專利名稱：一種聚乙二醇修飾的重組人粒細胞集落刺激因子及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質的聚乙二醇修飾技術，具體地涉及一種聚乙二醇單修飾重
組人粒細胞集落剌激因子及其制備方法和其在醫藥領域中的應用。
背景技術：
粒細胞集落剌激因子(G-CSF)是一種造血生長因子，作用于骨髓中性粒細胞系促 進其增殖分化，并促進中性粒細胞的成熟與釋放，增強成熟中性粒細胞的功能，其早期臨床 適應癥為癌癥化療及骨髓移植后的中性粒細胞減少，以后逐步擴大到各種病因引起的中性 粒細胞減少癥。但G-CSF在人體內循環半衰期只有1. 3-4. 2小時，需每日給藥，而持續給藥 會引發藥疹、發熱、肌痛、骨痛等副作用，導致實際用量遠低于理論需用量，直接影響臨床治 療效果。 針對延長蛋白類藥物半衰期，降低其免疫原性的研究已展開多年，其中的一種方 法是將蛋白藥物與水溶性聚合物共價結合形成偶聯物，使用比較普遍的水溶性聚合物就 是聚乙二醇，因為聚乙二醇具有較優秀的臨床適用性_良好的熱穩定性、抗酶解、增加水溶 性、延長半衰期、降低清除率、減少免疫原性和毒性。 在PEG-G-CSF的現有技術領域中，各種PEG-G-CSF的區別在于聚乙二醇與G-CSF 連接方法和位點的不同，因而偶聯物的連接位點、穩定性及生物活性不同，已報道的連接方 法有PEG活性丙酸酯修飾G-CSF， PEG-丙醛修飾N末端添加了甲硫氨酸的G-CSF突變體 (全長175aa， PEG_Met-G_CSF)。 一些歐洲專利還報道了關于G-CSF的其他修飾方法，如通 過去除未經修飾蛋白分子中一個或多個T細胞表位而達到減低免疫原性的目的等。
本發明的偶聯物是聚乙二醇單修飾N端起始的脯氨酸，其結構與已報道的均不 同，其活性較PEG-丙醛修飾N末端(PEG-Met-G-CSF)的更高，產物結構均一。該發明構思 的理論基礎是人類體內天然的G-CSF的N端可以含有蘇氨酸或者不帶蘇氨酸，后者豐度約 為30%。體內天然存在的分子形式是作為治療性藥物的最佳選擇。而目前文獻報道的研究 中，還沒有將天然分子形式進行聚乙二醇修飾的研究。在天然分子N末端的脯氨酸上進行 修飾存在一定的技術難度，目前還沒有相關研究報道。已經在美國上市的藥物Neulasta是 在天然分子N末端添加一個甲硫氨酸作為修飾點來實現長效化的，這種分子突變可以誘發 人體產生抗藥抗體，影響治療效果。 為了實現在天然分子的第一個脯氨酸上進行修飾，我們進行一些嘗試，并得到了 令人滿意的修飾效果。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種新的聚乙二醇單修飾G-CSF偶聯物，其活性更高且 結構更均一。本發明的另一 目的是提供一種聚乙二醇單修飾G-CSF偶聯物的制備方法。
本發明所述一種聚乙二醇修飾G-CSF偶聯物中的G-CSF是人體內天然存在的 G-CSF活性的肽段(173aa)。修飾反應所用聚乙二醇其聚合鏈長度范圍是5KDa至100KDa，優選10KDa至50KDa，更優選20KDa，所用活化的聚乙二醇為甲氧基聚乙二醇醛。采用20KDa 聚乙二醇丙醛單修飾以脯氨酸起始的G-CSF的N端，與修飾N端甲硫氨酸的產物比較其比 活更高，產物均一性更好。 本發明所述偶聯物是由G-CSF與聚乙二醇通過共價結合而成，通用的反應條件 為pH5-10，溫度4-25°C，反應時間為30分鐘-24小時，反應物摩爾比例(PEG : G-CSF =
i : i至ioo : i)。 一般情況下低溫、低pH值、短反應時間更利于生成單修飾產物，本發
明所述一種聚乙二醇修飾G-CSF偶聯物的制備方法，其特征在于控制反應體系pH值、反應 溫度、聚乙二醇與G-CSF投料比及催化劑氰硼氫化鈉的濃度。優選條件為G-CSF原液濃度 為2-5mg/ml， pH為4. 0-5. 0，加入氰硼氫化鈉的終濃度為20mM，加入活化聚乙二醇的量為 G-CSF的3-5倍，反應時間優選1-2小時，加入相當于兩倍活化聚乙二醇量的甘氨酸終止反應。 為保證修飾效率，多數文獻報道中的聚乙二醇與蛋白分子的投料比高達i : 50， 但io以上的投料比會使產物組分更復雜-單、雙、多修飾偶聯物并存。 一般來說，如果反應
