專利名稱：一種粒細胞集落刺激因子與聚乙二醇的共軛物的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物制劑和藥物，S卩，涉及粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的新的生理活性的共軛物(conjugates),尤其涉及G-CSF與聚乙二醇的新的共軛物,其適于醫藥用途，例如，適于治療白細胞減少，主要是接受骨髓抑制劑化療的病人、接受造血干細胞移植的病人、患有慢性中性粒細胞減少癥的病人以及患有AIDS和其它感染的病人中的各種中性粒細胞減少癥。
背景技術：
G-CSF是一種造血生長因子，其刺激粒細胞的增殖、分化和成熟(Metcalf, 1992)。外源G-CSF的介入導致外周血中性粒細胞迅速、特異性、劑量依賴性的增加(Welte等人,1985; Hartung 等人,1995)。在細菌和哺乳動物細胞中 克隆并表達了人G-CSF基因；由此，開發和純化了多種不同的重組人 G-CSF (rhG-CSF)變體(Nagata 等人，1986; Souza 等人，1986; Komatsu 等人，1987)。有兩種rhG-CSF的變體-非格司亭和來諾拉提，分別來自E.coli和CHO細胞。非格司亭由175個氨基酸組成，其是非糖基化的，并且與天然蛋白質的氨基酸序列相同，但在分子的N-末端含有一個額外的甲硫氨酸殘基。來諾拉提由174個氨基酸組成，其是糖基化的，并且其氨基酸序列與天然人G-CSF完全一致。不同的rhG-CSF廣品在糖基化和/或蛋白質序列上有所不同，其可用于臨床上治療化療后的中性粒細胞減少癥，自發性、先天性和周期性的中性粒細胞減少癥；可以與抗生素聯合或在中性白細胞減少的AIDS病人中用于治療嚴重感染(Molineux，2004)。但是，rhG-CSF的臨床應用已被限制，由于其快速被皮下注射位點所吸收，對蛋白水解不穩定，分布容量大，快速消除、并具有很短的血清半衰期(Mashkovsky, 2006;de Wit等人，1996)。因此，rhG-CSF必須通過每日注射的方式施用于病人才能獲得最佳效果。并且要每日監控全外周白細胞計數。可以通過使用具有更長久活性的藥物形式來改進G-CSF的療效，其中天然蛋白分子以化學方法連接到單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。G-CSF的聚乙二醇化改進了藥代動力學特性，增加了半衰期，減少了消除，降低了血液中的濃度波動，降低了免疫原性和毒性，增加了體內活性并增強了穩定性(Molineux, 2003;Molineux, 2004)。PEG-G-CSF共軛物的生物學特性很大程度上取決于分子量和使用的活化的mPEG的種類。活化的PEGs的活性官能團可以被附著于蛋白質的特定位點，主要是在一種胺、巰基或其他親核的基團上。在大多數情況下，優選的修飾位點是賴氨酸的氨基基團和多肽鏈的N-末端(Kinstler等人，1996, Roberts等人，2002)。大范圍的mPEG衍生物已被用于胺的聚乙二醇化，例如:PEG-三嗪、PEG-琥珀酰亞氨基碳酸酯，PEG-琥珀酰亞胺琥珀酸，PEG三氟乙基磺酸酯，PEG-乙醛，PEG-N-羥基琥珀酰亞胺-活性酯，等)。
