專利名稱：包含粒細胞集落形成刺激因子的穩定的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含粒細胞集落形成刺激因子(G-CSF)的穩定的藥物組合物。
背景技術：
人G-CSF屬于造血生長因子，它在嗜中性粒細胞的形成過程中起著決定性的作用。G-CSF用于醫學的血液學和腫瘤學領域。現在市場上有兩種形式的G-CSF可供臨床使用糖基化的并在哺乳動物細胞尤其是在CHO細胞系中產生的利諾司啶(lenograstim)(Holloway CJ(1994)Eur J Cancer30A Suppl 3S2-S6；EP 169566)和非糖基化的并在大腸桿菌中產生的非格司亭(filgrastim)(EP 237545)。
從文獻中得知，與獲自CHO細胞的糖基化形式的G-CSF相比，非糖基化形式的G-CSF在體外特別不穩定(Oh-eda等人(1990)J Biol Chem265(20)11432-35)。由于糖基化和非糖基化的G-CSF有著不同的穩定性，根據存在/缺乏糖基化，用于制備穩定的可藥用G-CSF的現有方法是不同的。尤其是在非糖基化G-CSF的情況下，非糖基化G-CSF是疏水蛋白質，制備在較長的儲存期中支持藥物蛋白質穩定的可藥用組合物并在醫療上使用是一項艱巨的任務，這代表著特殊的挑戰，并需要特定的經選擇的方法。
非糖基化G-CSF的穩定化組合物在EP 373679中有描述，其特征基本上在于在低的電導率和從2.75至4.0的酸性pH值范圍條件下有利地提供了G-CSF的穩定性。但是，可加入多種糖或糖醇、氨基酸、聚合物和洗滌劑，以獲得更好的G-CSF穩定性。尤其是強調組合物的pH應低于4以減少聚集體的形成并增加G-CSF的穩定性。在EP 373639中描述的包含G-CSF的藥物組合物在pH高于4.0的條件下有聚集體形成和穩定性降低與現有技術文獻中獲得的結果是一致的(Kuzniar等人(2001)Pharm DevTechnol 6(3)441-7；Bartkowski等人(2002)J Protein Chem 21(3)137-43；Narhi等人(1991)J Protein Chem 10(4)359-367；Wang W(1999)Int JPharmaceut 185129-188。
在其它專利和科學文獻中描述了穩定G-CSF的不同方法。EP 1129720公開了非糖基化的牛G-CSF的穩定含水組合物，其具有的pH范圍為5至8并包含含有濃度從約0.01M至約1.0M的硫酸根離子的鹽。
在EP 607156中公開了用于輸注和注射目的的含有G-CSF的藥物組合物。通過設定有利于G-CSF的酸性pH值并加入多種防腐劑、不同的氨基酸和表面活性劑的混合物作為穩定劑以達到G-CSF穩定化的目的。從該說明書中不清楚使用的G-CSF是糖基化還是非糖基化的G-CSF。EP674525公開了在緩沖液中穩定的含水藥物組合物，所述緩沖液選自檸檬酸鹽、馬來酸鹽、磷酸鹽和檸檬酸鹽的組合物和精氨酸。除此之外，加入至少一種表面活性劑以達到G-CSF的穩定。在該說明書中沒有具體說明使用的G-CSF是糖基化還是非糖基化形式。
GB 2193621公開了pH范圍在7至7.5之間的糖基化G-CSF組合物，其包含至少一種選自可藥用表面活性劑、糖類、蛋白質和高分子量化合物的物質。適宜的高分子量化合物包括羥丙基纖維素、羥甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙二醇、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。尤其指出組合物含有表面活性劑是有利的。
在EP 1060746中描述了存在至少一種可藥用表面活性劑的pH約為6.5的包含糖基化G-CSF的藥物組合物。說明書公開了依賴于pH的脫唾液酸化(desialylated)G-CSF穩定性的測定。結果表明pH從約5.0至約7.0時脫唾液酸化G-CSF的穩定性很低。
EP 0988861公開了G-CSF特別是牛G-CSF的藥物組合物，其中通過加入濃度約為1M的穩定緩沖液如HEPES、TRIS或TRICINE而達到G-CSF的穩定性。
EP 0674524描述了通過加入麥芽糖、纖維二糖、龍膽二糖、異麥芽糖、棉子糖、海藻糖或氨基糖而使G-CSF穩定的凍干藥物組合物。
EP 1197221、EP 1260230、EP 1329224中描述了含有pH約6.5的一種或多種氨基酸的糖基化G-CSF組合物，而用氨基酸穩定的凍干組合物則描述在EP 0975335中。在JP2002371009中描述了延長G-CSF藥理作用持續時間的方法，其特征在于G-CSF水溶性溶液中存在表面活性劑。
