專利名稱：：一種聚乙二醇修飾的重組人精氨酸酶Ⅰ其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物醫藥領域，涉及重組蛋白的化學修飾技木。發明背景精氨酸酶(Arginase)是尿素循環中的ー種酶，催化精氨酸水解產生鳥氨酸和尿素，在機體氮代謝方面起重要作用。人體內精氨酸酶有兩種(I型稱肝精氨酸酶，II型稱肝外精氨酸酶)，I型精氨酸酶基因的表達受底物精氨酸和輔酶Mn2+的誘導(Brock，A.Aetal，Dietarymanganesedeiiciencydecreasesrathepaticarginaseactivity.J.Nutr.1994,124:340-344)，存在于肝外的II型精氨酸酶有著廣泛的組織分布，在不同組織和器官中發揮不同的作用，包括參與多胺代謝、NO合成等(Russel，D.H，etal,Polyammebiogenesisintheratmammaryglandduringpregnancyandlactation.Bilchem.1972,130:71-76)，與I型精氨酸酶相比，其活力較低。精氨酸酶通過分解精氨酸對腫瘤細胞進行營養剝奪，對正常組織影響較小，成為抗腫瘤治療的又一選擇。目前傳統的放化療方法已很難滿足患者對生命質量的要求，而氨基酸剝奪的方法給癌癥治療注入新的活力。它雖然會引起生理和代謝方面的某些不平衡，但不像傳統的放化療等方式向體內引入有毒物質，使原本就不堪ー擊的病體雪上加霜。最早發現精氨酸酶有抑制腫瘤作用的是Bach和Lansitksi,他們用提純的牛肝精氨酸酶處理大鼠Walker256肉瘤四天，發現腫瘤生長減慢了31%-71%(Bachbj,LasnitzkiI.borneaspectsoftheroleofarginineandarginaseinmousecarcinoma.Enzymologia.1947,12:198-205)。精氛酸酶體外抗腫瘤活性自1960年已有報道(BachSJ,HawkinsRA,SwaineD.Asnortmethodforthepurificationofarginasefromoxliver.BiochemJ1963;89:263-5),Curtie等報道精氨酸酶自脂多糖與酵母多糖刺激后的巨噬細胞釋放，可引起中國大鼠肺細胞V79、淋巴瘤細胞L5178Y、HSN大鼠肉瘤細胞的凋亡。Storr和Burto報道用鼠和牛肝臟來源的精氨酸酶處理，當精氨酸水平降至低于8umol/L并持續24小時的情況下淋巴肉瘤細胞的生長受到抑制。Scott和Wheatley等對精氨酸耗竭的體外抗腫瘤活性進行了較為系統的研究(Scott等，Singleaminoaacid(,arginine)deprivationrapidandselectivedeathofculturedtransformedandmalignantcells.Br.J.Cancer83,800-810),在測試的24種腫瘤細胞中，所有細胞株在精氨酸酶作用后5天內死亡，受試細胞株包括乳腺癌、直腸結腸癌、肺癌、前列腺癌和卵巢癌等細胞。人肝癌(Humanhepatocellularcarcinoma,HCC)細胞與人黑色素瘤細胞屬于精氨酸營養缺陷型細胞，其精氨基琥拍酸合成酶(argininosuccinatesynthetase,ASS)表達缺陷，可能與ASS基因的啟動子被甲基化因而被抑制、在轉錄水平上下調有關(DillonBJeta_L.incidenceanddistributionofargininosuccinatesynthetasedeiiciencyinhumancancersamethodforidentifyingcancerssensitivetoargininedeprivation.Cancer2004；100:826-33)。精氨酸轉亞氨酶(argininedeiminase，ADI)在治療ASS缺陷型腫瘤方面有明確療效，但許多非ASS缺陷型HCC細胞對ADI有抵抗(ShenLJetal.Resistancetotheanti-proliferativeactivityofrecombinantargininedeiminaseincellculturecorrelateswiththeendogenousenzyme,argininosuccinatesynthetase.CancerLett2003;191:165-70)。