一種重組人粒細胞集落刺激因子工程菌的發酵方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種工程菌的發酵方法，具體涉及一種重組人粒細胞集落刺激因子工程菌的發酵方法。
【背景技術】
[0002]人粒細胞集落刺激因子(humangranulocyte colony stimulating factor,hG-CSF)屬于造血生長因子家族。內毒素、TNF-a和IFN-γ可活化單核細胞和巨噬細胞產生G-CSF。此外，成纖維細胞、內皮細胞、星狀細胞和骨髓基質細胞等在LPS、IL-1或TNF-a刺激活化后也可分泌G-CSF。某些白血病細胞以及CHu-2人口腔癌細胞、5637人膀胱癌細胞、MIAPa Ca-2胰腺癌細胞可組成性地表達G-CSF。
[0003]1986年G-CSF cDNA克隆成功，C-CSF基因全長2.5kb，包括5個外顯子和4個內含子。人類有兩種不同的G-CSF cDNA，分別編碼含207和204氨基酸的前體蛋白，均有30個氨基酸的先導序列，成熟蛋白分子分別為177和174個氨基酸，前者除了在成熟分子N端35位處插入了 3個氨基酸外，其余的序列與174氨基酸分子相同，人G-CSF分子量為19.6kDa，PI 6.1,0-糖基化，對酸堿(pH2?10)、熱以及變性劑等相對較穩定。G-CSF有5個半胱氨酸，Cys 36與Cys42，Cys74與Cys64之間形成兩對二硫健，Cysl7為不配對半胱氨酸，二硫鍵對于維持G-CSF生物學功能是必須的因素。
[0004]人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)是一種在哺乳動物中調節粒細胞(尤其是中性粒細胞)成熟與生長的造血生長因子。它通過刺激粒細胞巨噬細胞集落形成單位(CFU-GM)向粒細胞集落形成單位(CFU-G)的分化和成熟，動員成熟中性粒細胞向外周血的釋放，從而促進中性粒細胞的生長。在臨床上用來治療各種原因引起的中性粒細胞減少癥，有很大的經濟意義和社會意義。
[0005]hG-CSF的天然來源有限，產量甚微，還不能滿足臨床應用的需要。利用基因工程技術生產是獲取大量hG-CSF的一條途徑。天然hG-CSF雖是一種糖蛋白，但文獻報導，未經糖基化和利用大腸桿菌表達的重組hG-CSF具有與天然hG-CSF同樣的生物活性。
[0006]大腸桿菌因容易培養、遺傳背景清晰、生長周期短，并能實現目的基因的高效表達，目前已成為應用最廣泛的異源蛋白的原核表達系統。重組大腸桿菌細胞高密度培養是獲得高外源蛋白產率的一種重要策略，能夠在單位時間、單位體積的條件下獲得更高的外源蛋白產率。在重組大腸桿菌的高密度培養過程中，由于大多采用的是胞內包涵體表達形式，重組異源蛋白產物的宏觀合成產量取決于最高的外源基因表達水平以及菌體密度。從理論上說，在維持外源基因表達水平不變的前提下，提高工程菌的發酵密度可以大幅度提高產量，降低成本。
[0007]重組大腸桿菌的高密度發酵技術在生產實踐中得到了廣泛應用，并且取得了令人驚喜的成果。但是在該技術實際應用中還存在許多需要解決的問題。其中最為嚴重的就是培養過程中菌體過早地衰老、自溶和外源基因不能充分表達、比活性較低，這主要是細菌產生的有害的代謝廢物對重組菌的抑制作用。乙酸是大腸桿菌的主要副產物，它對細菌生長和產物的表達都有抑制作用。
[0008]大腸桿菌在過量葡萄糖或缺氧的條件下會發生“葡萄糖效應”，積累大量有機酸而影響重組菌的生長和外源蛋白的有效表達。因此在大腸桿菌高密度發酵中，合理流加碳源使葡萄糖效應降低，是成功的關鍵。
[0009]因此，對于重組人粒細胞集落刺激因子工程菌的發酵方法存在進一步的改進和優化需求，這也是該技術領域內的研究熱點和重點之一，更是本發明得以完成的動力和出發點所在。

【發明內容】