在EP 0459795中描述的口服劑型G-CSF是基于以表面活性劑、脂肪酸和腸道物質穩定化。WO51629描述了加入蛋氨酸而長時間穩定的組合物。
雖然在G-CSF的藥物組合物中優選低的離子強度，幾乎在每一項專利和科學文獻中都加入多種的非離子型、陰離子型或天然的表面活性劑，以防止在包裝材料表面的G-CSF聚集和變性。但是，從醫學的觀點來看，G-CSF組合物中的表面活性劑應優選避免使用，因為它們可引起局部刺激，它們可能含有需要非常仔細地進行控制的毒性雜質，并且它們如何被代謝或被排泄也并不總是清楚的。除此之外，容易自氧化的某些表面活性劑能損傷蛋白質。
本發明的目的是提供非糖基化G-CSF的穩定的液體藥物組合物，其使得在不加入來自人和/或動物源的表面活性劑和添加劑的條件下G-CSF可作為藥物制劑而正常地使用。特別地，本發明的組合物具有長的貯存期限，生理耐受性良好，易于使用，并可準確地施用。
發明概述本發明的目的是提供非糖基化G-CSF的藥物組合物，其能有利地穩定G-CSF。
本發明提供了根據權利要求1的新的穩定的G-CSF藥物組合物。優選的實施方案在從屬權利要求書中給出。本發明也提供了根據權利要求17的方法，以及根據權利要求18和19的用途。
本發明的藥物組合物優選在pH大于4.0的條件下配制。在存在酸的條件下G-CSF的穩定化得到實現，與此同時本發明的組合物優選不含有G-CSF以外的來自人和/或動物源的表面活性劑和添加劑(如血清蛋白質)。藥物組合物任選地還含有多元醇和/或pH緩沖體系和/或一種或多種可藥用賦形劑。本發明的藥物組合物適宜于作為人用藥或獸用藥使用，在適宜的施用方式下可藥用，特別是腸胃外施用如肌內、皮下和/或靜脈內施用。在特別優選的實施方案中，本發明的藥物組合物以液體形式，更優選以含水的形式存在。
附圖描述

圖1顯示了含有G-CSF的本發明樣品在4℃下儲存3個月后的SE-HPLC分析。
圖2顯示了含有G-CSF的本發明樣品和參比樣品在40℃下儲存1個月后的SE-HPLC分析。
圖3顯示了含有G-CSF的本發明樣品和參比樣品在40℃下儲存1個月后的SE-HPLC分析。
圖4顯示了含有G-CSF的本發明樣品和參比樣品在40℃下儲存1個月后的SDS-PAGE分析。
圖5顯示了含有G-CSF的本發明樣品和參比樣品在40℃下儲存1個月后的SE-HPLC分析。
發明描述和優選的實施方案令人驚奇地發現非糖基化G-CSF可在pH優選大于4.0的不含表面活性劑的藥物組合物中有利地穩定存在。
本發明提供了G-CSF的藥物組合物，其包含(a)治療有效量的G-CSF和(b)酸并且優選地不含表面活性劑。
本發明的組合物優選在pH大于4.0的條件下制備。
本發明也提供了G-CSF的藥物組合物，其除了組分(a)-(b)之外還任選地含有(c)多元醇和/或(d)pH緩沖體系和/或(e)一種或多種可藥用賦形劑。
本文所用的術語“粒細胞集落形成刺激因子”(G-CSF)意指可促進造血前體細胞的分化和增殖并促進造血系統成熟細胞活化的G-CSF，其選自如下所定義的包含人G-CSF和衍生物和類似物的G-CSF。G-CSF優選涉及重組的人G-CSF，它通過在大腸桿菌(E.Coli)中表達而得到。
本文所用的術語“治療有效量的G-CSF”，意指G-CSF的量可產生G-CSF的治療效果。
本文所用的術語“多元醇”，意指任一多羥基醇，即化合物的每個分子含有兩個或多個羥基。
本文所用的術語“表面活性劑”，意指兩親型(表面活性劑)分子的膠體聚集體，它在稱之為臨界膠團濃度的某一濃度處出現。膠團中聚集體分子的典型數量(聚集體數量)為50至100個。
本文所用的術語“不含表面活性劑”，意指表面活性劑在組合物中不存在，或存在的量低于檢測限。
本文所用的術語“G-CSF穩定劑”，意指對G-CSF有穩定作用的可藥用賦形劑。
本文所用的術語“G-CSF穩定性”，意指維持G-CSF的含量和維持G-CSF的生物學活性。G-CSF的穩定性尤其受到下列過程的影響容器壁對G-CSF的吸附、G-CSF的變性或降解、聚集體的形成如G-CSF二聚體和/或G-CSF多聚體和/或具有較高分子量的類似分子。這些過程的出現是由于樣品暴露在不同的條件下，如較高的溫度、不適當的容器、使用了錯誤的G-CSF穩定劑、陽光、不適當的儲存方式、融解/冷凍和/或不適當的分離方法。
本文所用的術語“不含人和/或動物源的添加劑”，意指源于人和/或動物的不同于G-CSF的添加劑，如明膠或血清蛋白質如人血清白蛋白或牛血清白蛋白，不特意地加入到組合物中。