國外文獻報道重組人精氨酸酶I(recombinanthumanarginaseI,rhArgI)對非ASS缺陷型HCC細胞具有明確的抑制作用，所有五株HCC細胞均對rhArgI敏感，但ADI對這些細胞無抑制作用，這些細胞均表達ASS,但不表達鳥氨酸轉氨甲酰酶(ornithinetranscarbamylase,OTC),rhArgI降解精氨酸產生鳥氨酸，OTC將鳥氨酸轉化為瓜氨酸，瓜氨酸再經ASS與精氨基琥拍酸裂解酶(argininosuccinatelyase,ASL)轉化成精氨酸,將OTC轉染HCC細胞可使該細胞對rhArg產生抵抗(PaulNing-ManChenget,PegylatedRecombinantHumanArginase(rhArg-peg5,OOOmw)InnibitstheInvitroandInvivoProliferationofHumanHepatocellularCareinomathroughArginineDepletion.CancerRes2007；67(1)309-317)(尿素循環與相關酶作用節點示意圖見說明書附圖I)。在一些細胞中尿素循環是不完全的(機制不清)，代謝產物鳥氨酸不能再進入循環而產生精氨酸(PaulNing-ManChengetal,PegylatedRecombinantHumanArginase、rhArg-peg5,OOOmwノInhibitstheInvitroandInvivoProliferationofHumanHepatocellularCarcinomathroughArginineDepletion.CancerRes2007；67(I)309-317)，因而與精氨酸轉亞胺酶相比，精氨酸酶是降解血循環中精氨酸的更為有力的酶；從臨床治療效果看，將Arg開發成抗腫瘤藥物的價值較ADI更大。重組人精氨酸酶I已成功在大腸桿菌中獲得表達(MasakiIΚΕΜ0Τ0etal,ExpressionofhumanliverarginaseinEschericniacoli.Biochem,J.1990,(270)697-703)，但其短的體內循環半衰期(短于30分鐘)使得在不能進行頻繁大劑量給藥的情況下將其用于腫瘤患者以降低血中精氨酸水平很困難。另ー種牛肝來源的精氨酸酶作為治療人類腫瘤的候選藥物一直不被看好，原因是在生理條件下其與底物精氨酸的親和カ較低，最適PH9.6，半衰期只有幾分鐘。自二十世紀八十年代以來，這些都被認為是牛肝精氨酸酶的嚴重缺陷。Savoca的研究表明牛精氨酸酶對移植Taper肝癌的小鼠無抗腫瘤活性(SavocaKVetal,Cancertherapywithchemicallymoditiedenzymes.II.Thetherapeuticettectivenessofarginase,andarginasemodifiedbytnecovalentattachmentofpolyethyleneglycol,onthetaperlivertumorandtheL5178Ymurineleukemia.CancerBiochemBiophysl984,7:261-268),其他一些研究者也認為牛精氨酸酶無抗腫瘤活性。雖然精氨酸酶的體外抑瘤作用明確，但將其用于體內試圖通過精氨酸耗竭治療癌癥的多項研究并沒有取得預期的效果(Storr等Br.J.Cancer,1974，V30:50-59)，這是因為機體應對氨基酸缺乏時存在體內氨基酸穩態機制(aminoacidhomeostaticmechanism),氨基酸匱乏時通過激活蛋白質分解途徑將精氨酸釋放到血液中參與循環，補充了精氨酸酶代謝造成的精氨酸耗竭。為克服機體的這種穩態機制，實現有治療意義的精氨酸耗竭就需精氨酸降解酶的持續作用，因而要對其進行修飾改性，以達到長效作用。