已有數種已知的PEG-G-CSF共軛物。美國專利US2007/0014762描述了 PEG-G-CSF共軛物的生產，使用不同的具有5000Da分子量的活化mPEG，特別是mPEG-琥珀酰亞胺基丁醇，mPEG-琥珀酰亞胺基丙酸，mPEG-琥珀酰亞胺基a-甲基丁醇。要獲得共軛物，使用了來源于CHO細胞的rhG_CSF，其含有數個不同位點的氨基酸取代。偶聯反應在PH7 9下進行。生成的PEG-G-CSF共軛物由數個位點異構體組成；每個異構體由賴氨酸殘基的ε氨基基團和N-氨基酸的α氨基基團與一個PEG5000在不同的位點偶聯。PEG-G-CSF共軛物在SP-瓊脂糖柱上通過離子交換色譜純化。該專利中沒有關于獲得的共軛物的活性和純度數據。生成的共軛物的缺點如下:1、偶聯到G-CSF的mPEG分子量小；2、形成數種位點異構 體，其中PEG通過不同的賴氨酸殘基和N-末端氨基酸的自由氨基基團被偶聯到G-CSF分子；歐洲專利EP0401384描述了 PEG-G-CSF共軛物，其使用分子量為4，500 10，OOODa的線性和分支結構的mPEG，通過不同的活性基團(琥珀酰亞胺琥珀酸，氯_s_三嗪，聚氧乙烯二氨)激活而得到。這些PEG-G-CSF共軛物在體內有更長時間的效果，延長的程度取決于偶聯的PEG的分子量。具有PEG10000和未改性G-CSF的PEG-G-CSF共軛物的半衰期分別為7.05和1.79小時。產生的共軛物的缺點是:琥珀酰亞胺琥珀酸-PEG通過mPEG與琥珀酸酐反應，隨后將羧酸激活形成琥珀酰亞胺酯而制備。該多聚體的骨架含有第二個酯鏈，其在與一種蛋白質發生偶聯反應后保留。該酯鏈在多聚體被附著于蛋白質后高度易水解。這種水解不但導致PEG附著的減少，而且水解后保留與蛋白質上的琥珀酸酯標簽可作為半抗原起作用，并導致剩余蛋白的免疫原性(Roberts, 2002)。1、氯-S-三嗪mPEG衍生物能夠與賴氨酸和半胱氨酸殘基的官能團發生偶聯，其導致許多異構體的出現，其中有一些的特征是具有不穩定的鍵。并且，由于具有高毒性，目前三嗪mPEG衍生物并未得到應用(Veronese&Pasut, 2005)。歐洲專利EP0335423描述了 G-CSF與具有300 30000Da的分子量的三嗪mPEG的衍生物的共軛物。這些PEG-G-CSF共軛物具有更長時間的活性，其特異活性是未修飾的G-G-CSF 活性的 11% 到 60%。產生的共軛物的缺點是:1、低特異活性；2、使用mPEG-三嗪的衍生物，產生了大量的位點異構體，其中一些的特征是具有不穩定的鍵。并且，由于具有高毒性，目前mPEG-三嗪衍生物并未得到應用(Veronese&Pasut, 2005)。作為本發明的原型，選擇一種描述與美國專利US5，824，784實施例2的PEG-G-CSF共軛物。該專利描述了來源于E.coli的rhG-CSF與具有6，000到25000分子量的線性mPEG的還原燒基化反應，所述mPEG具有活化的丙醒基(ALD-mPEG)。聚乙二醇化反應在pH5下進行。在酸性條件下，乙醛對N-末端α-胺具有很大程度的選擇性，這是由于α-胺與其他親核物質相比具有更低的PK值。乙醛偶聯是通過希夫堿進行原位還原以獲得穩定的仲胺健(Kinstler 等人,1996)。用PEG20kDa對rhG-CSF的N-末端聚乙二醇化的這種制備方法被用于開發聚乙二醇非格司亭("Neulasta")，用于治療和預防不同的中性白細胞減少癥狀。單-mPEG-G-CSF共軛物通過使用SP瓊脂糖凝膠HP柱的離子交換色譜進行分離。產生的純化PEG-G-CSF共軛物的生物活性為天然G-CSF活性的68%。產生的共軛物中未修飾的G-CSF的含量不超過5%。該共軛物的藥代動力學參數比未修飾的G-CSF更好。動物實驗已表明，PEG-G-CSF共軛物的注射導致白細胞計數的增加，該PEG-G-CSF共軛物相對于未修飾的G-CSF延長了有效期。當使用單劑量的G-CSF PEG-共軛物，動物白細胞的含量在注射I天后達到最大值，該水平在當天保持穩定，隨后在注射4天后白細胞的水平降低到基線水平。隨著未修飾G-CSF的注射，在注射I天后可觀察到動物血液中的粒細胞的最高水平，隨后粒細胞含量迅速下降。產生的共軛物的缺點:1、獲得的共軛物的特異活性低(未修飾的G-CSF活性的68%)；2、在共軛物中存在未修飾的G-CSF。