液PH低于pK，修飾劑比例應大大超過蛋白分子，如果pH高于pK，則修飾劑與蛋白分子的比 例不必相差太大，反應體系pH的不同會導致修飾劑與蛋白分子的結合位點的差異，反應程 度隨時間的延長而增加，并與反應溫度有關。我們通過控制反應體系的pH、修飾劑與G-CSF 的投料比及反應溫度等因素，控制活化聚乙二醇與N端起始脯氨酸的氨基共價結合，在保 證一定修飾效率的前提下，所用活化聚乙二醇的量大大減少。 PEG修飾后的混合物，其分子量差異較明顯，適宜選用凝膠層析介質進行分離。早 期的凝膠排阻填料如交聯葡聚糖、聚丙烯酰胺生物凝膠等，化學惰性較好且有不同大小孔 徑的填料，以適應不同分子量的蛋白質的分級分離，但這些凝膠的機械強度差，很難用于大 規模條件下的分離。近十幾年來，幾種機械強度較好的凝膠已商品化，包括S印harcryl、 Superdex等。初步分離實驗在5. 6cmX 100cm的S印hacryl S-200層析柱上進行，平衡緩沖 液選用rhG-CSF偏愛的弱酸性溶液即NaNC-HAC(pH4. 0)，由于S印hacryl S-200層析柱呈 弱堿性，偏堿性時易吸附蛋白，加入O. 1M NaCl以增加離子強度，減少蛋白的非特異性吸附。 經此步操作可除去反應混合物中分子量大于目的蛋白的大部分分子及未反應的rhG-CSF， 使PEG-rhG-CSF得以初步純化，純度可達90%左右。 此步驟的另一個作用，就是對反應混合物中的未參與反應的PEG和還原劑進行有 效分離。所用PEG分子量為20KD的中性分子，還原劑為無機小分子物質，它們都不與填料產 生吸附作用；而目的蛋白質修飾物的分子量為39KD，其在S-200柱層析的洗脫行為與PEG、 還原劑差別較大，可一步達到PEG和還原劑的有效去除。 PEG的多修飾物與單修飾物在表面電荷效應上存在一定差異，利用這一點可以 將S-200樣品中不能被完全分離的PEG多修飾物成分有效去除，達到對樣品的精制。根 據rhG-CSF在弱酸條件下較穩定的特點，純化PEG-rhG-CSF分子時，我們選擇適用于弱 酸條件的CM-S印harose Fast Flow作為結合目的蛋白的固相介質；DEAE柱的作用是結 合樣品中的內毒素，將蛋白溶液上柱后，目的蛋白穿過DEAE柱后掛在CM柱上，用pH4.0、 20mMNaCN-HAC平衡后，以0. 03MNaCl洗脫雜蛋白，0. 3M NaCl洗脫目的蛋白，經此步驟 樣品純度可達95%以上。如果經S-200步驟仍存在少量殘留PEG及還原劑組分，經 DEAE-CMS印harose FF層析進行進一步去除，可使其組分降到最低。
基于PEG-rhG-CSF的給藥方式及注射劑量大等特點，對PEG_rhG_CSF原液的內毒
素要求更為嚴格。為保證內毒素符合標準，配液用水為符合藥典要求的注射用水，部分試劑
及所用玻璃器皿，預先18(TC干烤2hrs。離子交換層析流速快，載量高，只需增大柱管尺寸，
加大層析介質體積，便可過渡到大生產規模。 上述原液加入可以接受的藥用輔料，制備成制劑。 實施例1聚乙二醇修飾粒細胞集落剌激因子的制備 取粒細胞集落剌激因子原液100ml (緩沖體系為pH4. 0、50mM醋酸鹽緩沖液，蛋白 濃度為5mg/ml)。稱取O. 126g氰硼氫化鈉，加入粒細胞集落剌激因子原液中，攪拌使之迅速 溶解。稱取2g活化的聚乙二醇(20KDa)，攪拌使之迅速溶解，室溫下攪拌1. 5小時。加入 4g甘氨酸終止反應。 將反應混合物上S-200柱，平衡緩沖液選用NaNC-HAC (pH4. 0)，加入0. lMNaCl以增 加離子強度。上樣量為2-5%柱體積，流速為30ml/min時，既可獲得較好的分離效果，又節 省了操作時間。為確定在獲得滿意分離效果前提下的最大進樣量，進一步的實驗結果表明， 上樣量為4-5%柱體積時同樣能達到較好分離效果。 離子交換。上述分子篩目的峰上DEAE，目的蛋白穿過DEAE柱后直接上CM柱，用 pH4. 0、20mMNaCN-HAC平衡后，以0. 03MNaCl洗脫雜蛋白，O. 3M NaCl洗脫目的蛋白，經此步 驟樣品純度可達95%以上。 實施例2聚乙二醇修飾粒細胞集落剌激因子的活性測定 PEG-G-CSF生物學活性測定采用MTT比色法。實施例1樣品測得的比活性為 8X107IU/mg。具體方法如下