Tepic在美國專利UP6，261，557中描述將精氨酸降解酶與蛋白質分解抑制劑胰島素組合使用，以阻斷通過降解機體肌肉來補充精氨酸這一途徑，但胰島素的應用受到患者血糖水平的限制，如果患者血糖水平不能保持在有限的正常范圍內將導致危險。1979年Savaca等使用2，4，6_三氯-S-三嗪(氰尿酰氯)作為偶聯劑，將牛肝臟來源的精氨酸酶與5KD的單甲氧基聚こニ醇共價連接(Savoca,K.V.等，1979,BiochimiedetBiophysicaActa578，47_53)，將精氨酸酶在小鼠的體內半衰期由不到ー小時延長至12小時，雖然聚こニ醇修飾可以在一定程度上降低蛋白的免疫原性，牛精氨酸酶對人而言畢竟是異源蛋白；而且修飾后的分子只保留了原始酶活的65%，酶活損失較大。香港康達醫藥有限公司的PCT專利(PCT/CN2002/0006352002.9.9)，采用枯草芽孢桿菌表達帶6個組氨酸標簽的人精氨酸酶I，以分子量5KD的mPEG-SPA作為修飾劑，修飾位點是賴氨酸或N末端的氨基，修飾后產物分子的PEG與Arg摩爾比為10-12，是ー種結構混合物，體內半衰期延長至3天。這種修飾方式使Arg分子上連接數量不等的PEG分子,產物構象不均一，產品質量控制困難，制備エ藝過程對批間產物的質量影響較大，エ藝控制困難。另ー種降解精氨酸的酶是精氨酸轉亞胺酶(ADI)，這是ー種源自支原體的酶。其長效分子是美國PhoenixPharmacologies,Inc研制的PEG修飾物，目前已進入II期臨床石開(FrancescoIzzo等PegylatedArginineDeiminaseTreatmentofPatientsWithUnresectableHepatocellularCarcinomaResultsFromPhaseI/IIStudies.JournalofClinicalOncelogy2004(22):10，1815-1822)。研究結果表明其對某些HCC細胞和黑色素瘤細胞具有明確的抑制作用，這些腫瘤細胞依賴外源性精氨酸來維持其生長，其精氨酸營養缺陷型的機理較復雜，根本原因是ASS基因的啟動子被甲基化因而受到抑制。該藥用分子的缺點在于它是ー種支原體酶，雖然進行了PEG修飾但其免疫原性仍是ー個問題。在其II期臨床研究中已有報道自身抗體在前5周即可檢測到，并且在以后其滴度繼續上升，這將導致后續治療的無效；其次ADI將精氨酸轉變為瓜氨酸和游離氨基，在血氨水平高時會形成肝硬化和肝功能失代償，在ー些患者會出現肝性腦病。
發明內容本發明的目的是研制出一種優于上述幾種方案的藥用分子，使其具有體內高比活、延長的半衰期、低免疫原性、結構均一穩定，并且易于進行エ藝與質量的控制；本發明的另一目的是提供該修飾分子在制備人類肝癌和黑色素瘤治療藥物中的應用。本發明的目的通過下列技術實現根據現有技術，可以通過基因重組技術制備人精氨酸酶I(MasakiΙΚΕΜ0Τ0,MasayoshiTABATA,ToshioMIYAKE,etal.ExpressionofhumanliverarginaseinEscherichiacoli.Biochem,J.1990,(270):697-703);而活化的聚こニ醇可以通過多種商業途徑獲得。本發明采用單甲氧基聚こニ醇丙醛作為修飾劑，控制反應條件，實現聚こニ醇分子與重組人精氨酸酶I分子N末端氨基連接，經分離純化后獲得的目標產物結構均一，制備エ藝的批間可控性強，修飾前后比活下降幅度較小，達到增加藥用蛋白穩定性、延長體內半衰期、降低免疫原型、增強體內藥效的目的。本發明采用基因重組技術從人肝臟中獲得人精氨酸酶I的mRNA，再將人精氨酸酶I基因克隆到大腸桿菌表達載體，轉染大腸桿菌，篩選獲得高表達菌株，經發酵、純化后獲得純度大于95%的重組人精氨酸酶I;選擇單甲氧基聚こニ醇丙醛作為修飾劑，控制反應條件，對重組人精氨酸酶I的N末端氨基進行定點修飾，修飾物經凝膠排阻層析和離子交換層析后獲得結構均一的目標分子，體外精氨酸降解法檢測酶活在修飾后下降幅度為20-30%。聚こニ醇修飾是20世紀70年代后期發展起來的蛋白修飾技術。將活化的聚こニ醇上蛋白質分子偶聯，通過影響蛋白質分子空間結構，使蛋白質各種性質發生改變化學穩定性増加、抵抗蛋白酶水解的能力提高、體內藥效更強、免疫原性和毒性降低、血漿清除率降低、體內半衰期延長等。