現已令人驚奇地發現，在本發明的藥物組合物中配制的G-CSF可改善其在高于冰箱溫度(如2-8℃)的溫度，在室溫(即低于25℃)，甚至更高的溫度(如約40℃)的穩定性。這意味著本組合物可在高于冰箱溫度的溫度儲存一段較長時間，和/或在較高的溫度下儲存一段時間而不會顯著地降低活性，不會產生顯著的降解。
在現有技術文獻中描述的藥物組合物中，非糖基化的G-CSF優選地在pH低于4.0且在低電導率和在低的酸值下或存在不同的穩定劑的條件下被穩定。在另一方面，所有現有技術在pH值大于4.0的條件下穩定的G-CSF組合物都包含不同的穩定劑，它們之中最優選表面活性劑。除此之外，在現有技術的文獻中，通常不清楚在G-CSF穩定性研究中使用的是糖基化G-CSF還是非糖基化G-CSF。在pH值大于4.0、低電導率、不加表面活性劑的條件下，用現有技術進行的G-CSF穩定性研究導致了聚集體的形成。在現有技術的文獻中，在pH值大于4.0的條件下穩定G-CSF的其他方法包括加入表面活性劑或多種其他的賦形劑。
盡管在現有技術的文獻中已有方法和結果的描述，但在本發明中令人驚奇地顯示G-CSF的穩定性甚至可在pH值大于4.0并且不加入表面活性劑的條件下達到。除此之外，本發明G-CSF的穩定性可用酸作為唯一的賦形劑來達到，該酸提供了適宜于G-CSF穩定存在的環境。雖然沒有局限于這種方式，本發明不需要加入其它的G-CSF穩定劑如可藥用的賦形劑以穩定本發明的G-CSF。這是有好處的，因為藥物組合物中可藥用賦形劑必須嚴格控制以避免有毒雜質的出現。需除去雜質以避免幾乎不可控的物質在人體或動物體中的施用。另一方面，尚不清楚可藥用賦形劑在人體中是如何代謝和排泄的，我們需要將它們考慮在內以避免副作用。
在已知的現有技術的一些藥物組合物中使用了象非離子型洗滌劑這樣的表面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。在G-CSF組合物中使用有自氧化傾向的表面活性劑可被認為是有問題的，優選避免使用，因為它們能形成損傷蛋白質的OH自由基。加入表面活性劑也可造成對施用部位的局部刺激。表面活性劑也可干擾雜質的測定，如通過SEC(分析)法對聚集體的測定。所以，使G-CSF的藥物組合物不含表面活性劑，盡可能地簡單，避免使用其他的賦形劑，并保持組合物的pH值適宜于患者的施用是有好處的。
從經濟的觀點來看，優選地不含表面活性劑的本發明的G-CSF組合物也是較好的。組合物越容易制備，費用也就越低，組合物制備的時間越短，患者機體接受的添加劑也就越少。pH值高于4.0比pH值低于4要好，pH值過低在患者中皮下施用可導致局部的不耐受。
雖然并不局限于這種方式，本發明的組合物可因此優選地僅由上述的組分a-b、或任選地a-c、a-c加e、a-d、a-d加e、a-b加e、或a-b加d-e組成。
本發明的藥物組合物優選地是液體，特別是在長期儲存中維持G-CSF活性的含水藥物組合物。這樣的液體藥物組合物可腸胃外直接使用，如皮下、靜脈內或肌內注射，而不再經過可導致G-CSF生物學活性降低或甚至喪失的重建、稀釋或其他的制備步驟，并也有利于避免在使用過程中出現其他的技術問題。液體藥物組合物因此比凍干的組合物更實用。G-CSF的液體特別是含水藥物組合物在制備臨床G-CSF組合物中通常比凍干的組合物更優選，因為凍干組合物的重建花費時間，存在著蛋白質組合物不當處理的風險，或重建不當，并且某些添加劑如穩定劑常常要求保留藥物的足夠活性。
本發明的藥物組合物優選地基本上不含源于人和/或動物源的添加劑如血清白蛋白或純化的明膠作為G-CSF穩定劑。
本發明藥物組合物中使用的G-CSF可以是任一非糖基化的高純度人G-CSF。具體地說，它可來自于天然或用基因工程方法制備，只要它含有與哺乳動物特別是人G-CSF基本上相同的生物學活性。基因工程的G-CSF可與天然的G-CSF具有相同的氨基酸序列，或可為含有一個或多個氨基酸的缺失、替代或添加的其類似物；用PEG或類似方法進行化學修飾后生物學活性相同或得到提高的G-CSF也包括在內。本發明的藥物組合物中使用的G-CSF可用任何方法制備，它可通過多種技術從細菌細胞如大腸桿菌的培養物、遺傳修飾的酵母或其他適宜的有機體細胞內提取、分離和純化。
本發明藥物組合物中使用的G-CSF最優選通過大腸桿菌的表達而生產，且優選地非糖基化。
本發明的藥物組合物可包含治療有效量的G-CSF。雖然在市場上目前的治療有效量為從0.3至0.96mg/ml，但這并不對本發明的G-CSF組合物構成限制。