[0010]針對重組人粒細胞集落刺激因子重組工程菌在發酵過程中存在表達量低、最終菌體密度低等問題，本發明人在進行了大量的深入研究之后，提供了一種能夠工業化生產的重組人粒細胞集落刺激因子的發酵方法，本發明能夠顯著提高最終菌體密度和外源蛋白表達量，且設備要求簡單。
[0011]本發明通過以下技術方案實現，一種重組人粒細胞集落刺激因子工程菌(PBVQG8/MM294)的發酵方法，包括如下步驟:
[0012]步驟一，從液氮罐中取出pBVQG8/MM294工程菌種子進行復蘇；
[0013]步驟二，將復蘇的種子接種到含LB培養基的搖瓶中進行一次擴增；
[0014]步驟三，以體積比2%的接種量，接入數個含LB培養基的搖瓶中，進行二次擴增，待搖瓶中的菌液內0D6。。值超過1，作為種子液接種入發酵罐，質量體積比50%的葡萄糖溶液與發酵罐控制pH的酸栗連接，氨水與發酵罐控制pH的堿栗連接；
[0015]步驟四，種子液接種入所述發酵罐后，設定溫度控制為28 °C，溶氧控制20%，pH控制為7.2，開始發酵；隨著發酵的進行，工程菌利用葡萄糖進行生長，并產酸，發酵罐自動補入氨水中和；隨著葡萄糖的利用，罐內葡萄糖濃度趨于0，此時工程菌只能利用氮源進行生長，并且產堿，罐內pH值會緩慢上升，發酵罐自動開啟酸栗，補入葡萄糖；工程菌再次利用葡萄糖生長，并產酸，降低罐內的pH值；如此重復循環，工程菌在罐內不斷生長，實現高密度，同時避免罐內存在過量葡萄糖發生“葡萄糖效應”而積累大量有機酸影響重組菌的生長和外源蛋白的有效表達；
[0016]步驟五，當發酵罐內0D6。。值達到70?80之間時，提高發酵罐的控制溫度至42 °C，使工程菌開始表達外源重組蛋白rhG-CSF，表達時間維持4-6小時，獲得發酵液。
[0017]優選的，步驟三中，發酵罐中的培養基為蛋白胨12g/L、酵母膏24g/L、甘油4ml/L、KH2P04 2.31g/L、K2HP04 1 2.54g/L、葡萄糖 2g/L、MgS04 0.2g/L、微量元素 3ml/L。
[0018]優選的，在步驟五之后，還包括以下步驟:將獲得的發酵液進行離心收集菌體；菌體放入-20°C進行凍融；凍融后的菌體放入裂解液中混勻，進行超聲破碎；破碎后的混懸液進行離心收集包涵體。
[0019]與現有技術相比，本發明的有益效果如下:本發明提供的發酵方法采用pH反饋補料的方法來進行重組人粒細胞集落刺激因子工程菌(PBVQG8/MM294)的高密度發酵。通過pH值的變化，推測細菌的生長狀態，調節流加葡萄糖速度，調節pH為恒定值，簡化了補料的操作方式，rhG-CSF的表達量大約等于35%，最終菌體濕重超過了 100克/L ;而且本發明的發酵工藝制備的包涵體經復性和精純制備成rhG-CSF原液，原液電泳純度達到99%以上，RP-HPLC的純度達到98%以上，比活性6.6X 107IU/mg，因此，可用于制備重組人粒細胞集落刺激因子。
【具體實施方式】
[0020]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。
[0021]實施例1:菌種復蘇與種子液制備
[0022]從液氮罐中取出含有pBVQG8/MM294菌種的凍存管一支，迅速放入28°C水浴中，不停攪拌，使其溶解；
[0023]在潔凈超凈臺或者生物安全柜中，打開凍存管，以無菌操作的方式，將凍存管中的菌種移入含100ml LB培養基的1L搖瓶中，將搖瓶放入搖床內，28°C，180rmp下培養7?8小時；
[0024]以體積比2%的接種量，接中10個含300ml LB培養基的1L搖瓶中，將搖瓶放入搖床內，28°C，180rmp下培養過夜。
[0025]實施例2:pBVQG8/MM294工程菌的發酵
[0026]50L發酵罐內加入培養基，發酵罐中的培養基為蛋白胨12g/L、酵母膏24g/L、甘油4ml/L、KH2P04 2.31g/L、Κ2ΗΡ04 1 2.54g/L、葡萄糖 2g/L、MgS04 0.2g/L、微量元素 3ml/L，按照發酵罐說明書進行原位滅菌；