在20種構成蛋白質的常見氨基酸中，只有具有極性的氨基酸殘基的側鏈基團才能夠進行化學修飾。常用的反應氨基酸包括賴氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸，N-端氨基和C-端羧基。這些氨基酸殘基上的反應基團多呈親核性，其親核活性按下列順序依次遞減巰基>α氨基>ε氨基>羧基>羥基。根據化學修飾劑與蛋白質之間反應性質的不同，修飾反應主要分為酰化反應、烷基化反應、氧化還原反應、芳香環取代反應等類型。巰基通常存在于蛋白質的ニ硫鍵和活性位點上，而羧基如果不與蛋白質上的氨基發生分子間或分子內中和反應，很難活化。因此，蛋白質或多肽分子最容易與修飾劑發生反應的位點是暴露于分子表面的氨基酸殘基上的氨基，包括α氨基或ε氣基。蛋白質分子表面的游離氨基具有較高的親核反應活性，一般不處于活性中心部位，因而成為化學修飾中最常用的被修飾基團。主要被修飾的氨基是賴氨酸的ε氨基、α氨基和末端氨基。游離氨基在蛋白質分子中含量較高，聚こニ醇與氨基酸的游離氨基反應時，多為隨機修飾，常有幾個氨基被修飾，導致多態混合物的產生，即使只結合一個聚こニ醇，也可能結合在不同的氨基位點上，產生位點異構體。氨基修飾最常用的修飾劑包括SS-PEG、SC-PEG、SPA-PEG,NHS-PEG和ALD-PEG等。由于蛋白質只有ー個末端氨基，因此對它的修飾可以避免多態混合物和位點異構體的產生。通過還原性烷基化作用生成一種單聚こニ醇產物的衍生化作用利用了賴氨酸上的ε氨基與蛋白分子N末端氨基不同的反應性能，在控制反應pH，有特定還原劑存在的條件下，可實現蛋白分子的定點修飾。本發明選擇的修飾劑其一端被單甲氧基封閉，另一端為活化醛基，分子量范圍5KD-40KD，最優選分子量為20KD。此種活化PEG目前已有市售產品，也可按參考文獻進行制備，經質量檢測各指標達標即可用于修飾。本發明選擇的反應pH條件為4-7，該pH值可以提供賴氨酸殘基上ε氨基與N末端ct氨基間ρΚ值的差異,PEG與Arg的結合作用主要發生在Arg的N末端,其他具有反應活性的集団如賴氨酸側鏈氨基不發生明顯的改性作用。PH值也影響反應體系中蛋白與修飾劑的投料比，如果PH值過低，N末端α氨基的反應活性較差，需要更多的PEG以實現更高的反應率。本發明選擇的反應pH為4-7，優選4.5-6.0。通常反應體系中PEG與蛋白分子的摩爾比越低，可以連接到蛋白分子上的PEG分子數越少，本發明選擇反應時Arg與PEG的摩爾比為I:1-110，優選I:3至I:6。對還原性烷基化作用而言，優選還原劑能夠僅還原在還原性烷基化作用的初期步驟，可用的還原劑包括氫化鈉、氰硼氫化鈉、ニ甲胺甲硼烷、三甲胺甲硼烷、吡啶甲硼烷，優選還原劑為氰硼氫化鈉。本發明所用的被修飾分子為重組人精氨酸酶I，由322個氨基酸組成，理論分子量34734.94道爾頓，等電點7.09，肽鏈中有3個半胱氨酸，制備得到純度大于95%的重組人精氨酸酶I即可用于修飾反應。Arg的蛋白濃度控制在2-5mg/ml,調節pH值至4-6mg/ml,加入氰硼氫化鈉至終濃度為20mM，PEG的加入量是Arg摩爾數的3_6倍，整個體系在室溫下攪拌反應10-15小時，加入甘氨酸終止反應。PEG修飾后的混合物其分子量差異較明顯，適宜用凝膠層析介質進行分離，選用SephacrylS200層析作為修飾混合物分離的第一歩,用對Arg酶活有利的pH9.8的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液作為平衡與洗脫緩沖液，經此步操作可除去反應混合物中未反應的Arg,使PEG-Arg得以初步純化，純度可達90%左右。此步驟的另ー個作用是對反應混合物中未參與反應的PEG和還原劑進行有效去除。所用PEG是分子量為20KD的中性分子，還原劑為無機小分子物質，它們都不與填料產生吸附作用；而目標修飾物的分子量為55KD，其在S200柱層析的洗脫行為與PEG、還原劑差別較大，可一步達到PEG和還原劑的有效去除。PEG的多修飾物與單修飾物在表面電荷效應上存在一定差異，利用這一點可以將S200樣品中不能被完全分離的PEG多修飾物成分有效去除，達到對樣品的精制。