本發明G-CSF組合物的pH值高于4.0，優選從約4.0至約5.0，更優選從約4.2至約4.8，最優選的pH值約為4.4。
優選的pH值范圍優選使用醋酸來達到。其他獲得并維持期望的pH大于4.0的適宜酸包括但并不局限于鹽酸、甲磺酸、馬來酸、檸檬酸、谷氨酸、丙二酸、乳酸、硫酸、磷酸和其他可藥用酸或它們的混合物。組合物中酸的濃度取決于組合物期望的pH值。
在另一個實施方案中，通過使用選自包括醋酸、檸檬酸、磷酸和其他適宜酸的不同的酸而達到期望的pH值，最終的pH值通過加入選自包括NaOH、TRIS或任何其他適宜的堿的pH調節劑精細調節而達到。通過加入上述的酸和堿，建立了適宜的pH緩沖系統，如醋酸/醋酸鹽、檸檬酸/檸檬酸鹽、谷氨酸/谷氨酸鹽、磷酸/磷酸鹽或任何其他適宜的pH緩沖體系。在它們當中，最優選的pH緩沖系統為醋酸/醋酸鹽，適宜使用的醋酸濃度為約0.15mM至約15mM，最優選的濃度范圍為從1.5mM至10mM。
本發明的藥物組合物可任選地還包含多元醇，該多元醇選自山梨醇、甘露糖醇、環己六醇和甘油。在它們之中，特別優選山梨醇，適宜使用的濃度為約1％至約10％(m/v)，最優選的濃度為從3％至8％(m/v)。
本發明的藥物組合物可任選地還包含一種或多種的可藥用賦形劑。適宜的可藥用賦形劑可選自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、羥丙基纖維素-β-環糊精、泊洛沙姆(poloxamer)、糖如蔗糖和海藻糖、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙二醇酯和醚、乙二醇和甘油酯和/或多種氨基酸。
本發明的藥物組合物可填充于安瓿、注射器、預填充的注射器、多劑量注射用藥筒和小玻璃瓶內。這些措施使得使用的體積在適宜的范圍之內，每個劑量可為從0.2ml至2ml，但并不局限于此。
本發明的藥物組合物中穩定的生物學活性G-CSF可用于治療疾病，疾病包括中性粒細胞減少癥和中性粒細胞減少癥有關的臨床后遺癥、化療后發熱性粒細胞減少癥減少住院的時間、動員造血祖細胞、作為供體白細胞輸注的備選、慢性中性粒細胞減少癥、中性粒細胞減少和非中性粒細胞減少的感染、移植物接受者、慢性炎癥病癥、敗血癥和敗血癥休克、危險的減少、發病率的降低、死亡率的降低以及中性粒細胞減少和非中性粒細胞減少的感染中住院天數的減少、預防中性粒細胞減少和非中性粒細胞減少的感染患者中的感染和與感染有關的并發癥、預防醫院內感染并降低醫院內感染的死亡率和發病率、減少新生兒的腸內施用、加強新生兒的免疫系統、改善重癥監護病房患者和重危患者的臨床效果、改善創傷/皮膚潰瘍/燒傷的治愈和治療、增強化療和/或放療、全血細胞減少癥的治療效果、增加抗炎癥細胞因子、通過預防性使用非格司亭縮短大劑量化療的間隔、增強光動力療法的抗癌效果、預防和治療由不同的大腦功能異常引起的疾病、治療血栓疾病以及它們的綜合癥、以及放療后紅細胞生成的恢復。
它也可用于治療為G-CSF適應癥的所有其他疾病。
下列的實施例說明本發明，但對本發明不構成限制。
實施例分析方法下列的分析方法用于分析本發明的藥物組合物大小排阻HPLC(SE-HPLC)、反相HPLC(RP-HPLC)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、用紫外檢測確定熔點溫度(Tm)、等電聚焦法(IEF)和體外生物學活性測定法。
SE-HPLCSE-HPLC用于確定G-CSF聚集體的濃度、特別是二聚體和更大的聚集體。二聚體和更大的聚集體的檢測限為0.01％。
高效液相色譜(HPLC)系統如下紫外檢測器、在線脫氣機、二元泵模塊和恒溫自動進樣器(如Waters Alliance HPLC systems)。在下列的條件下進行分析色譜條件色譜柱TSK G3000 SW，10μm，300×7.5mm ID柱溫30℃流動相磷酸鹽緩沖液pH值7.0(5mM磷酸鈉，50mM NaCl)流速0.8ml/分鐘，等度模式檢測紫外檢測器，波長215nm注射體積20μl(蛋白質的注射量為6-12μg)自動進樣器溫度+2至+8℃運行時間20分鐘RP-HPLCRP-HPLC用于確定G-CSF含量，并根據它們的疏水性對分離的雜質進行定量。
使用的HPLC系統如下紫外檢測器、在線脫氣機、二元泵模塊、恒溫自動進樣器和恒溫的柱箱(如Waters Alliance HPLC systems)。分析在下列的條件下進行色譜條件柱YMC-Pack ODS-AQ，200，球形，3μm，150×4.6mm i.d.