試劑 RPMI1640培養液每升添加2. 0g碳酸氫鈉、2. 383gHEPES，0. 2923L-谷氨酰胺，經 0. 22 ii m濾膜過濾除菌。fC保存。 基礎培養液取100ml胎牛血清(FBS)，加入900ml RPMI1640培養液中。4。C保存。
完全培養液基礎培養液加重組人粒細胞集落剌激因子至終濃度為20ng/ml或 3000IU/ml。 磷酸鹽緩沖液(PBS):稱取8g氯化鈉、0. 2g氯化鉀、1. 44g磷酸氫二鈉、0. 24g磷酸 二氫鉀，加水使溶解成1000ml，經121°C、15分鐘高壓滅菌。 噻唑藍(MTT)溶液取MTT粉末0. 25g，加入50ml PBS中，配制成5. Omg/ml的溶 液，經0. 22 ii m濾膜過濾除菌。4t:避光保存。 裂解液吸取鹽酸14ml， Triton X-lOO溶液50ml，加異丙醇配制成500ml的溶液。
標準品溶液的配制取1支重組人粒細胞集落剌激因子效價測定標準品按說明書 溶解后，用基礎培養液稀釋至50 100IU/ml。在96孔細胞培養板中，繼續以2倍稀釋度做 稀釋度稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做兩個孔。以上操作在無菌條件下進行。
供試品溶液的配制將供試品按標示量溶解后，用基礎培養液稀釋成約50 100IU/ml。在96孔細胞培養板中，繼續以2倍稀釋度做稀釋度稀釋，共8個稀釋度，每個稀 釋度做兩個孔。以上操作在無菌條件下進行。
測定法(a e步驟在無菌條件下進行) aNFS-60細胞株用完全培養液于37°C，5% C02培養，控制細胞濃度為1. 0X105 4. OX 107ml，傳代后24 36小時用于效價測定。
b將試驗所用溶液預溫至37 °C 。 c取足量NFS-60細胞培養物，離心收集NFS-60細胞，用基礎培養液洗滌3次，然后 重懸于基礎培養液配成2. OX 105/ml的細胞懸液，置37t:備用。 d在加有標準品溶液和供試品溶液的96孔細胞培養板中每孔加入50 1細胞懸 液，37。C，5X 0)2培養40 48小時。 e每孔加入20ii1 MTT溶液，37°C ， 5% C02培養5小時。 f每孔加入200 ill裂解液，混勻后在酶標儀上比色，測定波長540nm，參比波長
630nm，記錄測定結果。 結果計算 試驗數據采用計算機程序或直線回歸計算法進行處理。并按下式計算結果
<formula>formula see original document page 6</formula> 式中Pr為標準品效價，IU/ml，
Ds為供試品預稀釋倍數；
Dr為標準品預稀釋倍數；
Es為供試品半效稀釋倍數；
Er為標準品半效稀釋倍數。
權利要求
一種聚乙二醇修飾的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)偶聯物。
2. 權利要求1所述偶聯物，其中所述G-CSF是N端缺失蘇氨酸的人粒細胞集落剌激因 子，全長173個氨基酸。
3. 權利要求1所述偶聯物，其中所述聚乙二醇的分子量為5KDa到100KDa。
4. 權利要求3中所述聚乙二醇的分子量為10KDa到50KDa。
5. 權利要求3至4中所述聚乙二醇是甲氧基聚乙二醇醛。
6. 權利要求5中所述聚乙二醇是分子量為20KDa的甲氧基聚乙二醇醛。
7. —種制備聚乙二醇-粒細胞集落剌激因子偶聯物的制備方法。其特征在于(1) 調整G-CSF原液濃度和pH值，加入氰硼氫化鈉和活化的聚乙二醇，于4t:反應，加 入甘氨酸終止反應。(2) 采用離子交換和分子篩層析對反應混合物予以分離純化。
8. 如權利要求l-7所述聚乙二醇-粒細胞集落剌激因子偶聯物在制備用于提升白細胞 的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種聚乙二醇修飾重組人粒細胞集落刺激因子偶聯物及其制備方法，具體地涉及一種聚乙二醇定點修飾重組人粒細胞集落刺激因子N端脯氨酸的偶聯物，此物質是該技術領域中所沒有的，與國外已上市同類產品相比，該物質具有更低的免疫原性，更少的活性損失和更高的制備收率。
文檔編號A61K47/48GK101711876SQ200810223549
公開日2010年5月26日 申請日期2008年10月8日 優先權日2008年10月8日
發明者劉迎, 吳彥卓, 徐明波, 楊仲凡, 梁果義, 王俊玲, 許可, 連治國 申請人:北京雙鷺藥業股份有限公司