根據Arg在弱堿性條件下較穩定的特點，選擇適用于弱堿條件的DEAE作為結合目的蛋白的固相介質，用pH8.O的PB平衡后，以O.05MNaCl洗脫多修飾組分，O.2MNaCl洗脫目的分子，經此步驟樣品純度可達95%以上。經以上各步獲得符合藥學質量標準的修飾蛋白原液后，即可用于半成品的配制。對于治療用途而言，本發明的目標產物可以配制于無菌的生物相容的藥用載體中使用，我們研制了注射液與凍干粉針兩種劑型。液體劑型組成為(lml/支)PEG-Arg5mg，20mM磷酸鹽緩沖液，0·01%吐溫80，O.IM氯化鈉，ρΗ8·O。凍干劑型組成為(lml/支)PEG-Arg5mg，20mM磷酸鹽緩沖液，O.IM氯化鈉，5%甘露醇，pH8.O。配液之后經冷凍干燥法制成凍干粉針,使用前加注射用水溶解后使用。本發明的目標產物可用于人肝癌和黑色素瘤的治療，給藥頻率為每7天一次。治療中發揮效用的PEG-Arg的用量通過臨床試驗確定，首先應在適用的動物模型中測定療效并確定安全有效劑量，給藥方式為肌肉內注射。圖I尿素循環與相關酶作用節點示意圖部分人肝癌細胞表達尿素循環中的精氨基琥珀酸合成酶(ASS)和精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)，但不表達鳥氨酸轉氨甲酰酶(OTC)。血中PEG-Arg降解精氨酸產生的鳥氨酸再次進入細胞，但由于缺乏鳥氨酸轉氨甲酰酶(OTC)而不能通過尿素循環進行再利用；精氨酸轉亞胺酶(ADI)降解精氨酸產生瓜氨酸，瓜氨酸進入細胞，經精氨基琥珀酸合成酶(ASS)和精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)再轉變成精氨酸被細胞利用，因而產生臨床研究中部分患者對ADI的治療產生抵抗。相比之下，精氨酸酶(Arg)較精氨酸轉亞胺酶(ADI)對人肝癌細胞的治療譜更廣。圖2精氨酸酶對大鼠血中精氨酸的降解作用大鼠腹腔注射(500，I,000,2000,4000IU/只)重組人精氨酸酶(Arg)后，檢測血中精氨酸水平的變化，結果表明Arg只有最高劑量組(4000IU/只)可使血中精氨酸水平在注射后5小時降至20uM，隨后血中精氨酸水平逐漸回升，至注射2天后恢復到正常水平。圖3聚こニ醇精氨酸酶對大鼠血中精氨酸的降解作用大鼠腹腔注射(500，I,000,2000，4000IU/只)聚こニ醇化重組人精氨酸酶(PEG-Arg)后，檢測血中精氨酸水平的變化，結果表明PEG-Arg較低劑量組(1000IU/只)即可使血中精氨酸水平降至檢測不到的水平并可持續6天。與圖2結果相比，說明重組人精氨酸酶經過聚こニ醇修飾達到了增強體內藥效、延長體內半衰期的目的。實施例根據本發明，PEG-Arg的制備與其活性驗證顯示在下文中，實施例更為詳盡地描述了本發明，但并不限制本發明，實施例中的Arg均為大腸桿菌表達的重組人精氨酸酶I。實施例I.重組人精氨酸酶I的制備PCR擴增人I型精氨酸酶基因(hAI)，插入大腸桿菌表達載體pET30a中，構建重組表達質粒pET30a-hAI，轉化大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)，構建大腸桿菌基因工程菌BL21(DE3)(pET30a-hAI)，IPTG誘導后表達.SDS-PAGE分析表明，誘導后的BL21(DE3)(pET30a-hAI)在約35kD處有明顯的蛋白表達。經過發酵、純化后最終純度為95%以上。詳細步驟參照文獻(MasakiΙΚΕΜ0Τ0,MasayoshiTABATA,ToshioMIYAKE,etal.ExpressionofhumanliverarginaseinEscherichiacoli.Biochem,J.1990,(270):697-703)實施例2.修飾位點在ArgN末端α氨基處的PEG(20KD)-Arg的制備調節Arg的蛋白濃度至4.0mg/ml,調節蛋白溶液的pH值在5.2,加入氰硼氫化鈉使其終濃度為20mM，充分溶解后加入相當于Arg摩爾數4倍量mPEG_ALD(20KD)，室溫下攪拌反應12小吋，加入甘氨酸終止反應。