[0027]將種子液接入50L發酵罐，溫度控制28°C，pH7.2，溶氧質量比20 %，起始攪拌轉速為lOOrpm，通氣量10L/min ;酸栗連接質量體積比50%的葡萄糖，堿栗連接氨水；開始發酵，發酵過程中檢測發酵液的0D_值，0D600值到達70，升溫至42°C，進行rhG-CSF蛋白的表達，外源蛋白表達維持6小時，對發酵液進行外源蛋白表達量測定，外源蛋白表達量為36.4% ο
[0028]實施例3:rhG-CSF工程菌收集與包涵體獲得
[0029]rhG-CSF經高密度發酵后，離心收集濕菌體，離心轉速為8000rpm ;收集后的菌體重量5125克；再放置于_20°C，凍融一次；取400克凍融后的菌體，按體積比1:10比例混懸于裂解液中(20mmol/L Tris-HCl EDTA lmmol/L DTT 1.5g/L，pH 8.0)，混合成均一的懸液后，使用大功率超聲波細胞破碎儀對混懸液進行破菌及勻漿處理；10000g離心收集包涵體60克。
[0030]以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發明的實質內容。
【主權項】
1.一種重組人粒細胞集落刺激因子工程菌(PBVQG8/MM294)的發酵方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，從液氮罐中取出PBVQG8/MM294工程菌種子進行復蘇； 步驟二，將復蘇的種子接種到含LB培養基的搖瓶中進行一次擴增； 步驟三，以體積比2%的接種量，接入數個含LB培養基的搖瓶中，進行二次擴增，待搖瓶中的菌液內0D6。。值超過1，作為種子液接種入發酵罐，質量體積比50%的葡萄糖溶液與發酵罐控制pH的酸栗連接，氨水與發酵罐控制pH的堿栗連接； 步驟四，種子液接種入所述發酵罐后，設定溫度控制為28°C，溶氧控制20%，pH控制為7.2，開始發酵；隨著發酵的進行，工程菌利用葡萄糖進行生長，并產酸，發酵罐自動補入氨水中和；隨著葡萄糖的利用，罐內葡萄糖濃度趨于0，此時工程菌只能利用氮源進行生長，并且產堿，罐內pH值會緩慢上升，發酵罐自動開啟酸栗，補入葡萄糖；工程菌再次利用葡萄糖生長，并產酸，降低罐內的pH值；如此重復循環，工程菌在罐內不斷生長，實現高密度，同時避免罐內存在過量葡萄糖發生“葡萄糖效應”而積累大量有機酸影響重組菌的生長和外源蛋白的有效表達； 步驟五，當發酵罐內OD_值達到70?80之間時，提高發酵罐的控制溫度至42°C，使工程菌開始表達外源重組蛋白rhG-CSF，表達時間維持4-6小時，獲得發酵液。2.如權利要求1所述的發酵方法，其特征在于，步驟三中，發酵罐中的培養基為蛋白胨12g/L、酵母膏 24g/L、甘油 4ml/L、KH2P042.31g/L、K2HP0412.54g/L、葡萄糖 2g/L、MgS040.2g/L、微量元素3ml/L。3.如權利要求1所述的發酵方法，其特征在于，在步驟五之后，還包括以下步驟:將獲得的發酵液進行離心收集菌體；菌體放入_20°C進行凍融；凍融后的菌體放入裂解液中混勻，進行超聲破碎；破碎后的混懸液進行離心收集包涵體。
【專利摘要】本發明涉及一種重組人粒細胞集落刺激因子工程菌的發酵方法，包括如下步驟：菌種復蘇；種子液制備；分批補料高密度發酵。本發明提供的發酵方法具有發酵工藝簡單、最終菌體密度高、外源蛋白表達高和穩定性好的優點，可用于制備重組人粒細胞集落刺激因子。
【IPC分類】C12R1/19, C12P21/02
【公開號】CN105316379
【申請號】CN201510474655
【發明人】傅暉, 岑仡, 鄭劍, 李文利, 于紅君, 薛亮, 匡瑾瑾
【申請人】上海三維生物技術有限公司
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年8月5日