含雙油體蛋白與重組成纖維生長因子9融合蛋白的油體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，具體涉及含雙油體蛋白與重組成纖維生長因子9融 合蛋白的油體。
【背景技術】
[0002] 成纖維細胞生長因子9 (fibroblast growth factor 9, FGF9)是成纖維細胞生長 因子家族（FGFs)的成員之一。廣泛分布于人體各種組織中，它參與骨骼發育、血管形成、 胚胎發育、損傷修復、細胞凋亡、神經再生、腫瘤生長等多種生理和病理的過程，可有效促進 有絲分裂和細胞生長。FGF9最初發現于人類神經膠質瘤細胞系，具有神經膠原激活因子的 活性，基于其活性最初被命名為膠質細胞激活因子（glia-activating factor，GAF)。FGF9 是一種自分泌或旁分泌生長因子，在許多生理過程起著至關重要的作用，包括胚胎發育。人 FGF9基因編碼一個由207個氨基酸組成的蛋白質序列，分子質量約26kDa。FGF9主要分 布于細胞和組織中，包括成骨細胞、軟骨細胞、血管內皮細胞、晶狀體上皮細胞，皮膚、肝、腎 臟、胃、生殖系統、淋巴組織等。研究發現，FGF9具有多種生物學活性，作為胞間信號分子它 參了血管形成、胚胎發育、損傷修復、細胞凋亡、神經再生、腫瘤生長等多項生理和病理的過 程，尤其是在卵巢癌發生、骨骼發育、神經再生、性腺分化等過程中起著重要的作用。因此， 臨床上應用FGF9對診斷卵巢癌、治療軟骨障礙、軟骨發育不全以及性腺分化機理的研究， 越來越受到人們的關注，同時如何進行高純度、高產率的具有生物活性的FGF9的提取一直 是廣大研究者關注的課題。
[0003] 人FGF9定位于第13號染色體短臂上（13qll-ql2)，編碼區含有627個脫氧核苷 酸，共編碼208個氨基酸；在FGF9的3'端非編碼區（3' -UTR)存在一個潛在的多腺苷酸 化位點；FGF9的5'端非編碼區（5' -UTR)和外顯子1具有一個高G/C區域，具有哺乳動 物啟動子的普遍特點。FGF9的空間構象是由C端和N端的2個a螺旋和12個折疊組 成的一個類似金字塔形的結構。在結構上，FGF9和FGF16、FGF20相似，為同一亞家族成員， FGF9與FGF家族FGF1、FGF2具有30%的同源性，并且氨基酸保守區完全相同，具有三葉草 核心結構。FGF9與FGF16、FGF20均沒有經典的信號肽序列，但其能依靠N端的35個氨基 酸作為非剪切信號肽以及位于96~101位的EFISIA基序所具有的疏水性分泌到細胞外。
[0004] FGF9是一種肝素結合生長因子，為單鏈多肽，具有多種生物學活性，其活性依賴于 肝素的存在。FGFR主要有4種（FGFR1~FGFR4)，均為單鏈酪氨酸激酶受體，結構十分相似， 由胞外區、跨膜區、胞內區組成。FGF9主要與FGFR2和FGFR3結合，FGFR的結合需要肝素、 受體和配體間形成三分子復合體。
[0005] FGF9及其受體在骨骼發育過程中起重要作用。在骨骼發育早期，FGF9能促進軟骨 細胞肥大；在骨骼發育后期，其主要調節生長板的血管化和成骨過程。在牙齒發育過程中 FGF9與FGF4在調節牙尖的形成信號中心原發性釉結節中的表達水平上調，繼而在繼發性 釉結節上表達，且FGF9的表達從原發性釉結節擴延到內釉上皮處。在連續不斷切牙的生長 過程中，FGF9表達于牙頸環上皮處。從而認為作為上皮信號分子FGF9在牙齒發育各階段 中間接地誘導牙上皮與間充質之間相互作用，在牙齒形態調節中起作用，甚至其可能參與 到成牙本質細胞分化過程。FGF9廣泛存在于中樞神經及外周神經系統中，對許多腦神經元 有維持生存和促進生長及修復受損神經元并再生的作用，能顯著的延緩神經元死亡 [12]和 保護神經細胞的作用并防止脊根神經節神經的壞死，在小腦顆粒神經元的迀移中也起到關 鍵作用。此外，FGF9還具有促進組織修復、調節視力、調節性腺分化、促進毛發再生、控制盲 腸的形成以及卵巢癌腫瘤發生等多種生物活性。
