專利名稱：一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法。本發明在純化工藝中采用了反相填料的精細分離純化步驟。同現有技術相比較，可以大幅度地提高重組人粒細胞刺激因子的純度、比活及穩定性。
背景技術：
重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)是特異作用于粒系祖細胞、促進其向成熟中性粒細胞增殖、分化的造血生長因子。具有以下功能1.促進骨髓移植后中性粒細胞計數增加。 2.癌癥化療引起的中性粒細胞減少。3.骨髓異常增生綜合癥伴發的中性粒細胞減少癥。4.再生障礙性貧血伴發的中性粒細胞減少癥。5.先天性、特發性中性粒細胞減少癥。重組人粒細胞集落刺激因子已經可以通過基因重組生物工程技術進行量產。但其純化工藝經過多年研究始終難以解決其純度問題，且比活下降明顯，如現有技術“粒細胞集落刺激因子(G-CSF)在大腸桿菌中的高效表達及快速純化工藝的建立”中國生物化學與分子生物學報《 1998，Vol. 14描述了以下技術方案稀釋復性蛋白，之后一步S P — S epharoseF F柱層析至均質.純化的G —C S F蛋白比活性達3. 4X 108U/mg，每升表達菌液回收的G —C S F總活性達1.06X10nU/mgU.純化產物的N—端氨基酸序列分析表明，對甲硫氨酸的去除徹底，用于人體時可能具有較小的免疫原性和毒性。重組人粒細胞集落刺激因子的純化《微生物學免疫學進展》1998年02期描述了以下技術方案包涵體變性復性后，r h G — C S F的活性得到恢復。用離子交換和疏水層析純化了 r h G — C S F，比活性達1. 57X 108U/mg，純度大于9 8%。本發明經過對不同純化工藝的研究，篩選出一種純化方法，其技術方案是在純化工藝中采用了反相填料的精細分離純化步驟。包括步驟a、選用工程菌做菌株進行發酵培養；b、對發酵培養所得菌體進行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；c、對精制包涵體進行復性，得到復性產物；d、對復性產物進行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產物；e、對陰離子柱層析產物進行陽離子柱層析，得到陽離子柱層析產物；f、對陽離子柱層析產物進行精細分離，采用反相填料柱層析處理，得到重組人粒細胞集落刺激因子。同現有技術相比較，采用本專利的反相填料精細分離，rhG-CSF電泳純度由90%提高到99 %，HPLC純度由90 %提高到99 %，其比活由O. 8 X 107U/mg提高到3 X 108U/mg。可見，采用本發明的重組人粒細胞集落刺激因子的純化工藝，可以大幅度的提高rhG-CSF的純度、比活，以及穩定性。

發明內容
本發明提供一種rhG-CSF的純化方法，該方法包括以下步驟
a、選用工程菌做菌株進行發酵培養；b、對發酵培養所得菌體進行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；C、對精制包涵體進行復性，得到復性產物；d、對復性產物進行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產物；e、對陰離子柱層析產物進行陽離子柱層析，得到陽離子柱層析產物；f、對陽離子柱層析產物進行精細分離，采用反相填料柱層析處理，得到重組人粒細胞集落刺激因子。
其中步驟a_c屬于現有技術，可以根據現有技術中的方法獲得。本發明所述的步驟d_f屬于純化步驟，屬于本發明的技術方案，其中，優選的技術方案如下陰離子柱層析(XK50/30層析柱，Q sepharose FF填料)使用平衡液(20mmol/L pH8. 2 Tris-HCl緩沖液)，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/min。平衡8_10倍柱床體積。樣品預處理將復性產物用2mol/L pH8. 2 Tris-HCl調其pH值為8. 2，然后超濾濃縮至復性體積的1/10，即為上樣液。上樣上樣時泵流速為8. 0-49. 9ml/min。上樣結束后用平衡液平衡2_4個柱床體積。洗脫使用預洗液(20mmol/L pH7. 8 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液)進行預洗，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/min，洗脫2_4個柱床體積。然后將進液管換至洗脫液(20mmol/L pH7. 8NaH2P04-Na2HP04緩沖液、O.1MNaCL)中，開始目標峰洗脫，收集OD28tl大于O. 3洗脫峰。陽離子柱層析(XK50/30層析柱，CM Sepharose FF填料)平衡使用平衡液(20mmol/L pH4. 5 HAc-NaAc緩沖液)，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/min，平衡8-10倍柱床體積。上樣上樣液為上步得到的OD28tl大于O. 3的洗脫液，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/min,開始上樣。上樣結束后，換至平衡液中，平衡2-4個柱床體積，至記錄筆回至基線。用預洗液(20mmol/L pH4. 5HAc_NaAc緩沖液、O. 15 MNaCL)進行預洗，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/min,至雜質峰洗下為止。換至洗脫液(50mmol/LpH4. 5HAc-NaAc緩沖液、O. 2MNaCL進行洗脫目的峰，收集OD28tl大于O. 3的洗脫峰。反相填料層析采用Pharmacia 公司的預裝型 SOURCE 5RPC 4. 6/150 柱(粒徑 5 μ m，4. 6 X 150mm、柱溫度2-6°C，流速l.Oml/min)。