柱溫65℃流動相A相在水中0.1％的三氟醋酸(TFA)和50％的乙睛(ACN)B相0.1％TFA和95％ACN在HPLC用水中的溶液流速1.0mL/分鐘，根據下表用梯度方式進行
檢測紫外檢測器，波長215nm注射體積10μl(蛋白質的注射量為3-6μg)自動進樣器溫度+2至+8℃運行時間25分鐘用紫外檢測確定TmTm用于估計蛋白構象穩定性。高的Tm表示在某一組合物中有較高的蛋白質穩定性。G-CSF的穩定性通常可通過加入某些賦形劑而得到改善。
帶有Peltier冷卻加熱系統(DBS，PTP-1)的紫外分光光度計使用Perkin Elmer Lambda BIO 40分光光度計，在下列的條件下進行分析溫度范圍50-70℃升溫速率1℃/分鐘檢測波長280nm進樣體積1.0ml(蛋白質的濃度0.3-0.6mg/ml)自動進樣器溫度+2至+8℃SDS-PAGESDS-PAGE用于視覺上檢測蛋白質二聚體和其他聚集形式(三聚體和更大的分子形式)的存在。
上樣樣品在不含還原劑的上樣緩沖液中制備。使用垂直SDS-PAGE凝膠NuPAGE Bis-TRIS 12％，8×8cm，厚度1.0mm，15泳道(Invitrogen)，在MOPS SDS電泳緩沖液(Invitrogen)中。在200V的恒定電壓下電泳。樣品通過考馬斯藍染色而分析(0.1％ Phast Gel Blue R350在30％的甲醇中)。
體外G-CSF的生物學活性測定
G-CSF生物學活性通過基于刺激細胞增殖(NFS-60細胞)的方法測定，使用已知的方法(Hammerling U等人(1995)J Pharm Biomed Anal 139-20)并使用人重組G-CSF國際標準品(88/502，來自酵母細胞；NIBSCPotters Bar，Hertfordshire，UK)；(Mire-Sluis AR 等人(1995)J ImmunolMethods 179，117-126)。
pH值的測定用MA 5741(Iskra)pH計和Biotrode(Hamilton)電極測定pH值。用適宜的新配制校準緩沖液將pH計在pH值從3.0至5.0的范圍內校準。pH值在25℃測量。pH測量值的標準差為0.003個pH值(0.3％)。
測定在藥物組合物中的G-CSF穩定性的條件4℃在冰箱溫度下(范圍為+4℃至+6℃)儲存在冰箱中40℃儲存在40℃±2℃25℃在25℃至30℃的室溫下儲存于1ml的預填充的注射器中，在Vibromix 314EVT振蕩器中以75轉/分鐘的速度振搖。
實施例1穩定性試驗制備下列的G-CSF藥物組合物S181.5mg/ml的G-CSF，用醋酸將pH值調節至4.4B1a(0.3)0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液將pH調節至4.2B1b(0.3)0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液將pH調節至4.4B1c(0.3)0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液將pH調節至4.6B1d(0.3)0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液將pH調節至4.8B1e(0.3)0.3mg/ml G-CSF，0.13mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，pH4.4B-1e-3(0.3)0.3mg/ml G-CSF，0.13mM檸檬酸，5％(w/v)山梨醇，pH 4.4B-1e-4(0.3)0.3mg/ml G-CSF，0.13mM馬來酸，5％(w/v)山梨醇，pH 4.4B1f(0.3)0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，用TRIS將pH調節至4.4B-1b(0.6)0.6mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，8％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液將pH調節至4.4B-1e(0.6)0.6mg/ml G-CSF，0.13mM醋酸，8％(w/v)山梨醇，pH4.4B-1e-2(0.6)0.6mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，8％(w/v)山梨醇，0.004％吐溫80，用稀NaOH溶液將pH調節至4.4B-1e-3(0.6)0.6mg/ml G-CSF，0.13mM檸檬酸，8％(w/v)山梨醇，pH 4.4B-1e-4(0.6)0.6mg/ml G-CSF，0.13mM馬來酸，8％(w/v)山梨醇，pH 4.4B-1g(0.6)0.6mg/ml G-CSF，0.04mM HCl，8％(w/v)山梨醇，pH 