發明內容
本發明的目的是獲得一種新的穩定的高度純化的聚乙二醇化G-CSF共軛物，其具有高活性，更長的有效期，提高的穩定性，改進的藥代動力學參數，具有理想的PEG分子量與特異活性的參數組合，具有高純度且適于醫用，以及基于要求保護的共軛物的適于藥用的組合物。問題的解決是通過創造一種新的PEG-G-CSF的功能性活性分子，其具有G-CSF活性，其中具有30000Da分子量的線性PEG分子與G-CSF嚴格通過N-末端氨基酸(甲硫氨酸，methionine)的α氨基形成穩定的鍵而偶聯,產生具有如下通式(I)的化合物:
權利要求
1.一種人粒細胞集落刺激因子與聚乙二醇的共軛物，其特征在于，具有如下結構式
2.根據權利要求1所述的共軛物，其特征在于:其中聚乙二醇的平均分子量是從30到40kDa。
3.根據權利要求2所述的共軛物，其特征在于:其中聚乙二醇的分子量是30kDa。
4.根據權利要求1所述的共軛物，其特征在于:其中的m是整數4或6。
5.根據權利要求1所述的共軛物，其特征在于:其中的N-末端基團是甲硫氨酸殘基(Met)0
6.一種藥物組合物，其特征在于:具有相應于粒細胞集落刺激因子的活性，含有有效量的權利要求1所述的共軛物和藥學可接受的輔料。
7.權利要求6所述的藥物組合物用于治療中性粒細胞減少癥的藥物用途。
8.根據權利要求6所述的藥物組合物，其特征在于:含有有效量的權利要求1所述的共軛物、吐溫、甘露醇、三水乙酸鈉、醋酸和注射用水。
9.根據權利要求8所述的藥物組合物，其特征在于:其中的pH值是3到5。
10.根據權利要求9所述的藥物組合物，其特征在于:其中的pH值為4。
11.一種藥用試劑，其特征在于:具有相應于粒細胞集落刺激因子的活性，含有權利要求I所述的共軛物。
12.權利要求11所述的藥用試劑用于治療中性粒細胞減少癥的用途。
13.—種權利要求1所述共軛物的用途，其特征在于:用于制備具有相應于粒細胞集落刺激因子活性的藥用試劑。
14.一種權利要求1所述共軛物的用途，其特征在于:施用有效量的共軛物用于預防或治療中性粒細胞減少癥。
15.—種在無菌環境下密封的容器,其特征在于:含有權利要求6-11中任一項所述的液態藥物組成。
16.根據權利要求15所述的容器，其特征在于:所述容器是預載藥的注射器、玻璃瓶或自動注射器。
17.—種試劑盒，其特征在于:包括權利要求15所述的容器和處方信息。
全文摘要
本發明涉及藥物制劑和藥物，即，涉及具有通式(I)的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的新的生理活性的共軛物其中n為681到1000的整數；m為≥4的整數；NαH-G-CSF為具有G-CSF活性的天然或重組多肽。本發明還涉及含有所要求的通式(I)共軛物的藥物，藥物組合物，通式(I)共軛物在以粒細胞集落刺激因子作為活性成分用于預防或/和治療中性粒細胞減少癥的藥物中的應用，含有藥物組合物的容器。
文檔編號C07K14/535GK103140499SQ201180044089
公開日2013年6月5日 申請日期2011年7月19日 優先權日2010年8月13日
發明者大菊阿納·偉尼阿迷諾夫娜·茄爾锘夫斯卡婭, 德迷特例·瓦連吉諾維奇·莫羅佐夫, 列夫·阿列克三渡羅維奇·杰尼瑣夫, 耶列娜·吉爾吉耶夫娜·櫓鄧郭, 耶列娜·列歐尼多夫娜·莫羅唑娃 申請人:Biocad股份有限公司