一種重組人粒細胞刺激因子多肽的純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種重組人粒細胞刺激因子多肽的純化方 法。
【背景技術】
[0002] 粒細胞刺激因子（Granulocyte Colony-Stimulating Factor，G-CSF)具有促進粒 系造血干細胞增殖分化及增強成熟細胞功能的作用。它能夠在骨髓移植中促進中性白細胞 的增殖，并對癌癥化療時引起的嚴重的中性粒細胞缺乏癥，以及再生障礙性貧血伴隨的中 性粒白細胞缺之癥有明顯的療效。
[0003] John F. Reidhaar-Olson 研究發現 G-CSF 的 Leul5, Glul9, Gln25, Leu31，Lys34， Lys40，Leu47，Val48，Leu49，Leu54對蛋白活性起重要作用。二硫鍵對于蛋白受體二聚化，激 活下游信號傳導有重要作用，發明人構建的G-CSF多肽（15-75)覆蓋G-CSF活性重要的氨 基酸序列，含有完整的二硫鍵，利于保持其活性。但現有技術的純化方法應用于所述G-CSF 多肽（15-75)，純度較低。

【發明內容】

[0004] 本發明提供一種重組粒細胞刺激因子G-CSF(15_75)多肽的純化方法，該方法包 括以下步驟：
[0005] 1)選用pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115工程菌做菌株進行發酵培養；
[0006] 2)發酵培養液12000rpm，離心10min，上清液過0? 45 y m濾膜；
[0007] 3)對過濾上清進行疏水層析純化處理，得到疏水層析產物；
[0008] 4)對疏水層析產物陰離子交換，得到陰離子交換液；
[0009] 5)對陰離子交換液進行凝膠過濾，得到重組人粒細胞刺激因子多肽。
[0010] 所述步驟1)的工程菌為保藏號為CGMCC N0:10713的巴斯德畢赤酵母菌，保藏單 位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽區北 辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期：2015年4月13日，分類命名：巴斯 德畢赤酵母Pichia pastoris。
[0011] 所述步驟3)的疏水層析其柱填料為phenyl sepharose 6 fast flow (high sub)， 具體實施步驟為：
[0012] 樣品預處理：接收步驟2)所得過濾后的發酵上清液，用乙酸調pH至5. 0,加固體 NaCl或者硫酸銨調節cd至50ms/cm。
[0013] 平衡：設置檢測波長280nm，用平衡緩沖液平衡5-10倍柱體積，平衡時栗流速為 20. 0ml/min，待UV值穩定后，紫外校零；
[0014] 上樣：上樣時栗流速為8. 0-18. 5ml/min，上樣結束后用平衡緩沖液復平衡5個柱 床體積；
[0015] 洗脫：上樣完畢后，用洗脫緩沖液洗脫，調節栗流速為5. 5-10. 2ml/min，根據UV值 的變化收集主峰。
[0016] 步驟3)所述的平衡緩沖液為10mmol/L HAc-NaAc，pH 5. 0,加固體NaCl調節cd 50ms/cm ;所述的洗脫緩沖液為 10mmol/L Tris-HCl，pH 8. 5。
[0017] 所述步驟4)的陰離子交換其柱填料為聚苯乙烯-二乙烯基苯，具體實施步驟為：
[0018] 樣品預處理：接收步驟3)所得疏水層析后蛋白溶液，用氫氧化鈉調pH至8. 5,加 水稀釋至cd為l_4ms/cm。
[0019] 平衡：設置檢測波長280nm，用平衡緩沖液平衡5-10倍柱體積，平衡時栗流速為 20.0 ml/min，待UV值穩定后，紫外校零；
[0020] 上樣：將疏水層析峰直接上樣，上樣時栗流速為8. 5-19. 8ml/min，上樣結束后用 平衡緩沖液復平衡5個柱床體積；
[0021] 洗脫：上樣完畢后，用洗脫緩沖液洗脫，調節栗流速為5. 5-10. 2ml/min，根據UV值 的變化收集目的峰。
[0022] 所述步驟4)的平衡緩沖液為10mmol/L Tris-HCl，pH 8. 5 ;所述的洗脫緩沖液為 100mmol/L HAc-NaAc，pH5. 0。