4.4B2a(0.3)0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，3％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液將pH調節至4.2B2b(0.3)0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，3％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液將pH調節至4.4B-3b(0.3)0.3mg/ml G-CSF，0.04mM甲磺酸，5％(w/v)山梨醇，pH 4.4B-4a(0.3)0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)甘油，pH 4.4B-4c(0.3)0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)甘油，0.1％泊洛沙姆188，pH 4.4B-5a(0.6)0.6mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，8％(w/v)山梨醇，0.1％吐溫20，用稀NaOH溶液將pH調節至4.4
B-6a(0.3)0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，0.05％泊洛沙姆188，pH 4.4B-6b(0.3)0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，0.1％泊洛沙姆188，pH 4.4B-6d(0.3)0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，1.0％泊洛沙姆188，pH 4.4D2a(0.3)0.3mg/ml G-CSF，0.04mM甲磺酸，5％(w/v)山梨醇，0.1％泊洛沙姆188，pH 4.4D2b(0.3)0.3mg/ml G-CSF，10mM甲磺酸，5％(w/v)山梨醇，0.1％泊洛沙姆188，用稀NaOH溶液將pH調節至4.4S121.0mg/ml G-CSF，10mM醋酸，5％(m/v)山梨醇，用NaOH將pH調節至4.0■參比組合物A(S16-10ACT)0.3mg/ml G-CSF，10mM醋酸，5％(m/v)山梨醇，0.004％吐溫80，用NaOH將pH調節至4.0(象Neupogen一樣)B(S16-10ACT)0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(m/v)山梨醇，0.004％吐溫80，用HCl將pH調節至3.8NNeupogen組合物，可在市場上買到(G-CSF的濃度為0.6mg/ml)樣品S18中G-CSF的含量為1.5mg/ml，在4℃儲存3個月。樣品用SE-HPLC分析；12μg的G-CSF上樣于色譜柱中。圖1顯示了結果(AU＝吸收單位)。
G-CSF的含量分別為0.3mg/ml的樣品在40℃儲存1個月。樣品用SE-HPLC分析；6μg的G-CSF上樣于色譜柱中。圖2顯示了選擇的結果(AU＝吸收單位)。
圖2的說明H+B-1e(0.3)
Na+B-1b(0.3)TRIS+B-1f(0.3)圖3顯示了G-CSF含量分別為0.6mg/ml的一些樣品在40℃儲存1個月的SE-HPLC結果，12μg的G-CSF上樣于色譜柱中(AU＝吸收單位)圖3的說明H+B-1e(0.6)較大的聚集體Na+B-1b(0.6)較大的聚集體吐溫80B-1e-2(0.6)較大的聚集體吐溫20B-5a(0.6)較大的聚集體A 較大的聚集體B 包含吐溫20的安慰劑的反應C 二聚體D G-CSF單體E 包含吐溫20的安慰劑的反應圖4顯示了G-CSF含量分別為0.6mg/ml的本發明樣品和參比樣品在40℃儲存1個月的SDS-PAGE分析的結果。用作參比對照的N(0.3mg/ml)在相同的條件下儲存。每一條泳道上樣1μl。
圖4的說明泳道1低分子量蛋白質標準品(0.79μg)泳道2N(1μg)泳道3B-1e(0.6)泳道4B-1b(0.6)泳道5B-1e-2(0.6)泳道6B-5a(0.6)圖5顯示了G-CSF含量分別為0.3mg/ml的一些樣品在40℃(±2℃)儲存1個月(40)的SE-HPLC結果，12μg的G-CSF上樣于色譜柱中。
圖5的說明H+B-1e(0.3)的較大聚集體Na+B-1b(0.3)的較大聚集體泊洛沙姆B-6b(0.3)的較大聚集體穩定性試驗的結果在4℃儲存2個月和3個月的S18樣品的SE-HPLC分析結果表明二聚體和更大的聚集體或者沒有檢測到，或者只檢測到少量(表1，圖1)。
這些結果相當于G-CSF組合物(AS16-10ACT)中G-CSF的穩定性，其中所述G-CSF組合物(AS16-10ACT)與市售的G-CSF組合物(Neupogen(G-CSF＝0.3mg/ml)，非糖基化的G-CSF)相同(表1)。
樣品S18的Tm與AS16-10ACT的Tm相當，表明S18中G-CSF的穩定性可預期與AS16-10ACT中G-CSF穩定性相當。這一點通過在4℃的穩定性研究得到確認(表1)。
此外，G-CSF穩定性也得到了SDS-PAGE分析的確認(沒有提供結果)。除此之外，在儲存時間之后RP-HPLC分析沒有顯示雜質或蛋白質含量有顯著的改變(沒有提供結果)。用于本發明組合物的G-CSF的體外生物學活性與國際標準品(Cat.N0.88/502；NIBSC，UK)處于相同的水平上。在組合物S18中儲存數月后，G-CSF的生物學活性沒有改變。
