CSF3進行二次PCR，得到了94號氨基酸殘基被修飾成天冬酰胺的修飾過的G-CSF-G94N基因，它可以進行額外的糖基化。
(3)制備具有G51N和G94N修飾的人G-CSF同種型(圖5)使用修飾過的G-CSF-G94N基因，按照與制備修飾過的G-CSF-G51N基因相同的方法，制備具有G51N和G94N修飾的人G-CSF同種型。如圖5所示，首先按照與圖4所示相同的方法修飾94號氨基酸殘基。然后，用所得到的DNA片段作模板，按照圖3所示相同的方法修飾51號氨基酸殘基。結果產生了具有G51N和G94N修飾的修飾過的人G-CSF基因。
(4)制備具有T133N和G135S修飾的人G-CSF同種型(圖6)按照與制備修飾過的G-CSF-G51N基因相同的方法，使用引物對CSF5和T133NG135S2和另一引物對T133NG135S1和CSF3通過PCR擴增人G-CSF基因。
純化所得到的DNA片段，并且用0.2M NaOH/2mM EDTA變性。用變性的DNA片段作模板，用引物對CSF5和CSF3進行PCR，以便生產具有133號蘇氨酸殘基和135號甘氨酸殘基分別被天冬酰胺和絲氨酸修飾的修飾過的人G-CSF基因，其中O-連接的糖基化位點被改變成N-連接的糖基化位點。結果生產出了修飾過的G-CSF-T133NG135S基因。
(5)制備具有G51N，T133N和G135S中所有修飾的人G-CSF同種型(圖7)使用修飾過的G-CSF-T133NG135S基因，按照與制備修飾過的G-CSF-G51N基因相同的方法，制備具有G51N，T133N和G135S中所有修飾的修飾過的人G-CSF基因。
實施例4在CHO細胞中表達人G-CSF同種型在60-mm培養皿中培養CHO細胞(DG44)，并且生長到40-80％的鋪滿度，就是說，達到1-4×105個細胞的密度。將3μl由BM公司生產的Superfectin試劑與97μl的培養基(α-MEM，無血清和抗生素)充分混合，然后將制備的用于表達人G-CSF同種型的表達載體DNA(＞0.1μg/μl，大約2μg)和含有小鼠DHFR基因的pLTRdhfr26載體(ATCC37295，0.2μg)添加到該混合物中。在室溫下培養5-10分鐘，將該反應混合物添加到制備的細胞中。一天之后，用含有透析過的10％FBS、并且含有200μg/ml潮霉素的α-MEM培養所述細胞，并且繼續培養大約7-10天時間。從含有潮霉素(200μg/ml)的培養基中篩選被人G-CSF同種型穩定轉染了的細胞。培養每一種選擇的細胞系，并且使用Quantikine人G-CSF免疫測定試劑盒(Catalog No.DCS50，R&D systems)評估人G-CSF同種型的表達。結果發現在所述細胞系中產生了人G-CSF同種型。
實施例5純化表達的人G-CSF同種型按以下方法純化在CHO細胞中表達的人G-CSF同種型。用Millipore’s Centriprep(Mw Cut 10,000)濃縮培養上清液。使用Invitrogen’s ProBond Purification System，通過金屬親和層析從所述濃縮物中純化表達的人G-CSF同種型，并且通過Western印跡分析，結果如圖8所示。
例6在大鼠中進行的藥物動力學測定為了研究人G-CSF同種型在體內是否具有長的半衰期，在Sprague-Dawley大鼠對象中進行了藥物動力學測定。以100μg/kg體重的劑量通過靜脈內途徑施用人G-CSF同種型，其中，每一組包括四只大鼠。以3 0分鐘為間隔進行放血，并且用Quantikine人G-CSF免疫測定試劑盒(R&D systems)測定人G-CSF同種型的血液水平。結果如圖9所示。正如圖9所示的，發現與天然G-CSF相比，某些人G-CSF同種型具有改善了的體內穩定性。
工業實用性正如本文前面所披露的，本發明的糖基化的人G-CSF同種型具有改進了的體內穩定性。因此，與常規使用的人G-CSF同種型相比，所述人G-CSF同種型能夠以較小的劑量和較少的次數在臨床上使用。
序列表<110>CJ Corporation<120>糖基化的人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)同種型<150>KR 10-<151>2002-08-31<160>12<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物
<400>12tgggatcctc agggctgggc aaggtggcgt ag 3權利要求
1.一種具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型，其中所述氨基酸序列在下面的一個或多個氨基酸位置處包含糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)；-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L9 9)；和-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
2.如權利要求1的人G-CSF同種型，其中所述人G-CSF同種型分別具有以下修飾第51位甘氨酸殘基被修飾成天冬酰胺，第94位甘氨酸殘基被修飾成天冬酰胺，或第133位蘇氨酸和第135位甘氨酸殘基分別被修飾成天冬酰胺和絲氨酸，或具有所有這些修飾。
3.一種編碼具有修飾過的氨基酸序列的人G-CSF同種型的基因，其中所述氨基酸序列在下面的一個或多個氨基酸位置處包括糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-T1-P10(T1-P-L-G-P-A-S-S-L-P10)；-Y39-L71(Y39-K-L-C-H-P-E-E-L-V-L-L-G-H-S-L-G-I-P-W-A-P-L-S-S-C-P-S-Q-A-L-Q-L71)；-L92-L99(L92-E-G-I-S-P-E-L99)；和-G125-S142(G125-M-A-P-A-L-Q-P-T-Q-G-A-M-P-A-F-A-S142)。
4.如權利要求1的基因，其中所述人G-CSF同種型具有以下修飾第51位甘氨酸殘基被修飾成天冬酰胺，第94位甘氨酸殘基被修飾成天冬酰胺，或第133位蘇氨酸和第135位甘氨酸殘基分別被修飾成天冬酰胺和絲氨酸，或具有所有上述修飾。
5.一種制備糖基化的人G-CSF同種型的方法，包括以下步驟培養被攜帶權利要求3或4的編碼人G-CSF同種型的基因的表達載體轉化或轉染了的真核宿主細胞；和從所述培養上清液或細胞裂解物中分離所述糖基化的人G-CSF同種型。
6.一種藥物組合物，其中包含通過對權利要求1或2的人G-CSF同種型進行額外糖基化而制備的糖基化的人G-CSF同種型，和藥用可接受載體。
全文摘要
本發明公開了具有修飾過的氨基酸序列的人G－CSF同種型，它在一個或多個特定氨基酸位置處包括糖基化序列Asn－X－Ser/Thr(N－X－S/T)，編碼所述人G－CSF同種型的基因，以及攜帶所述基因的表達載體，用所述表達載體轉化或轉染過的真核細胞。另外，本發明披露了制備糖基化的人G－CSF同種型的方法，包括以下步驟培養轉化體或轉染體，并且從培養上清液或細胞裂解物中分離糖基化的人G－CSF同種型；通過所述方法制備的人G－CSF同種型；以及包括所述人G－CSF同種型的藥物組合物。
文檔編號A61K38/00GK1684978SQ03823265
公開日2005年10月19日 申請日期2003年8月29日 優先權日2002年8月31日
發明者李垠姃, 金賢碩, 鄭宗相, 金起完, 金演嚮, 李賢秀, 高亨坤, 吳明錫 申請人:希杰株式會社