[0006] FGF9結構和功能特點的多樣性和復雜性，決定了其在許多領域的重要地位以及良 好的應用前景，其適應癥機制的研究主要有以下幾方面： (一）FGF9誘發卵巢癌的機制研究 FGF9具有癌基因活性，研究發現其與肺癌、肝癌、前列腺癌、大腸癌以及子宮內膜癌的 發生發展有著重要的關系。增殖細胞、促進上皮細胞惡性轉化和浸潤內皮細胞都與FGF9的 參與相關，在卵巢癌發生發展過程中起到了關鍵作用。
[0007] (二）FGF9對骨骼發育的作用機制 骨骼發育分為兩種形式：膜內成骨和軟骨內成骨。FGF9具有促進膜內成骨，其主要受 體為FGFR2和FGFR3。FGFR2主要在軟骨膜和骨膜中表達，而FGFR3主要在軟骨生長板內的 軟骨細胞中表達。FGF9通過促進膜內成骨進行骨再生。FGF9與FGFR3的二者共同結合抑 制軟骨內成骨過程，近年來的研究表明它們的結合在長骨發育過程中起到負調節的作用抑 制軟骨內成骨。
[0008] (三）FGF9對性腺分化的調節作用機制 性腺具有發育成睪丸或卵巢的潛在能力。在睪丸分化過程中，Y染色體上的 基因 Sry(sex determining region on Y chromosome, Sry)起著開關作用。基因 Sox9 (SRY-related high mobility group-box gene 9)繼 Sry 在兩性生殖嵴表達后第一 個在Sertoli前體細胞中表達。FGF9在性別決定過程中極為關鍵，參與了性腺細胞增殖、 Sertoli細胞分化和中腎細胞迀移過程并發揮重要作用。
[0009] 油體作為乳化劑。在生產食品、飼料、藥物、個人護理產品和工業產品等中得到廣 泛的應用。比起來自礦物的乳化劑更加環保和可再生。油體蛋白是油體中主要的膜蛋白。油 體蛋白存在2-4個亞型。它們在種子發育過程中可呈現出不同的表型，并且伴隨著種子的 萌發而發生變化。油體蛋白是堿性的疏水蛋白，三個部分組成油體蛋白：親脂的C端和N端 ，和中間疏水區域，它是通過磷脂膜進入到油體內部。N端和C端則鑲嵌在油體表面，暴露在 細胞質中。油體蛋白的結構以及它的特異性，使油體在生物技術中得到廣泛的應用。多油體 蛋白可以增加吸脹后種子的耐凍性及乳化穩定性和油體結構的完整性，2-3個Oleosin分 子連6?卩分子（〇1608；[11-01608；[11-6??，01608；[11-01608；[11-01608；[11-6??)，尤其是6??位 于兩個 oleosin 分子之間（oleosin-GFP-oleosin)優于單油體（single-oleosin)可以 提高GFP的表達量，而且這種結構不會影響植物活力和生理學或油體穩定，有利于植物生 物技術更好的商業化。

【發明內容】

[0010] 本發明的目的是一種表達載體P0BT-0L-0L-FGF9及含雙油體蛋白與成纖維細胞 因子9融合蛋白的油體。
[0011] 一種表達載體P0BT-0L-0L-FGF9,它是由下述方法制備的： 1) 用HindIII和kpnl分別酶切并連接表達載體pOBT和序列表SEQ ID N0. 3所示基因， 得植物特異表達載體P0BT-0L ; 2) 用Ncol與Hindlll分別酶切并連接植物特異表達載體pOBT-OL和序列表SEQ ID NO. 5 所示基因，得表達載體P0BT-0L-0L-FGF9; 一種表達載體P0BT-0L-FGF9,它是插入了上述的步驟1)制備的植物特異表達載體 pOBT插入了 SEQ ID N0. 5所示的基因。
[0012] 含油體蛋白與成纖維細胞因子9融合蛋白的油體，它是將一種表達載體 P0BT-0L-0L-FGF9轉化至油料作物中，收獲種子提取油體。
[0013] 含雙油體蛋白與成纖維細胞因子9融合蛋白的油體，它是由下述方法制備的：將 一種表達載體P0BT-0L-0L-FGF9轉化至油料作物中，收獲種子提取油體。
[0014] 含油體蛋白與成纖維細胞因子9融合蛋白的油體在制備藥品或化妝品方面的應 用。
[0015] 含雙油體蛋白與成纖維細胞因子9融合蛋白的油體在制備藥品或化妝品方面的 應用。
[0016] 本發明提供了含雙油體蛋白與成纖維細胞因子9融