表1
m月；％二聚體/較大的聚集體占G-CSF總量的百分數，c＝G-CSF的濃度，*Tm為當G-CSF濃度＝0.3mg/ml時測得的值這些結果表明在適當的條件下(長期穩定性研究的開始部分)，儲存數月之后樣品S18的全部G-CSF穩定性都達到。S18中G-CSF的穩定性優于或相當于樣品AS16-10ACT，雖然S18中沒有加入其他的G-CSF穩定劑(如表面活性劑)，G-CSF的濃度高出5倍，儲存時間較長且pH值遠高于4.0(4.4)。
在一系列具有1.5mM醋酸并用不同的堿(NaOH、TRIS)將pH值調至4.4，以及僅用醋酸將pH值調至4.4的組合物中測試不同的緩沖系統的影響。分析的結果列于表2和圖2中。
表2
m月；w周；％二聚體/較大的聚集體占G-CSF總量的百分數結果表明當使用不同的陽離子時Tm和較大的聚集體的含量存在著差別。含有純酸的組合物的Tm高于含有Na+和TRIS+陽離子的組合物。與此相一致，與含有Na+和TRIS+陽離子的組合物相比，含有純酸的組合物中聚集體的含量最低。除此之外，RP-HPLC分析的結果顯示在儲存一段時間之后雜質的量和特性沒有產生顯著的變化(結果沒有提供)。這些結果表明在G-CSF的穩定性方面，與TRIS+和Na+相比優選使用純酸(H+)。
在一系列包含1.5mM醋酸/醋酸鹽緩沖系統、pH值為4.2、4.4、4.6和4.8的組合物中試驗pH值對G-CSF穩定性的影響。SE-HPLC分析的結果列于表3。
表3
m月；w周；％二聚體/較大的聚集體占G-CSF總量的百分數在pH值范圍為4.2至4.8時，在40℃檢測，二聚體的出現基本上不存在差別。
用含有0.6mg/ml G-CSF的組合物試驗了脫氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(表面活性劑)對G-CSF穩定性的影響。結果列于表4以及圖3和4。
表4
m月；w周；％二聚體/較大的聚集體占G-CSF總量的百分數表4的結果顯示，通過加入表面活性劑吐溫20(Tween 20)或吐溫80(Tween 80)，G-CSF的穩定性沒有得到改善。結果表明在沒有加入表面活性劑的條件下達到了G-CSF的穩定性。除此之外，蛋白質含量的RP-HPLC分析顯示含有脫氧乙烯山梨醇脂肪酸酯的聚合物中蛋白質含量較低。
用含有0.3mg/ml G-CSF的組合物試驗了泊洛沙姆(嵌段共聚物)對G-CSF穩定性的影響。結果列于表5和6以及圖5。
表5
m月；w周；％泊洛沙姆w/v表5的結果表明加入泊洛沙姆188后Tm降低了。
表6
m月；w周；％二聚體/較大的聚集體占G-CSF總量的百分數，％泊洛沙姆w/v
表6的結果顯示加入嵌段共聚物泊洛沙姆188后G-CSF的穩定性沒有得到改善。
表4、5和6的結果表明，在維持G-CSF在G-CSF藥物組合物中的穩定性方面、脫氧乙烯山梨醇脂肪酸酯和泊洛沙姆并不是適宜的賦形劑。
用一系列含有醋酸、馬來酸、檸檬酸和甲磺酸的組合物試驗了不同的酸對G-CSF穩定性的影響。結果列于表7中。
表7
m月；w周；％二聚體/較大的聚集體占G-CSF總量的百分數使用不同的酸的組合物的結果相當，含醋酸的組合物G-CSF穩定性稍微好一些。
用一系列含有山梨醇和甘油的組合物試驗選擇的多元醇和其濃度對G-CSF穩定性的影響。結果列于表8。
表8
m月；w周；％二聚體/較大的聚集體占G-CSF總量的百分數，％多醇w/v表8的結果顯示山梨醇或甘油對G-CSF的穩定性都是有效的。RP-HPLC分析的結果表明表8的組合物之間不存在顯著的差別(結果沒有提供)。
實施例2含有G-CSF的本發明藥物組合物的組合物本發明的藥物組合物的組合物展示在表9中。
表9
體積濃縮物(bulk concentration)的制備用于制備G-CSF體積濃縮物的G-CSF起始原料通過在大腸桿菌的表達而生產(非糖基化的G-CSF)。
G-CSF體積濃縮物在純酸(醋酸或鹽酸)、pH值為4.4的溶液中制備，G-CSF的濃度為1.5mg/ml。體積濃縮物的SE-HPLC分析表明二聚體和較大的聚集體低于檢測限。在RP-HPLC分析中觀察到的雜質含量在2-4％之間。(新配制的Neupogen樣品的分析表明在RP-HPLC分析中觀察到的雜質濃度相當或較高。)賦形劑的質量醋酸符合《歐洲藥典》；HClMerck 32％，分析用；馬來酸符合《美國藥典》；檸檬酸Merck，分析用；甲磺酸Fluka；NaOH符合《歐洲藥典》；山梨醇符合《歐洲藥典》；甘油Merck，分析用；泊洛沙姆188BASF，Pluronic F68，NF級；吐溫20Sigma，低過氧化物，低羰基，含有BHT作為抗氧劑；吐溫80(Sigma，低過氧化物，含有BHT作為抗氧化劑)；注射用水符合《歐洲藥典》；分析用水(水)Milli-Q(Millipore)。
參比藥物組合物的制備A(S16-10ACT)G-CSF的體積濃縮物(1.5mg/ml)用緩沖液稀釋5倍，緩沖液含有用稀NaOH溶液將pH值調節至4.0的12.5mM醋酸、6.25％的山梨醇和0.005％(w/v)的吐溫80。最終組合物的pH值為4.0±0.1。