反應中修飾效率用SDS-PAGE法檢測，反應12小時候，SDS-PAGE結果表明70%的Arg被修飾，被修飾的組分中單修飾組分占80-90%，時間進一步延長，修飾率不再提高。反應終止后離心棄沉淀，上清部分直接上Sephacryl-S2citl柱，以50mM甘氨酸-氫氧化鈉(pH9.8)緩沖液加0.15M氯化鈉作為洗脫液，經此步可將未被修飾的Arg分子去除。根據電泳純度情況合并經Sephacryl-S2tltl柱后的分部收集樣，以50mM甘氨酸-氫氧化鈉(PH9.8)緩沖液經S印hadexG25脫鹽后，再上已用pH8.O的PB平衡過的DEAESepharoseFF柱，以0.05MNaCl洗脫多修飾組分，0.2MNaCl洗脫目的分子，經此步驟樣品純度可達95%以上。實施例3.PEG-Arg注射液的制備經由實施例I獲得的PEG-Arg原液用Lowry法測定蛋白濃度后，將5000mgPEG_Arg加入含有以下物質的液體中磷酸氫ニ鈉6.78g，磷酸ニ氫鈉0.17g，0.Iml吐溫80，氯化鈉5.844g。無菌過濾后分裝入2ml的西林瓶中，姆支灌裝量lml。實施例4.注射用PEG-Arg凍干粉針的制備經由實施例I獲得的PEG-Arg原液用Lowry法測定蛋白濃度后,將5000mgPEG_Arg加入含有以下物質的液體中磷酸氫ニ鈉6.78g，磷酸ニ氫鈉0.17g，氯化鈉5.844g，甘露醇50g。無菌過濾后分裝入2ml的西林瓶中，經冷凍干燥后即得。實施例5.PEG-Arg對體外培養的腫瘤細胞的抑制試驗選用小鼠肝癌細胞MH134、小鼠纖維瘤細胞MethA、人肝癌細胞7402、7721、H印G2，人黑色素瘤細胞SK-MEL-28進行體外細胞生長抑制試驗。細胞濃度為I.OXIO4/孔，培養基為含10%胎牛血清的RPM1640培養基，分試驗組和對照組，試驗組培養板分別加入終濃度為O.2,0.4,0.6,0.8、I.0,1.2IU/ml的受試樣品(ADI、Arg、PEG_Arg)，于37°C、5%ニ氧化碳條件下孵育3-7天，之后每孔加入O.02mlMTS試劑,再孵育4小時，于490nm檢測光吸收值，殺死50%細胞所需的樣品比活單位被定義為IC5Q。權利要求1.一種聚こニ醇修飾的重組人精氨酸酶I，其主要特征在于每個重組人精氨酸酶I分子與單ー聚こニ醇分子偶聯，并且連接位點是精氨酸酶I分子的N末端α氨基。2.如權利要求I所述的聚こニ醇修飾的重組人精氨酸酶I，其又ー個特征是所述聚こニ醇其一端用單甲氧基封閉，另一端帶有ー個具有反應活性的醛基且分子量為10KD-40KD。3.如權利要求I所述的聚こニ醇修飾的重組人精氨酸酶I，其又ー個特征是所述重組人精氨酸酶I是通過基因重組技術制備的人精氨酸酶I或者具有相同活性的突變體。4.一種制備如權利要求I所述聚こニ醇修飾的重組人精氨酸酶I的方法，其主要步驟是(1)燒基化反應在室溫、ΡΗ4-6、有還原劑存在的條件下，將重組人精氨酸酶I與活化的聚こニ醇醛混合，重組人精氨酸酶I與聚こニ醇的投料比(摩爾比)為I:1-110，聚こニ醇的分子量為10KD-40KD，反應10-15小時，加甘氨酸終止反應(2)反應混合物的分離與純化經凝膠排阻層析去除未修飾的重組人精氨酸酶I分子與未反應的聚こニ醇分子，再經離子交換層析去除多修飾組分后即可獲得聚こニ醇修飾的重組人精氨酸酶I目標產物。5.ー種藥物組合物，其特征在于該組合物以權利要求I所述的分子為主要活性物質。6.權利要求I所述的聚こニ醇修飾的重組人精氨酸酶I和權利要求5所述的藥物組合物在制備用于治療人類肝癌或黑色素瘤的藥物中的應用。全文摘要本發明屬于生物
技術領域：
，提供了一種聚乙二醇修飾的人精氨酸酶I。新制備的人工分子具有體內高比活、延長的半衰期、低免疫原性、結構均一穩定的特點，并且易于進行工藝與質量的控制。發明還提供了目標分子的制備方法。該種聚乙二醇修飾的人精氨酸酶I在人類腫瘤治療領域有較好的應用前景。文檔編號A61K38/50GK102690804SQ20111006755公開日2012年9月26日申請日期2011年3月21日優先權日2011年3月21日發明者吳彥卓,徐川,徐明波,楊仲璠,梁果義,王俊玲,王喜鶴,連治國申請人:北京雙鷺立生醫藥科技有限公司,北京雙鷺藥業股份有限公司