配制洗脫液A為含IOOmmolNaCl溶液IOmmol pH= 8.0Tris-HCl 緩沖液，洗脫液 B 為含 IOOmmolNaCl、50% 乙腈的 IOmmol pH= 8.0 Tris-HCl 緩沖液。先用洗脫液A洗脫；再用梯度20%-80%洗脫液B洗脫，15-35分鐘收集樣品峰。被收集的樣品經低溫蒸發，除去有機物質，然后透析濃縮后保存在2-8°C條件下。rhG-CSF經陽離子交換層析分離純化樣品經SDS-PAGE電泳后，用凝膠成像掃描系統分析，其電泳純度為90 %，HPLC純度為90 %，其比活能達到O. 8 X 107U/mg，在2_8°C條件下放置該樣品3個月其電泳純度和活性均無顯著性變化。放置6個月其純度和比活降低。可確定穩定性可以保證3個月。rhG-CSF經反相填料層析分離純化樣品經取樣檢測，其電泳純度與HPLC純度均大于99%，經測定其比活可達到3.0X108U/mg。該樣品在4°C條件下放置12個月，該樣品電泳純度和活性均無顯著性變化。穩定性可以保證12個月。其他質量控制項目均符合藥典要求。采用本發明的重組人粒細胞集落刺激因子的純化工藝，可以大幅度地提高rhG-CSF的純度、比活、穩定性。本發明的工藝方法是經過篩選獲得的，篩選過程如下層析方式的選擇針對現有技術設計了 5種層析方式，用這5種方式對復性溶液進行純化，然后進行測定，實驗結果如下
權利要求
1.一種rhG-CSF的純化方法，該方法包括以下步驟a、選用工程菌做菌株進行發酵培養；b、對發酵培養所得菌體進行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；C、對精制包涵體進行復性，得到復性產物；d、對復性產物進行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產物；e、對陰離子柱層析產物進行陽離子柱層析，得到陽離子柱層析產物；f、對陽離子柱層析產物進行精細分離，采用反相填料柱層析處理，得到重組人粒細胞集落刺激因子。
2.根據權利要求1的純化方法，其特征在于，所述對復性產物進行陰離子柱層析處理方法如下陰離子柱層析(XK50/30層析柱，Q sepharose FF填料)使用平衡液(20mmol/L pH8. 2 Tris-HCl緩沖液)，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/min，平衡8-10倍柱床體積，樣品預處理將復性產物用2mol/L pH8. 2 Tris-HCl調其pH值為8. 2，然后超濾濃縮至復性體積的1/10，即為上樣液，上樣上樣時泵流速為8. 0-49. 9ml/min，上樣結束后用平衡液平衡2_4個柱床體積，洗脫使用預洗液(20mmol/L pH7. 8 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液)進行預洗，調節泵流速為30.0-49.91111/1^11，洗脫2-4個柱床體積，然后將進液管換至洗脫液(20臟01/1 pH7. 8 NaH2P04-Na2HP04緩沖液、O.1MNaCL)中，開始目標峰洗脫，收集OD28tl大于O. 3洗脫峰。
3.根據權利要求1的純化方法，其特征在于，所述對陰離子柱層析產物進行陽離子柱層析，方法如下陽離子柱層析(XK50/30層析柱，CM Sepharose FF填料)平衡使用平衡液(20mmol/L pH4. 5 HAc-NaAc緩沖液)，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/ min，平衡8_10倍柱床體積，上樣上樣液為上步得到的OD28tl大于O. 3的洗脫液，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/min, 開始上樣，上樣結束后，換至平衡液中，平衡2-4個柱床體積，至記錄筆回至基線，用預洗液 (20mmol/L pH4. 5HAc-NaAc 緩沖液、O. 15 MNaCL)進行預洗，調節泵流速為 30. 0-49. 9ml/ min,至雜質峰洗下為止,換至洗脫液(50mmol/LpH4. 5HAc-NaAc緩沖液、O. 2 MNaCL進行洗脫目的峰，收集OD28tl大于O. 3的洗脫峰。
4.根據權利要求1的純化方法，其特征在于，所述對陽離子柱層析產物進行精細分離， 采用反相填料柱層析處理，方法如下反相填料層析采用 Pharmacia 公司的預裝型 SOURCE 5RPC 4. 6/150 柱(粒徑 5 μ m，4. 6 X 150mm、柱溫度2_6°C,流速1. Oml/min),配制洗脫液A為含 IOOmmolNaCl 溶液 IOmmol pH= 8. O Tris-HCl 緩沖液，洗脫液B為含IOOmmolNaCl、50%乙腈的IOmmol pH= 8.0 Tris-HCl緩沖液，先用洗脫液A洗脫；再用梯度20%-80%洗脫液B洗脫，15-35分鐘收集樣品峰，被收集的樣品經低溫蒸發，除去有機物質，然后透析濃縮后保存在2-8 °C條件下。
全文摘要
本發明涉及一種重組人粒細胞刺激因子的純化方法，該方法包括以下步驟a、選用工程菌做菌株進行發酵培養；b、對發酵培養所得菌體進行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；c、對精制包涵體進行復性，得到復性產物；d、對復性產物進行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產物；e、對陰離子柱層析產物進行陽離子柱層析，得到陽離子柱層析產物；f、對陽離子柱層析產物進行精細分離，采用反相填料柱層析處理，得到重組人粒細胞集落刺激因子。
文檔編號C07K1/18GK103014100SQ20121056982
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月25日 優先權日2012年12月25日
發明者王偉權, 陸剛, 陳玉軍, 龐睿, 李邦東, 牛國玲, 于俊清, 楊鳳鐸, 陶永寶, 趙海丹, 宋成君 申請人:哈藥集團生物工程有限公司