A(S16-1.5ACT)G-CSF的體積濃縮物(1.5mg/ml)用緩沖液稀釋5倍，緩沖液含有用稀NaOH溶液將pH值調節至4.0的1.875mM醋酸、6.25％(w/v)的山梨醇和0.005％(w/v)的吐溫80。最終組合物的pH值為4.0±0.1。
本發明藥物組合物的制備通常本發明的藥物組合物通過事先用0.2PES/Nalgene濾器過濾過的適宜無菌緩沖液稀釋無菌的G-CSF體積濃縮物而制備。G-CSF的最終濃度分別為0.3mg/ml或0.6mg/ml。
過濾的溶液灌裝入洗滌和滅菌過的2ml小玻璃瓶(小玻璃瓶用水解類型I無色管狀玻璃制造)，用溴丁橡膠的彈性密封蓋蓋住，用鋁帽封口。
S18在最后的純化步驟后，蛋白質溶液用醋酸酸化的水(pH4.4)進行超濾。使用帶有3個Pellicon XL Ultracell-5PLCCC/Millipore濾器的Labscale TFF System/Millipore。G-CSF溶液的超濾用10倍量體積先前通過0.2PES/Nalgene過濾的酸化水進行。測定電導率和pH值。G-CSF的最終濃度為1.5mg/ml。此后蛋白質溶液通過無菌的0.22μm PVDF濾器的無菌過濾。
B-1e(0.3)G-CSF的體積濃縮物用含有0.16mM醋酸、6.25％(w/v)山梨醇的溶液稀釋5倍。在組合物B-1e-4(0.3)、B-1e-3(0.3)、B-3b(0.3)中使用適宜量的其他酸如檸檬酸、馬來酸、甲磺酸，以在類似的組合物中達到pH值4.4，最終組合物的pH值為4.4±0.1。
B-1a(0.3)，B-1b(0.3)，B-1c(0.3)，B-1d(0.3)G-CSF的體積濃縮物用含有用稀NaOH溶液調節pH值至4.2(4.4、4.6、4.8)的1.875mM醋酸和6.25％(w/v)山梨醇的緩沖液稀釋5倍。最終組合物的pH值為4.2±0.1(分別為4.4±0.1；4.6±0.1；4.8±0.1)。
B-1b(0.6)G-CSF的體積濃縮物(1.5mg/ml)用使用稀NaOH溶液將pH值調節至4.4的2.5mM醋酸和13.3％(w/v)山梨醇稀釋2.5倍。最終組合物的pH值為4.4±0.1。
B-1e(0.6)，B-1e-3(0.6)，B-1e-4(0.6)，B-1g(0.6)G-CSF的體積濃縮物(1.5mg/ml)用含0.22mM醋酸、13.3％(w/v)山梨醇的溶液稀釋2.5倍，在其他的情況下使用適宜量的其他酸如檸檬酸、馬來酸，以在類似的組合物中達到pH值4.4，最終組合物的pH值為4.4±0.1。
B-2a(0.3)，B-2b(0.3)G-CSF的體積濃縮物用含有用稀NaOH溶液調節pH值為4.2或4.4的1.875mM醋酸和3.75％(w/v)山梨醇的緩沖液稀釋5倍。最終組合物的pH值分別為4.2±0.1或4.4±0.1。
B-4a(0.3)G-CSF的體積濃縮物用含有用稀NaOH溶液調節pH值為4.4的1.875mM的醋酸和6.25％(w/v)甘油的緩沖液稀釋5倍。最終組合物的pH值為4.4±0.1。
權利要求
1.粒細胞集落形成刺激因子(G-CSF)的穩定的藥物組合物，其中組合物具有大于4.0的pH值且包含治療有效量的G-CSF和酸且不含表面活性劑。
2.權利要求1的組合物，其中組合物的pH值在從4.2至4.8的范圍內。
3.權利要求2的組合物，其中組合物的pH值為約4.4。
4.根據任一上述權利要求的組合物，其任選地還包含a.多元醇和/或b.pH緩沖系統和/或c.一種或多種可藥用賦形劑。
5.根據任一上述權利要求的組合物，其中G-CSF為非糖基化的。
6.根據任一上述權利要求的組合物，其中組合物是含水的。
7.權利要求1的組合物，其中酸選自醋酸、HCl、馬來酸、谷氨酸、甲磺酸和檸檬酸。
8.權利要求7的組合物，其中酸選自醋酸和HCl。
9.權利要求4的組合物，其中多元醇選自山梨醇、甘油、環己六醇和甘露糖醇。
10.權利要求9的組合物，其中所選的多元醇是山梨醇。
11.權利要求10的組合物，其中含有的山梨醇為從約1％至約10％。
12.權利要求10的組合物，其中含有的山梨醇為從約3％至約8％。
13.權利要求1至11中任意一項所述的組合物，其中pH緩沖系統選自醋酸/醋酸鹽和磷酸/磷酸鹽。
14.權利要求13的組合物，其中所選的pH緩沖系統為醋酸/醋酸鹽。
15.權利要求14的組合物，其中所含的醋酸濃度從約0.15mM至約15mM。
16.權利要求15的組合物，其中所含的醋酸濃度從約1.5mM至約10mM。
17.制備含有G-CSF的組合物的方法，其中制備了權利要求1-16中任意一項所述的組合物。
18.權利要求1至17中任意一項所述的組合物的用途，用于制備治療和/或預防需要G-CSF的疾病的藥物。
19.權利要求1至17中任意一項所述的組合物的用途，用于治療和/或預防需要G-CSF的疾病。
全文摘要
本發明提供了粒細胞集落形成刺激因子(G－CSF)的新的穩定的藥物組合物。
文檔編號C07K14/535GK1878570SQ200380110659
公開日2006年12月13日 申請日期2003年11月4日 優先權日2003年11月4日
發明者B·波多布尼克, V·加貝爾茨波爾卡, V·梅納特 申請人:力奇制藥公司