[0023] 所述步驟5)的凝膠過濾其柱填料為Sephacryl S-100HR，具體操作步驟為：
[0024] 平衡：設置檢測波長280nm，用HAc-NaAc緩沖液平衡5-10個柱體積，平衡時栗流 速為0. 3-1. 17ml/min，待UV值穩定后，紫外校零；
[0025] 上樣：將陰離子交換純化后目的蛋白直接上樣。上樣時栗流速為0.3-1. 17ml/ min，樣品上樣量為柱體積的0. 5% -4%。；
[0026] 洗脫：上樣完畢后，用HAc-NaAc緩沖液洗脫，調節栗流速為0. 3-1. 17ml/min，根據 UV值的變化收集目的蛋白溶液。
[0027]所述步驟 5)的HAc-NaAc緩沖液為10mmol/L HAc-NaAc，pH5.0。
[0028] 本發明取得的有益效果：
[0029](1)本發明的純化方法主要用于G-CSF(15-75)多肽的純化。
[0030] (2)采用了層析柱純化處理，操作簡單，且優選的填料和流速等參數提高了生產效 率，大大降低生產成本，最后所得的G-CSF (15-75)多肽純度達到99. 8%以上，比活性達到 了 7.3X107IU/mg〇
【具體實施方式】
[0031] 以下結合具體實施例對本發明做進一步的詳述，但具體實施例并不對本發明做 任何限制。選用pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115作為工程菌進行發酵培養，收集發酵上清， 12000rpm，離心10min，上清液過0? 45 y m濾膜后進行純化。
[0032] 實施例1:
[0033]疏水柱層析CKK50/20層析柱，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)填料） 具體實施步驟為：
[0034] 樣品預處理：過濾后的發酵上清液，用乙酸調pH至5. 0,加固體Nacl調節cd50ms/ cm；
[0035]平衡：設置檢測波長280nm，使用平衡緩沖液（10mmol/L HAc-NaAc緩沖液，pH5. 0， 加固體Nacl調節cd 50ms/cm)，調節栗流速為20.0 ml/min,平衡8倍柱床體積，待UV值穩 定后，紫外校零；
[0036] 上樣：以15ml/min流速上樣，上樣結束后，用平衡緩沖液（10mmol/L HAc-NaAc緩 沖液，pH5. 0,加固體Nacl調節cd 50ms/cm)平衡5倍柱床體積；
[0037] 洗脫：使用洗脫液（10mm〇l/L Tris-HCl緩沖液，pH 8. 5)洗脫，調節栗流速為 10ml/min，開始洗脫，根據UV值的變化收集目的蛋白溶液。
[0038] 陰離子柱層析（XK50/30層析柱，聚苯乙烯-二乙烯苯（SKI-10)填料）具體實施 步驟為：
[0039] 樣品預處理：所得疏水層析后蛋白溶液，用氫氧化鈉調pH至8.5,加水稀釋至cd 為3ms/cm〇
[0040] 平衡：設置檢測波長280nm，用平衡緩沖液（10mmol/L Tris-HCl，pH 8. 5)平衡8 倍柱體積，平衡時栗流速為20. 0ml/min，待UV值穩定后，紫外校零；
[0041] 上樣：將疏水層析峰直接上樣，上樣時栗流速為l〇ml/min，上樣結束后用平衡緩 沖液（10mm〇l/L Tris-HCl，pH 8. 5)復平衡5個柱床體積；
[0042]洗脫：上樣完畢后，用洗脫緩沖液洗脫（100mm〇l/L HAc-NaAc，pH5. 0)，調節栗流速 為8ml/min，根據UV值的變化收集目的峰。
[0043] 凝膠過濾層析（HR16/70層析柱Sephacryl S-100HR填料）具體實施步驟為：
[0044]平衡：設置檢測波長 280nm，用 HAc-NaAc 緩沖液（10mmol/L HAc-NaAc，pH 5. 0)平 衡5-10個柱體積，平衡時栗流速為1.0ml/min，待UV值穩定后，紫外校零；
[0045] 上樣：將陰離子交換純化后目的蛋白直接上樣，上樣時栗流速為1.0ml/min，樣品 上樣量為柱體積的2% ;
[0046] 洗脫：上樣完畢后，用HAc-NaAc液洗脫（10mmol/L HAc-NaAc，pH 5. 0)，調節栗流 速為1.0ml/min，根據UV值的變化收集目的蛋白溶液。
[0047] 實施例2 :
[0048]疏水柱層析CKK5